Metodo biureto

Determinazione delle proteine totali con il metodo del BIURETO

Il BIURETO è un ammide dell’acido allifanico e si ottiene per condensazione, a 180°C, di due

molecole di urea con l’eliminazione di una molecola di NH .

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NH NH NH

2 2 2

180°C

C = O + C = O C = O + NH 3

NH NH NH

2 2 C = O

NH 2

urea biureto

++

Se il BIURETO è addizionato con ioni Cu in soluzione alcalina si forma un complesso di colore

violetto (reazione del biureto). ++

È stato osservato che questa reazione non è specifica del biureto, ma che gli ioni Cu , in ambiente

basico, reagiscono con qualsiasi composto contenente almeno 2 gruppi CONH , CH NH o CSNH

2 2 2 2

.

Poiché la reazione richiede la presenza di due gruppi CONH essa è negativa con gli amminoacidi e

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con i dipeptidi mentre è positiva con i polipeptidi a partire dai tripeptidi e naturalmente con le

proteine.

Nel 1942 Kingsley propose un reattivo unico nel quale il Cu è presente in bassa concentrazione in

soluzione alcalina; in queste condizioni, però, il reattivo è instabile perché precipitano i sali di rame

come Cu(OH) .

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Per stabilizzare i sali di Cu, Weichselbaum (1950) propose un reattivo contenente tartrato di sodio e

potassio (sale di Seignette) e KI per impedirne l’autoriduzione.

L’intensità del colore sviluppato dalla reazione è proporzionale al n° di legami peptidici interessati

nella reazione.

Nel nostro caso l’intensità del colore prodotto dalla reazione, è proporzionale alla concentrazione

delle proteine, è quindi possibile effettuare una valutazione colorimetrica alla lunghezza d’onda di

540nm.

REATTIVO

NaOH (0,2 M) in acqua distillata senza CO . In un pallone da litro sciogliere 45g di sale di

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Seignette (tartrato di sodio e potassio)in 200cc di NaOH + 15g di CuSO . Quando si è sciolto

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aggiungere 5g di KI e portare a volume con NaOH.

Il reattivo è stabile per 2-3 mesi a temperatura ambiente .

Per l’uso diluire il reattivo concentrato 1:3 con acqua distillata. 1