Metodo biureto

Determinazione delle proteine totali con il metodo del biureto

Il biureto è un ammide dell’acido allifanico e si ottiene per condensazione, a 180°C, di due molecole di urea con l’eliminazione di una molecola di NH₃.

NH₂–C=O–NH₂ + NH₂–C=O–NH₂ → C=O–NH–C=O + NH₃

Se il biureto è addizionato con ioni Cu²⁺ in soluzione alcalina si forma un complesso di colore violetto (reazione del biureto). È stato osservato che questa reazione non è specifica del biureto, ma che gli ioni Cu²⁺, in ambiente basico, reagiscono con qualsiasi composto contenente almeno due gruppi CONH₂, CH₂NH₂ o CSNH₂.

Poiché la reazione richiede la presenza di due gruppi CONH, essa è negativa con gli amminoacidi e con i dipeptidi, mentre è positiva con i polipeptidi a partire dai tripeptidi e naturalmente con le proteine.

Nel 1942, Kingsley propose un reattivo unico nel quale il Cu è presente in bassa concentrazione in soluzione alcalina; in queste condizioni, però, il reattivo è instabile perché precipitano i sali di rame come Cu(OH)₂. Per stabilizzare i sali di Cu, Weichselbaum (1950) propose un reattivo contenente tartrato di sodio e potassio (sale di Seignette) e KI per impedirne l’autoriduzione.

L’intensità del colore sviluppato dalla reazione è proporzionale al numero di legami peptidici interessati nella reazione. Nel nostro caso, l’intensità del colore prodotto dalla reazione è proporzionale alla concentrazione delle proteine; è quindi possibile effettuare una valutazione colorimetrica alla lunghezza d’onda di 540 nm.

Reattivo

• NaOH (0,2 M) in acqua distillata senza CO₂.
• In un pallone da litro, sciogliere 45 g di sale di Seignette (tartrato di sodio e potassio) in 200 cc di NaOH + 15 g di CuSO₄.
• Quando si è sciolto, aggiungere 5 g di KI e portare a volume con NaOH.

Il reattivo è stabile per 2-3 mesi a temperatura ambiente. Per l’uso, diluire il reattivo concentrato 1:3 con acqua distillata.