Microbiologia

Storia della microbiologia

L'uso del microscopio ha consentito l'identificazione di numerosi esseri viventi che non rientrano nei tradizionali regni di piante e animali. Nel 1866 Ernest Haeckel propose il nuovo regno dei protisti dove si poteva inserire tutto ciò che non entrava nei regni. Con l'impiego del microscopio elettronico verso la fine degli anni '40 divenne evidente che tra i protisti alcuni avevano strutture intracellulari simili a quelle di piante e animali, mentre certi non avevano proprio caratteristiche in comune. Per questi ultimi venne coniato il termine di procariote, distinti da tutti gli altri organismi eucarioti. Tuttavia, l'unità dei procarioti, era solo apparente: negli anni '80 Carl Woese iniziò gli studi filogenetici e arrivò alla conclusione che non tutti i procarioti possono vivere nello stesso regno. Propose quindi di riclassificare il mondo vivente in tre domini.

• Eukaria: comprende i regni di animali, piante, funghi e protisti.
• Bacteria: derivati dalla scissione dei procarioti.
• Archea: derivati dalla scissione dei procarioti.

Cellula procariote

I batteri e gli archea hanno una cellula procariote. In questo tipo di cellula il materiale genetico è costituito generalmente da un cromosoma ed è a diretto contatto con il citoplasma formando una struttura chiamata nucleoide. Sia le cellule eucariotiche che quelle procariotiche sono dotate di una membrana plasmatica che separa il contenuto citoplasmatico dall'esterno e regola il trasporto di nutrienti e sostanze di rifiuto. La composizione del citoplasma è simile nei due tipi di cellule, entrambi contengono i ribosomi. Le cellule procariote sono generalmente più piccole di quelle eucariote, quest'ultima, oltre al nucleo presenta organelli cellulari delimitati da membrana, assenti nella cellula procariotica. La divisione cellulare nei procarioti avviene per scissione binaria. Non sono note le modalità di riproduzione sessuale con alternanza di fasi aploidi e diploidi. Tuttavia, anche nei procarioti sono presenti fenomeni sessuali ma non legati alla riproduzione.

Morfologia batterica

I batteri hanno generalmente dimensioni nell'ordine dei micrometri. La tipica dimensione dei batteri è da 0,2 a 2 µm. Essendo per lo più unicellulari, i batteri presentano una limitata varietà di forme: sferoidali, bastoncellari, a virgola, a spirale, filamentose e ramificate. Le forme più comuni sono:

• Cocco: il batterio presenta una forma sferica.
• Bacillo: il batterio presenta una forma bastoncellare.
• Coccobacillo: quando i cocchi non presentano una forma sferica leggermente allungata.

Quando i cocchi in divisione rimangono attaccati, se restano appaiati dopo la divisione sono chiamati diplococchi. Se formano delle catenelle vengono chiamati streptococchi. In alcuni casi i cocchi si dividono su due piani e restano uniti in gruppo di 4 formando una tetrade o si dividono su tre piani formando le saracine, costituite da gruppi di otto cellule. Infine, se formano grappoli sono chiamati stafilococchi.
I bacilli possono rimanere appaiati dopo la divisione formando un diplobacillo o formano una catena chiamata streptobacillo. I batteri a forma di virgola hanno il nome di vibrioni, mentre quelli a spirale sono definiti spirilli o spirochete, se hanno più spirali. Le ultime hanno cellule più sottili e flessibili delle spirali. Altri batteri hanno forme più complesse come gli streptomiceti che hanno forme filamentose e formano ife costituite da lunghe catene di cellule, che danno origine a un micelio. I batteri peduncolati o prostecati presentano un peduncolo detto prosteca che consente loro di aderire al substrato o aumentare la superficie di scambio con l'esterno.

Morfogenesi cellulare

La morfologia batterica è determinata dalla loro parete mureinica (peptidoglicano) o sacculo, costituito da un polisaccaride complesso chiamato peptidoglicano. Sono state identificate proteine che presentano similarità con proteine del citoscheletro eucariotiche e che controllano la forma e l'accrescimento batterico. La prima è FtsZ (filamentous temperature sensitive Z) che è una proteina simile alla tubulina. Si localizza in posizione mediana e conduce la formazione della nuova parete cellulare che separerà le due cellule. Nella maggior parte dei batteri a forma di bastoncello, la proteina MreB, simile all'actina, forma una struttura elicoidale a quello della membrana citoplasmatica. Se inattivata, comporta un progressivo aumento del diametro cellulare fino a causare l'arrotondamento delle cellule. Un'altra proteina è CreS (crescentina presente in Caulobacter Crescentus) ed è responsabile della curvatura della cellula.

Rivestimento batterico

La cellula procariote presenta complesse strutture di rivestimento che consentono al batterio di adattarsi a condizioni anche estreme. Tutte le cellule procarioti hanno una membrana plasmatica, che è protetta a sua volta dalla parete cellulare che ha la composizione e posizione diversa a seconda del gruppo microbico. Possono essere presenti altre strutture di rivestimento, strato S, capsula, glicocalice e appendici di superfici come pili o flagelli. Le diverse caratteristiche della parete permettono di dividere i batteri in due gruppi:

• Gram positivi: sono privi di membrana esterna e la loro parete è costituito da uno spesso strato di peptidoglicano, chiamato anche mureina, che è un polimero composto costituito da amminozuccheri e amminoacidi.
• Gram negativi: si osserva una vera e propria membrana a doppio strato lipidico detta membrana esterna, per cui la membrana plasmatica è detta anche interna. Lo spazio delimitante delle due membrane è chiamato periplasma in cui si trova un sottile strato di peptidoglicano.

Membrana plasmatica

La membrana plasmatica delimita il contenuto cellulare e permette e regola gli scambi tra cellula e ambiente esterno. Nei procarioti la membrana plasmatica è la sede di importanti processi metabolici. Infine, grazie ad essa e grazie alla presenza di recettori specifici, è possibile la trasduzione di segnali che consentono alla cellula di percepire e rispondere a vari stimoli ambientali. Le membrane procariotiche ed eucariotiche sono simili, costituite da un doppio foglietto fosfolipidico, contenente vari tipi di proteine. Le membrane procariotiche differiscono sia per la composizione lipidica che proteica. La maggior parte dei lipidi che contengono le membrane sono molecole anfipatiche, costituite da una testa polare e una coda apolare. Le membrane plasmatiche di Bacteria e Eucaria sono tipicamente costituite da fosfolipidi in cui le teste polari sono formate da una molecola di D-glicerolo-3-fosfato e la coda da due molecole di acidi grassi non ramificati esterificati al C1 e al C2 dello scheletro del D-glicerolo. Al fosfato esterificato C3 possono essere legati gruppi funzionali la cui natura origina fosfolipidi diversi. In ambiente acquoso, i fosfolipidi tendono a formare un doppio strato con le catene laterali degli acidi grassi che associano tramite legame idrogeno, mentre le porzioni polari sono rivolte all'esterno. In queste condizioni la membrana appare come una struttura spessa 5-10 nm. La struttura generale della membrana citoplasmatica è stabilizzata da interazioni idrofobe e da cationi adiacenti come Mg²⁺ e Ca²⁺. Le membrane biologiche sono rappresentate come strutture dinamiche in cui proteine e lipidi sono in grado di diffondersi lateralmente (modello a mosaico fluido). Gli acidi grassi presenti nelle membrane dei batteri sono per lo più saturi. Nella maggior parte degli Archea sono presenti opanoidi, il diplotene un opanoide che si ritrova più comunemente. Alcuni batteri pare presentino steroli come i metilotrofi o i micoplasmi. Le membrane citoplasmatiche dei batteri contengono numerosi e svariati tipi di proteine la cui presenza conferisce alla membrana numerose proprietà funzionali. Una classe è costituita dalle cosiddette proteine integrali di membrana, sono anfipatiche e le loro regioni idrofobe sono immerse nella matrice lipidica, mentre le porzioni idrofile possono sporgere sia verso il citoplasma sia verso l'esterno della cellula. Una seconda classe comprende le proteine periferiche che sono associate alla membrana attraverso interazioni non covalenti. Un'ultima classe è quella delle lipoproteine, sono proteine ancorate alla membrana citoplasmatica grazie ad una modifica post-traduzionale che introduce una coda lipidica all'estremità N-terminale.

Membrana plasmatica degli archea

Le loro membrane plasmatiche hanno caratteristiche che li distinguono dagli Eukaria e i Bacteria. La differenza riguarda la chiralità del glicerolo, il tipo di legame tra glicerolo e catena alifatica e il tipo di catena alifatica. Negli Archea il fosfato è esterificato con il glicerolo in C1, producendo l'enantiomero L-glicerolo. Le catene laterali alifatiche non sono costituite da acidi grassi ma da isoprenoidi, il cui gruppo-OH è condensato all'L-glicerolo tramite legame etere (estere in bacteria) in C2-C3. Inoltre i lipidi degli Archea possono essere dieteteri e tetraeteri di glicerolo. I dietereri di glicogeno (fitanile) sono costituiti da 20 atomi di C legate a una estremità a una molecola di glicerolo. Nei tetraeteri (difitanile), ci sono due catene difatiche da 40 atomi di C legate a ciascuno delle due estremità a due molecole di glicerolo. I tetraeteri di glicerolo formano membrane monostrato che offrono maggiore resistenza tipiche degli Archea, che sono ipertermofili. In questa membrana si ha una minore mobilità delle catene isoprenoidi che conferiscono una notevole impermeabilità. Isoprene: elemento fondamentale delle catene laterali dei lipidi degli archea. Le catene laterali di eucarioti e eubatteri sono costituite da acidi grassi. Negli archea, gli acidi grassi sono sostituiti dall'isoprene.

Funzioni della membrana citoplasmatica

La membrana plasmatica dei procarioti è sede di un'intensa attività metabolica e funge da:

• Barriera selettiva: è una barriera selettivamente permeabile tra il citoplasma e l'ambiente extracellulare. Questo è dovuto alla composizione proteica e lipidica della membrana. Il doppio strato fosfolipidico permette la diffusione di H₂O, gas e di piccole molecole liposolubili, mentre risulta impermeabile a composti polari e a grandi molecole che possono attraversare la membrana plasmatica attraverso specifici sistemi di trasporto rappresentati da proteine.
• Produzione di energia: la membrana plasmatica è la sede delle principali trasformazioni di energia (ATP) in forme utilizzabili dalle cellule. A livello di questa struttura avviene la respirazione e/o la fotosintesi, in entrambi i casi viene generato un gradiente ionico transmembrana (forza protonmotrice) il quale viene utilizzato dalla cellula per produrre ATP e per alimentare i processi che richiedono energia.
• Trasduzione del segnale: le cellule sono in grado di rispondere rapidamente ai cambiamenti delle condizioni ambientali grazie a meccanismi detti sistemi di trasduzione del segnale. Questi ultimi sono in grado di percepire gli stimoli esterni trasmettendo il segnale all'interno delle cellule e modificare il profilo dell'espressione genica e successivamente di una o più caratteristiche fenotipiche. Le proteine responsabili della trasduzione del segnale sono associate alla membrana e possiedono domini extracellulari esposti all'ambiente e domini citoplasmatici.
• Biosintesi dei componenti cellulari: la membrana plasmatica è sede di importanti processi biosintetici. La sintesi dei fosfolipidi, alcuni passaggi della sintesi del lipopolisaccaride e del peptidoglicano, avvengono in questo comparto cellulare.

Parete batterica

La maggior parte dei batteri, esternamente alla membrana plasmatica, possiede una parete. Nonostante la diversa architettura entrambe le pareti dei Gram+ e Gram- possiedono un'unica molecola polimerica, detta saccuolo, che avvolge interamente la cellula.

Saccuolo di mureina

Il saccuolo conferisce rigidità e forma alle cellule. Questa struttura cellulare è essenzialmente costituita da peptidoglicano. L'involucro dei Gram+ è costituito da uno spesso strato di peptidoglicano che costituisce il 90% della parete, mentre quello dei Gram- presenta una struttura pluristratificata e più complessa che comprende un sottile strato di peptidoglicano. Il peptidoglicano ha una struttura reticolare formata da catene glicaniche, costituite da due amminozuccheri alternati, l'N-acetil-glucosamina (NAG) e l'acido N-acetil-muramico (NAM). Al NAM è legato il tetrapeptide tramite il quale, le catene glicaniche, si connettono tra loro. Il NAM presenta un residuo di acido lattico legato con legame etere al C3 del glucosio da cui si diparte il tetrapeptide. L'unità base del peptidoglicano è costituita da un disaccaride legato ad un tetrapeptide (glicano tetrapeptide). È costituito dal NAM e dal NAG, legati da legami glucosidici. La composizione del tetrapeptido è variabile ma quella β-1,4 più frequentemente riscontrata è: L-alanina, acido D-glutamminico, acido mesodiaminopimelico (DAP) e D-alanina. Nei Gram+ il DAP è sostituito da un altro amminoacido, la L-lisina. Le unità momomeriche glican-tetrapeptidi, che sono uniti da legami β-1,4 glucosidici formando catene lineari di diversa lunghezza. I filamenti di glicano adiacenti sono interconnessi da legami tra i tetrapeptidi (transpeptidici) che si formano tra il gruppo carbossilico della D-alanina in posizione 4 e il gruppo amminico del DAP, in posizione 3 di un tetrapeptide del filamento adiacente del glicano. Tale legame è tipico dei Gram- e viene definito legame crociato diretto. Tuttavia, nei Gram+ il legame è mediato da un ponte 5 (L-glicina). Il lisozima è un enzima presente nelle secrezioni biologiche e nelle uova. Ha un'azione antimicrobica grazie alla capacità di idrolizzare i peptidoglicani che costituiscono la parete batterica. In seguito alla lesione di questa struttura la cellula batterica richiama acqua fino a scoppiare.

Biosintesi del peptidoglicano

La biosintesi del peptidoglicano si svolge in 3 diversi scomparti:

• Citoplasma, in cui avviene la sintesi dei precursori.
• Membrana citoplasmatica, si ha la sintesi dell'unità monomerica del glicano legata ad un trasportatore lipidico e il suo ribaltamento sulla faccia esterna della membrana.
• Spazio esterno alla membrana, in cui avvengono le reazioni di polimerizzazione e transpeptidazione (legami crociati).

Citoplasma. Si svolgono le quattro tappe che portano alla formazione dei precursori dell'unità glican-peptidica della mureina. I percussori sintetizzati nel citoplasma sono i due amminozuccheri NAM e NAG legati all'UDP a formare UDP-NAM e UDP-NAG e il pentapeptide che verrà legato al residuo lattico del NAM. Gli amminoacidi L del pentapeptide derivano dalle normale vie metaboliche cellulari. La tappa finale consiste poi nell'assemblaggio del pentapeptide con la formazione del UDP-NAM, sintetizzato come glican-tetrapaptide e l'ultimo amminoacido, generalmente una D-alanina è rilasciata dalla reazione di transpeptidazione. Nel citoplasma, la sintesi dell'UDP-NAM è catalizzata dagli enzimi MurA e MurB a partire da UDP-NAG, in presenza di fosfoenolpiruvato (PEP). Il PEP viene trasferito al gruppo OH dell'UDP-NAG in posizione 3’ da MurA, formando un intermedio che viene successivamente trasformato da MurB a UDP-NAM. Gli enzimi responsabili della sintesi del pentapeptido legato al NAM sono noti come legasi Mur.

Membrana citoplasmatica. Una volta sintetizzati i precursori del peptidoglicano, devono essere trasportati all'esterno della membrana citoplasmatica. Il trasporto avviene grazie ad un trasportatore lipidico chiamato bactoprenolo, è fortemente idrofobo e consente ai precursori del peptidoglicano di attraversare la membrana citoplasmatica. Il NAM pentapeptide si lega al bactoprenolo formando il lipide I. Successivamente a quest'ultima viene legata una molecola di NAG a formare il lipide II. Il monomero di glicano, che si trova sul lato citoplasmatico della membrana, ancorato con essa tramite il bactoprenolo e viene trasportato sulla faccia esterna.

Spazio periplasmatico. In questo comparto avviene la polimerizzazione dei monomeri grazie alla trasnglicosilasi, che catalizza la formazione di legami glicosidici tra il nuovo monomero di glicano pentapeptide e il filamento di glicano nascente. Il bactoprenolo viene defosforizzato e ribaltato sulla faccia interna della membrana. Infine si forma il legame peptidico tra la catena pentapeptidica del nuovo monomero e il tetrapeptide di una catena di glicano adiacente. In questa reazione, catalizzata da enzimi detti trasnpeptidasi, il legame tra le D-alanine terminali del pentapeptido viene trasferito al gruppo amminico libero della lisina creando un legame crociato e rilasciando la D-alanina terminale.

Parete dei Gram positivi

La parete dei Gram+ è costituita da uno spesso strato di peptidoglicano. Essa si estende per uno spazio di circa 50 nm intorno alla membrana citoplasmatica, separata da quest'ultima da uno spazio periplasmatico spesso 20 nm. Contiene dei polimeri secondari chiamati acidi teicoici, lipoteicoici, teicuronici. Gli acidi teicoici sono polimeri anionici, costituiti da unità ripetute di 1,3-glicerolfosfato legate da legami fosfodieterici. Possono trovarsi legati covalentemente, allo scheletro polisaccaridico del peptidoglicano tramite il NAM o prendendo contatto con la membrana citoplasmatica. Dal punto di vista funzionale essi servono per definire le caratteristiche chimico fisiche dell'involucro e controllano il comportamento della cellula.