Microbiologia 1

Studio morfologico e funzionale della cellula batterica

Differenza tra cellula procariote e cellula eucariote

Cellula batterica

La cellula batterica è una cellula procariotica che può avere due forme: a sfera e a cilindro. La prima prende il nome di cocchi, mentre la seconda bacilli. L’acqua può rappresentare fino all’80% del peso totale di una cellula e può essere legata in diverse quantità a vari componenti cellulari. I componenti più caratterizzanti sono rappresentati dalle macromolecole o polimeri.

Fondamentalmente, la cellula batterica è costituita da una struttura cromosomica estremamente semplice, immersa direttamente nel citoplasma, il quale è delimitato verso l'esterno da una membrana citoplasmatica. Da questa si dipartono, verso l'interno del citoplasma, una serie di complicate invaginazioni che formano il sistema dei mesosomi. Il tutto è quindi racchiuso in un contenitore rigido, formato dal sacculo o parete cellulare, alla cui superficie si trova assai spesso uno strato di materiale quasi sempre di natura polisaccaridica, denominato capsula.

In alcune specie batteriche, la cellula è provvista di sottili appendici libere, costituite dai flagelli, che sono lo strumento della locomozione batterica, e dai pili, di cui almeno alcuni tipi sono in rapporto con i processi di coniugazione.

Componenti fondamentali

• Nucleoide
• Ribosomi
• Membrana citoplasmatica
• Parete cellulare

Strutture accessorie

• Plasmidi
• Glicocalice e capsula
• Appendici filiformi
  • Pili
  • Flagelli

Citoplasma

Il citoplasma batterico è estremamente povero di dettagli morfologici essendo privo di reticolo endoplasmatico, mitocondri ecc. Occasionalmente, sono presenti inclusioni citoplasmatiche, ossia accumuli di materiali nutritivi di riserva. Più frequentemente si tratta di accumuli di glicogeno, polisaccaridi o polifosfati.

Il citosol della cellula batterica è un gel colloidale che contiene per l’80% acqua, sali, zuccheri, amminoacidi, nucleotidi e macromolecole. È molto meno complesso della cellula eucariote.

Contiene:

• Nucleoide
• Ribosomi: rappresentano lo strumento universale delle sintesi proteiche. I ribosomi procariotici, tuttavia, presentano alcune fondamentali differenze da quelli delle cellule eucariotiche; differenze che sono alla base della selettiva azione antibatterica di alcuni antibiotici che agiscono appunto legandosi ai ribosomi. I ribosomi batterici, come quelli eucariotici, sono costituiti da RNA al 60% e proteine al 40% e sono formati da due subunità asimmetriche: una più grande e una più piccola. Le due subunità hanno rispettivamente una costante di sedimentazione di 30s e 50s. La subunità 30s è formata da 21 proteine e da una molecola di RNA 16s, mentre la subunità più grande è formata da 34 proteine e da due specie di RNA. Nelle cellule eucariotiche i ribosomi sono spesso collegati alle membrane del reticolo endoplasmatico, nelle cellule procariotiche questo non è possibile per l'assenza del reticolo.

Inclusioni e granuli

Corpi intracellulari con funzioni di riserva energetica; la cellula batterica può utilizzarli in caso di carenza o assenza di fonti energetiche ambientali. Variabili in dimensioni, numero e contenuto.

Tipologie

• Glicogeno
• Magnetosomi
• Vescicole gassose
• Granuli di zolfo e di fosfato

Mesosomi

Invaginazioni della membrana plasmatica di notevoli dimensioni. Forniscono, nella divisione cellulare, attacco al DNA facilitando la separazione dei due cromosomi e la produzione di un setto trasverso (mesosomi settali). Contengono gran parte dei citocromi e degli enzimi respiratori (mesosomi respiratori) e contengono enzimi coinvolti nella sintesi dei componenti di parete.

Nucleoide

I batteri non possiedono il nucleo! La struttura nucleare del batterio è costituita da un enorme, singola, molecola di DNA, prettamente raggomitolata e direttamente immersa nel citoplasma; pertanto tale struttura può essere considerata l'equivalente di un cromosoma. A differenza delle cellule eucariotiche, il DNA nei batteri non è legato ad istoni ed è complessato lassamente ad alcune proteine acidiche, da cui è facilmente dissociabile.

Oltre al cromosoma, la maggior parte dei batteri possiede un certo numero di molecole di DNA, denominate plasmidi, dotate di una relativa autonomia replicativa ed in grado di condizionare diversi caratteri fenotipici. Il DNA cromosomico batterico è immerso direttamente nel citosol, in forma superavvolta e spesso associato a particolari regioni della membrana citoplasmatica (mesosomi), dove risiedono gli enzimi per la replicazione batterica.

• È costituito da un lunghissimo filamento circolare
• Contiene tutta l’informazione genetica del batterio
• Struttura del DNA di E.coli: dimensioni = 0,5 μm diametro x 2 lunghezza
• Informazione genetica: l’unità funzionale dell’informazione genetica è il gene. I geni contengono l’informazione utilizzata dalla cellula per fabbricare le proteine. Le proteine, oltre a costruire gran parte della struttura dell’organismo, guidano le attività cellulari.

Plasmidi

Sono costituiti da una autonoma capacità replicativa. Sono costituiti da DNA a doppia elica in forma circolare e presentano dimensioni molto minori di quelle dei cromosomi, sono in grado di condizionare diversi caratteri fenotipici. Possono integrarsi nel cromosoma.

Membrana citoplasmatica

La membrana citoplasmatica dei batteri si differenzia da quella delle cellule eucariotiche per una composizione lipidica relativamente semplice, in cui gli acidi grassi polinsaturi sono dimostrabili raramente e invece sono più frequenti acidi grassi ramificati e derivati dal ciclopropano, mentre gli steroli sono completamente assenti. Le proteine della membrana citoplasmatica dei batteri sono di norma non glicosilate.

Per quanto riguarda il trasporto delle sostanze dall'ambiente esterno, tutti devono essere sottoposti a rigidi controlli selettivi. Una diffusione passiva, ovverosia il transito di molecole attraverso la membrana esclusivamente in virtù di un gradiente di concentrazione, è possibile solo per l'acqua e poche sostanze liposolubili come il glicerolo. Per tutte le altre sostanze esistono specifici sistemi di trasporto attivo che necessitano dell'intervento di una o più proteine di membrana in grado di interagire specificamente con le varie sostanze, trasferendole attraverso la membrana.

La membrana citoplasmatica batterica è inoltre sede di alcuni processi biosintetici, come la sintesi del peptidoglicano. Nei batteri in grado di produrre ATP attraverso un processo di respirazione, la membrana plasmatica è sede degli enzimi e dei vettori della catena respiratoria.

• È una barriera di permeabilità selettiva; spessore = 6-8 nm
• È una struttura fluida
• È costituita per il 60% da proteine e per il 40% da lipidi

Struttura

• È costituita da un doppio strato fosfolipidico simmetrico
• I fosfolipidi contengono sia una componente idrofobica sia una componente idrofila
• Legati al fosfato possono esistere altri gruppi idrofilici
• Gli steroli sono assenti, ad eccezione dei micoplasmi
• Le membrane dei batteri contengono numerosi e svariati tipi di proteine che conferiscono numerose proprietà funzionali. In E.coli si stima che vi siano circa 200 proteine diverse

Le principali proteine della membrana hanno regioni idrofobiche nelle parti che attraversano la membrana e regioni idrofiliche a contatto con l’ambiente esterno. La superficie esterna è rivolta verso l’ambiente esterno. Nei Gram negativi, la superficie esterna interagisce con una serie di proteine che legano substrati o processano grandi molecole per il loro trasporto nella cellula. La superficie esterna è rivolta verso il citoplasma e interagisce con le proteine coinvolte nelle reazioni energetiche ed in altre funzioni cellulari.

Proteine integrali

Di membrana, sono inserite saldamente nella membrana e non facilmente estraibili dalla membrana.

Proteine periferiche

Associate alla superficie o ancorate con coda lipidica alla membrana (lipoproteine), facilmente rimovibili.

Funzioni

• Barriera di permeabilità selettiva: impedisce il passaggio dei soluti dall’interno verso l’esterno
• Diffusione passiva: H₂O, CO₂, etanolo, glicerolo
• Diffusione attiva: ioni, composti polari e grosse molecole
• Funge da ancora per molte proteine
• È sede dei processi biosintetici
• È sede della trasduzione del segnale

La sua natura idrofobica costituisce una barriera di diffusione delle sostanze solubili presenti nel citoplasma. Le proteine di trasporto hanno il compito di trasportare i soluti attraverso la membrana contro un gradiente di concentrazione, così i soluti vengono accumulati fino a livelli superiori a quelli che si ritrovano nel loro habitat.

Come escono le proteine dalla cellula?

Le traslocasi trasportano le proteine: fuori dalla membrana e nella membrana. Per sostenere il metabolismo e la crescita bisogna importanti nutrienti ed espellere i rifiuti. Nei procarioti esistono tre classi di sistemi di trasporto:

1. Trasporto semplice: guidato dall’energia associata alla forza proton-motrice, la quale viene poi costantemente ristabilita attraverso le reazioni che liberano energia (cataboliche). Durante questo trasporto viene utilizzata una sola proteina che attraversa lo spessore della membrana.
2. La traslocazione di gruppo: modificazione chimica della sostanza trasportata guidata dal fosfoenolpiruvato. I sistemi maggiormente studiati riguardano il trasporto di zuccheri (glucosio, mannosio e fruttosio) che vengono fosforilati durante il trasporto grazie alle fosfotransferasi. Il sistema della fosfotransferasi in E.coli è costituito da 5 proteine:
   • Tre proteine a localizzazione citoplasmatica
   • Una proteina associata alla superficie interna della membrana
   • Una proteina integrale di membrana
3. Sistema ABC (ATP-Binding Cassette): coinvolge proteine periplasmatiche di legame e l’energia proviene dall’ATP. Sono stati identificati circa 200 tipi di trasportatori, costituiti da una famiglia di proteine strettamente correlate. Trasportano composti organici come zuccheri, amminoacidi, nutrienti inorganici come solfato e fosforo.

Caratteristiche dei sistemi di trasporto

• Mostrano un effetto di saturazione
• Elevata specificità
• La loro biosintesi è regolata dalla cellula

Parete cellulare

Una caratteristica della cellula batterica è quella di essere racchiusa in un contenitore rigido che ne condiziona la forma, ed al quale si dà appunto il nome di sacculo o parete cellulare. La struttura della parete cellulare batterica è piuttosto complessa e con profonde differenze tra batteri gram-positivi e gram-negativi.

Osservata al microscopio elettronico, la porzione periferica di un batterio gram-positivo mostra la membrana circondata all'esterno da un grosso stato denso di elettroni apparentemente omogeneo. Nei Gram-negativi, si formano invece tre diversi strati che, procedendo dall'interno verso l'esterno, sono costituiti da: la membrana citoplasmatica, uno strato di materiale apparentemente omogeneo e un'ulteriore struttura a sezione trilaminare che avvolge all'esterno la cellula batterica. Nell'uno e nell'altro gruppo di batteri, infine, la superficie esterna della cellula è di norma circondata da uno strato di materiale mucoso di spessore variabile che prende il nome di strato mucoso o capsula.

Il componente fondamentale della parete è il peptidoglicano: è formato da 2 carboidrati azotati, di cui uno la N-acetilglucosamina e l’acido muramico, i quali sono legati fra loro mediante un legame 1-6. È presente in gran parte dei procarioti, dove circonda la membrana citoplasmatica. Fanno eccezione: Arche, Micobatteri, Micoplasmi. È presente negli eucarioti ma con una struttura più semplice. È formata da vari strati sovrapposti di peptidoglicano ed è indispensabile per la cellula batterica per i seguenti motivi:

• Impedisce il collasso della cellula e la protegge da sostanze tossiche
• Ha attività pirogena
• Può interferire con la fagocitosi

Normalmente l’osservazione microscopica viene condotta nei confronti di batteri colorati con varie metodiche, allo scopo di aumentare il contrasto con il mezzo circostante e rendere più facile lo studio morfologico. Poiché la cellula batterica è uniformemente basofila nelle colorazioni batteriologiche, è possibile usare solo coloranti basici.

Le colorazioni usate si distinguono in colorazioni semplici e colorazioni differenziali. Le colorazioni semplici sono quelle che si eseguono mettendo a contatto un unico colorante con il preparato contenente i batteri da colorare ed hanno esclusivamente lo scopo di agevolare le rilevazioni morfologiche. I coloranti più usati a questo scopo sono il cristallo violetto, la fucsina basica e il blu di metilene. Le colorazioni differenziali presuppongono invece l'impiego di più coloranti usati in tempi successivi, consentendo di evidenziare differenze di colorazione tra specie batteriche diverse ed individuare particolari strutture intracellulari.

Il più importante metodo di colorazione differenziale è rappresentato dal metodo di colorazione di Gram: il preparato viene trattato con una soluzione di cristallo violetto per 2-3 minuti, si allontana quindi il colorante e si mordenza la colorazione; a questo punto, il preparato è trattato per 1-2 minuti con un decolorante (alcol etilico, acetone) e infine ancora per 1-2 minuti con un secondo colorante (fucsina, safranina). Al termine della colorazione di Gram, alcuni batteri appaiono colorati in violetto e sono detti Gram positivi, mentre altri batteri, invece, sono decolorati dall'alcool o dall'acetone ed assumono quindi il colore rosso del secondo colorante e sono detti Gram-negativi.

Il diverso comportamento dei batteri nella colorazione di Gram è riportabile a una diversa permeabilità degli involucri cellulari, che è maggiore nei Gram negativi e minore nei Gram positivi.

Parete cellulare Gram + e Gram -

Nei batteri Gram positivi, la membrana citoplasmatica è protetta da una parete cellulare molto spessa che circonda il batterio, formata da numerosi strati di peptidoglicano con intersecate minori quantità di altri polimeri, rappresentati essenzialmente dagli acidi teicoici. Essi sono polimeri di alcoli polivalenti esterificati con acido fosforico, sono altamente antigenici; alcuni di questi sono legati ad una porzione lipidica e per questo prendono il nome di acidi lipoteicoici. La parete cellulare dei batteri Gram positivi è una struttura altamente polare, si oppone infatti al passaggio delle molecole idrofobiche in grado di danneggiare la struttura della membrana, mentre risulta permeabile alle molecole idrofile, per cui gli zuccheri o gli aminoacidi possono facilmente attraversarla. È in grado di regalare grandi quantità di cationi che probabilmente hanno il compito di garantire un ambiente ionico adeguato al funzionamento degli enzimi presenti nella membrana. La proprietà della parete di fissare notevoli quantità di cationi consente tra l'altro ai batteri Gram+ di tollerare nell'ambiente concentrazioni saline molto più elevate di quelle tollerate dai batteri Gram negativi. Inoltre, la struttura rigida consente ai batteri Gram-positivi di sopravvivere in un ambiente ipotonico, cioè significa con una pressione osmotica inferiore a quella del citoplasma.

I batteri Gram-negativi, invece, possiedono una parete cellulare formata esclusivamente da peptidoglicano ed è da 10 a 25 volte più sottile di quella dei batteri Gram positivi. È presente una seconda membrana cellulare e precisamente una membrana esterna che avvolge la cellula al di fuori della parete cellulare. Molto resistente a una serie di sostanze dannose, infatti ha una struttura bilaminare ma la sua organizzazione è chiaramente asimmetrica. Il foglietto interno è formato, come di norma, da fosfolipidi, mentre il foglietto esterno è formato da uno strato complesso di molecole rappresentate dal cosiddetto lipopolisaccaride batterico, comunemente indicato con l'acronimo LPS.

Peptidoglicano

Strato rigido presente SOLO nei batteri: 90% Gram +, 10% Gram -. Unità strutturale: polisaccaride costituito da 2 zuccheri (disaccaride) e 4 amminoacidi:

1. L-alanina
2. Acidi D-glutammico
3. L-lisina (Gram+)/ acido diaminopimelico (Gram-)
4. D-alanina

Gli amminoacidi D sono assenti nelle proteine. Sia i legami di transglicosilazione che di transpeptidizzazione sono operati dalle PBP.

Acidi teicoici e teicuronicici

Acidi teicoici: sono costituiti da glicerofosfato e ribitolfosfato, da amminoacidi e monosaccaridi. I fosfati sono carichi negativamente, per cui gli acidi teicoici sono responsabili della carica negativa complessiva della superficie cellulare, sono legati covalentemente all’acido muramico e gli acidi lipoteicoici sono legati ai lipidi della membrana.

Parete cellulare Gram+

Acidi teicoici: Funzioni

• Contribuiscono alla porosità, elasticità e resistenza alla tensione
• Costituiscono una fonte di fosfato quando la cellula è carente
• Sono molecole antigeniche (proteina M) e responsabili dell’adesione dei batteriofagi
• Contribuiscono all'idrofobicità della parete

Lo spesso strato di peptidoglicano e la rete degli acidi teicoici rappresentano una notevole barriera che si oppone al passaggio di molecole idrofobiche.

Acidi teicuronicici: Funzioni

• Sono polimeri privi di fosforo contenenti N-acetil-galattosamina e acido D-glucuronico

Gli involucri esterni dei Gram positivi: La parete è una struttura rigida.