Metodologie bioinformatiche

Metodologie bioinformatiche

Introduzione

La bioinformatica è nata con il progetto genoma umano (HGP) e con la costruzione dei primi sequenziatori per:

• Determinare la sequenza del DNA umano
• Identificare i circa 30 000 geni
• Immagazzinare le informazioni in banche dati
• Sviluppare strumenti per l'analisi
• Affrontare i problemi etici, legali e sociali collegati

Nel 1998, ad un consorzio pubblico si affiancò un consorzio privato (Celera Genomics) che prometteva di completare il sequenziamento del genoma umano in 3 anni. Nel 2000 Celera Genomics annuncia di aver completato il sequenziamento ma HGP dimostra che non è così. Negli anni successivi Celera Genomics e HGP collaborano per completare il sequenziamento e solo nel 2003 viene annunciato il completamento del sequenziamento del genoma umano da parte di HGP. La sequenza è stata ottenuta guardando il genoma di N individui di diverse etnie. Negli anni, questa “bozza” è stata migliorata e qualche anno fa si è giunti alla 47^{^} versione. Il problema principale è quello di stabilire quale sia il “gene corretto”, cioè il gene di riferimento.

Com'è stata ottenuta la sequenza? Assemblaggio di frammenti

Alcune copie del genoma (4-5 copie) sono state spezzettate in frammenti più corti (dimensioni comprese tra 200 e 700 bp). I singoli frammenti sono stati sequenziati e poi assemblati osservando le sovrapposizioni tra i vari frammenti. Se ho due frammenti (blu e giallo) e li confronto, scopro che hanno una regione in comune. Quindi, probabilmente i due frammenti vengono dalla stessa sequenza parentale. Successivamente, trovo un altro frammento con una regione comune al frammento precedente che può essere “attaccato” a quello costruito precedentemente. Tutto ciò è stato fatto usando degli algoritmi (→ nasce la bioinformatica).

La bioinformatica gestisce e analizza i dati per le scienze della vita. Un organismo è un dispositivo naturale che, autoriproducendosi, manipola la materia, l’energia e l’informazione. La teoria dell’informazione è fondamentale per la gestione dell’energia e della materia e le cellule vengono considerate dei perfetti gestori dell’informazione.

Il grafico (semilogaritmico) mostra la media del costo di sequenziamento del genoma umano: nel 2007 i costi si sono abbassati perché si è passati dal sequenziamento di Sanger al NGS. La retta rappresenta la legge di Moore (legge empirica) che rappresenta la diminuzione del costo a parità di potenza: ogni 5 anni si dimezza il costo. Però, la retta scende molto meno rispetto ai costi per il sequenziamento, perché? Abbiamo più dati di quelli che si riescono a registrare e, inoltre, molti dati non vengono forniti per motivi di privacy.

La scienza che si occupa dello studio del genoma (sequenza completa del materiale genetico di un organismo) è la genomica. Dal genome, mediante trascrizione, si ottiene il trascrittoma (insieme dei geni espressi, cioè geni trascritti in RNA in una cellula in un certo istante) e la scienza che studia i trascritti viene chiamata trascrittomica. Il proteoma (insieme delle proteine espresse in una cellula in un certo istante) si ottiene per traduzione dal trascrittoma e viene studiato dalla proteomica. Infine, abbiamo il metaboloma (insieme dei metaboliti generati dall’azione delle proteine) che viene studiato dalla metabolomica. Queste scienze vengono denominate, nel loro insieme, scienze omiche.

Processi bioinformatici

• Generazione dei dati: assemblaggio dei frammenti di DNA, costruzione e gestione di banche dati di sequenze (non omiche e pubbliche). In genere, i dati di interesse scientifico sono: sequenza del gene, espressione del gene, proteoma, pathways, fenotipo, etc.
• Recupero dei dati: le banche dati principali sono GenBank (geni), UniProtKB/TrEMBL (proteine), Gene Expression Data, ENSEMPLE database.
• Estrazione dei dati significativi: vengono usati degli algoritmi perché l’analisi manuale è insufficiente per la quantità dei dati. Obiettivi: estrarre i geni sulle sequenze di DNA, capire i meccanismi di trascrizione del gene, trovare segnali sconosciuti, studiare le proteine (struttura e funzione), comprendere i processi cellulari (System biology).
• Analisi dei dati significativi
• Visualizzazione dei dati: facilita la comprensione dei dati (esempio: grafici per l’interazione proteina-proteina)
• Integrazione dei dati: per poter utilizzare i dati più appropriati per raggiungere il nostro obiettivo (esempio: terapia più appropriata per curare una data patologia) bisogna utilizzare una visione olistica, cioè che tenga conto dell’intero sistema. I risultati ottenuti mediante le analisi vengono portati ai biologi per produrre nuovi dati/teorie o validare quelli già ottenuti. In conclusione i dati vengono integrati per generare un modello.

La bioinformatica consente di utilizzare le conoscenze per:

• Riparare o sostituire i geni
• Progettare farmaci con un reale impatto sulla malattia senza alterare l’equilibrio dell’organismo
• Ridurre il “time to market” per l’industria farmaceutica

Il software per la bioinformatica richiede tecniche algoritmiche sofisticate: progetto di GUI, gestione di “Very Large Database”, data mining, algoritmi di apprendimento, programmazione dinamica, algoritmi probabilistici/approssimati, ottimizzazione combinatoria, inferenza statistica, etc.

Design, costruzione e uso di banche dati di interesse biologico

Architettura del calcolatore: l’architettura del calcolatore prevede la presenza di un processore che può accedere a due memorie:

• RAM (o memoria primaria) viene letta e scritta dal processore durante la sua attività. È una memoria volatile che viene persa quando il computer viene spento.
• Memoria di massa (hard disk, chiavetta USB…) – contiene i dati permanenti degli utenti, che rimangono memorizzati nel computer anche quando questo non è acceso. Hanno una dimensione maggiore della RAM.

Abbiamo i dispositivi di input (tastiera, mouse) e output (monitor, stampante). I dati generati dal sequenziamento di genomi richiede una memoria centrale (RAM) di elevate dimensioni. Ogni informazione viene gestita dal processore una per volta per cui si utilizzano più CPU: i segnali di input vengono processati da una CPU in modo da non intaccare le CPU che si occupano di compiti più “pesanti” che lavorano in parallelo (HPC). Il calcolo in parallelo consente di ridurre i tempi (a giorni o ore) della gestione dei dati. In alternativa ad un’architettura con la CPU si usano le GPU.

Oltre all’architettura è necessaria la presenza di un sistema operativo: IOs, Microsoft e altri che sono più specializzati per il calcolo in parallelo. Un sistema operativo è costituito da diversi programmi che vengono attivati nel momento dell’accensione del dispositivo e rimangono attivi finché non viene spento. Le funzionalità principali possono essere:

• Gestione delle risorse (gestisce l’alternanza di vari programmi, come se fossero tutti attivi in parallelo)
• Organizzazione dello storage dei dati (gestisce l’archiviazione dei dati in file o cartelle nelle memorie di massa)
• Input e output (riceve gli input provenienti dalle periferie e li passa al programma corrispondente, viceversa gestisce l’output dei vari programmi inviandolo al dispositivo corrispondente)
• Interfaccia per l’utente (fornisce all’utente una serie di strumenti per facilitare l’utilizzo del calcolatore)

Database

Un database è una struttura che permette di immagazzinare e gestire i dati in modo ordinato e semplice. Per quanto riguarda la bioinformatica, i database di interesse sono:

• Bibliografici
• Di sequenze (nucleotidiche o proteiche)
• Di pattern
• Di strutture (proteine)
• Di immagini (radiografie, PET, etc)

Ci sono diversi livelli di organizzazione del database ma quello più utilizzato è un modello di organizzazione relazionale: abbiamo dei record (comuni) suddiviso in campi a cui si può accedere mediante una parola chiave (codice univoco). Es: database anagrafici a cui possiamo accedere con il codice fiscale che rappresenta la parola chiave che identifica in modo univoco la persona.

I dati possono essere acquisiti da:

• Letteratura
• Sottomissione diretta
• Sottomissione massiva
• Riferimenti incrociati

Mentre l’organizzazione e la conservazione dei dati viene affidata a: DBMS e XML (esempio: HTML; conserva i dati e gli organizza mettendoli con una grafica “carina”). Un database relazionale è formato da tabelle (es: gene, trascritto e informazioni), ognuna delle quali è suddivisa in righe univocamente identificate da un codice denominato chiave. Viene definito database relazionale perché le informazioni non sono del tutto indipendenti, ma in relazione tra di loro attraverso legami logici.

Es: database relazionale formato da 3 tabelle (gene, trascritto e interazioni), ognuna con la sua chiave e con relazioni uno-a-molti. Le informazioni della tabella 1 sono legate a quelle della tabella 2 e lo stesso per la tabella 3.

Si può accedere ai dati mediante:

• Supporto fisico (Hardisk con delle sequenze)
• File di trasferimento di un protocollo [FTP per il trasferimento dei soli dati (no video o immagini), http, HTML]
• Linguaggi di interrogazione (più usati: SQL e operatori booleani)

Operatori booleani: NOT, AND e OR (possono essere combinati tra di loro); ci permettono di identificare i sottoinsiemi degli insiemi dati.

Database di interesse biologico

La prima banca dati di interesse biologico è stata organizzata da Margareth Dayhoff e conteneva 65 proteine. Oggi abbiamo banche dati di: sequenze nucleotidiche, strutture 3D, farmaci, letteratura scientifica, pathways, motivi funzionali, sequenze amminoacidiche.

Database bibliografici:

• PUBMED: orientato alla ricerca e pubblico.
• EMBASE: prodotto commerciale di natura farmacologica che viene usato per la farmacovigilanza per essere aggiornati sulle normative; non è pubblico.
• BIOSIS: copre ampi settori della biologia, compresi i brevetti.

I database disponibili in rete e indispensabili per un biologo sono: EMBL, UniProt, Prosite, etc. I database si distinguono in:

• Primari: contengono dati derivati direttamente dai processi sperimentali e si scambiano dati tra di loro.
• Secondari: riorganizzano i dati primari (esempio: un database di soli esoni)
• Database specializzati: riguardano singoli organismi o processi biologici

La rivista OXFORD Journal Academic ogni anno pubblica un elenco di database al cui interno possiamo trovare International Nucleotide Sequence Database Collaboration, cioè una collaborazione tra GenBank, ENA (EMBL-EBI), DDBJ e altre banche (tra cui SRA) con lo scopo di riportare in un unico database tutte le sequenze genomiche pubblicate. Le sequenze genomiche vengono pubblicate secondo criteri precisi che devono essere rispettati. Per poter creare un unico database è importante accordarsi su come:

• Devono essere i dati
• Devono essere rappresentati
• Devono essere raccolti

I dati sono espressi con la nomenclatura IUPAC:

• Nucleotidi: lettere (A, T, C, G, U)
• Amminoacidi: singola lettera

Il format di ENA è caratterizzato da righe con a monte un codice a tre lettere che indica cosa dice in quella riga. La prima riga, invece, è il riassunto e viene indicata come ID:

1. Numero di accesso primario
2. Versione della sequenza
3. Lineare o circolare
4. Natura chimica (DNA, RNA, …)
5. Classe dei dati (es., tecnologia usata per generarli)
6. Classificazione tassonomica organismo
7. Lunghezza

AC: numero di accesso; DT: data; DE: descrizione; KW: parole chiave; OS: organismo-specie; OC: organismo-classificazione; RN: numero della referenza; RX: link alla referenza; RA: autore della referenza; FT: caratteristiche.

I format delle altre banche dati (GenBank, DDBJ) sono simili ma possono avere delle variazioni nel codice.

Tra i database specializzati abbiamo database di: sequenze di HIV, sequenze ribosomiali RDP, TRANSFAC per fattori di trascrizione e siti di legame dei fattori di trascrizione, GOBASE specializzato per i genomi di organuli, mitBASE per i genomi mitocondriali, ACeDB che contiene dati genetici e molecolari di C.elegans, MGD e OMIM che contiene geni umani e malattie genetiche. Ci sono anche vari database collegati al progetto genoma umano, tra cui GDB che contiene:

• Mappe genetiche
• Mappe fisiche (cloni, STS, FISH)
• Mappe citogenetiche
• Reagenti per le mappe fisiche (cloni, STS)
• Informazioni su polimorfismo
• Citazioni

Database di proteine

Per quanto riguarda le banche dati che raccolgono informazioni su sequenza proteiche e funzioni associate, un’ottima risorsa è Uniprot (gestita dall’EBI). Uniprot è costituita dall’unione di:

• Swiss-Prot incorpora dati raccolti manuelmente e curati da esperti biologi
• TrEMBL contiene tutte le sequenze tradotte dalle sequenze di acidi nucleici note

A partire dall’Atlante delle proteine contenente 65 proteine negli anni la banca dati è stata ampliata e oggi abbiamo UniProt che è formato da 4 parti:

• UniProtKB: informazioni su proteine controllate SwissProt (dimensioni inferiori ma più accurata) + TreEMBL (dimensioni maggiori ma meno accurata)
• UniRef: cluster dei riferimenti che raccoglie proteine simili
• UniParc
• UniMES: sequenze metagenomiche e ambientali

Oltre a UniProt abbiamo anche PROSITE e Pfam che sono specializzati su domini e famiglie di proteine specifiche.

NB: Ci sono una serie di strumenti web che permettono di accedere a queste risorse.

La produzione di dati

Dati genomici

Se lo 0.1% di ~3 miliardi di basi (3 milioni) del genoma umano è diverso tra coppie di individui, supponendo che le basi diverse siano sempre nelle stesse posizioni, quanti genomi diversi possiamo avere? 3,000,000 6,000,000 1,800,000

Risposta: almeno 4 genomi diversi = 2 = 10

Quando parliamo di genoma di riferimento ci riferiamo ad una sorta di genoma “master”, che è vagamente rappresentativo di tutti i possibili genomi individuali; ci sono blocchi non rilevanti alla produzione del fenotipo in cui possono esserci mutazioni e geni dove tutti i segnali non sono ancora noti. Quindi vi è un genoma di riferimento che viene costantemente aggiornato:

https://www.genome.gov/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/grc

97% sono porzioni che codificano microRNA, piccole molecole di RNA che interferiscono con la trascrizione genica, e solo 3% codifica per geni. Il genoma è costantemente aggiornato mediante ri-sequenziamento.

WGS: wound genome sequencing

WES: wound exone sequencing

TGS: target gene sequencing

Dopo il sequenziamento posso effettuare analisi di popolazioni: in popolazioni “chiuse” posso vedere i caratteri genetici che si conservano e quali sono diversi dalle altre popolazioni. Valuto anche la presenza di mutazioni non rilevanti nel fenotipo e mutazioni SNP che sono invece legate a malattie:

• Malattie monogeniche → legate a 1 solo gene
• Malattie multigeniche → legate a più geni

Il bioinformatico deve legare insieme queste azioni con una pipeline (semplici istruzioni scritti in un linguaggio di programmazione).

Sequenziamento del DNA

Obiettivo: determinare la struttura primaria (sequenza) del DNA o RNA (per RNA si determina la struttura primaria ma bisogna poi cercare anche la struttura secondaria: loop di vario genere). In realtà anche per il DNA negli ultimi anni ci si è resi conto che quando il DNA diventa cromatina ci sono parti della sequenza primaria molto vicine a siti di trascrizione o a siti di “start” della trascrizione di geni. Quindi i segnali legati alla trascrizione di geni venivano cercati a una distanza di max un centinaio di basi ma in realtà potevano essere anche molto più lontane quindi l’analisi della struttura 3D della cromatina sta diventando un aspetto importante della genomica.

I passi:

1. Estrazione DNA
2. Amplificazione DNA (PCR)
3. Frammentazione di più copie del DNA
4. Sequenziamenti singoli frammenti (reads)
5. Copertura: rapporto basi sequenziate/lunghezza genoma
6. Assemblaggio dei frammenti

Quello che si ottiene sono delle sequenze di segnale luminose, e questo deve essere tradotto usando algoritmi di associazione con le basi in una sequenza di lettere: si passa dal dato analogico al dato digitale. Tutti i frammenti provenienti da più copie possono essere letti e sequenziati più volte. Da tutto questo lavoro viene fuori complessivamente un numero di basi sequenziate molto più alto della lunghezza del genoma, il rapporto tra n di base sequenziate e lunghezza del genoma è la copertura. La copertura serve a ridurre il rischio di errore (leggendo più volte lo stesso frammento è possibile che si incorra in errori), quindi per ridurre la probabilità di errore serve una copertura alta (ma non altissima perché è maggiore il sequenziamento e maggiore è quindi il costo). I reads (gialli) vengono da diverse copie de genoma e valutando le sovrapposizioni si genera la sequenza finale (verde).

I sequenziatori

I frammenti si sequenziano usando i sequenziatori. Distinguiamo 3 generazioni:

• 1° generazione: Sanger usato per il progetto genoma umano e usato per sequenziare le proteine. Si basa sulla sintesi di filamenti di DNA complementari a quello di cui si vuole ottenere la sequenza, interrotti dall’incorporazione di dideossinucleotidi (cioè privi del gruppo OH in 3’ al ribosio), i quali impediscono l’ulteriore allungamento del filamento.