Metodi Fisici in Chimica Organica

Metodi fisici in chimica organica

Composizione elementare e formula bruta

• Analisi elementare
• Spettrometria di massa: introduzione e teoria, lo spettro di massa, riconoscimento del picco molecolare, frammentazioni e riarrangiamenti
• Grado di insaturazione

Relazioni tra gli atomi delle molecole organiche

Struttura molecolare

• Spettrometria 1H-NMR: Introduzione e teoria, chemical shift, accoppiamento spin-spin, equivalenza, costanti di accoppiamento, sistemi di spin, accoppiamento long-range, disaccoppiamento di spin
• Spettrometria 13C-NMR: chemical shift, spettri off-resonance, DEPT e APT
• Spettroscopia NMR-2D: correlazione 1H-1H COSY, correlazione 1H-13C HETCOR e HMQC, HMBC, correlazione 13C-13C INADEQUATE

Identificazione dei principali gruppi funzionali delle sostanze organiche

Spettrometria IR

Determinazione della composizione elementare e della formula bruta

Data una sostanza incognita, lo scopo è quello di determinare la composizione elementare e la formula bruta, attraverso:

• Analisi elementare
• Grado di insaturazione
• Spettrometria di massa

Come arrivare alla formula bruta di una sostanza incognita?

I. Attraverso la composizione elementare (analisi di C, H, N, X...)

II. Attraverso la spettrometria di massa (ione molecolare)

La composizione elementare la deduco attraverso combustione ed analisi dei gas (CO₂, H₂O, NO_X) e usualmente non si ricava la quantità di XO, mentre gli alogeni X li ottengo mediante titolazione. Ottengo in questo modo la composizione percentuale di C, H, N, X ma non di O perché la ottengo per differenza %. Dalla composizione % passo alla formula bruta attraverso il peso atomico (PA) dei singoli elementi. Quindi... % elemento / PA. (PA: C=12,001; H=1,008; N=14,0067; O=15,999).

In questo modo posso ottenere il numero di grammo-atomi di ciascun elemento presente in 100 g di sostanza incognita. La stessa proporzione sarà presente nella molecola. Di solito questi numeri sono frazionari e devo portarli a numeri interi per poter scrivere la formula bruta. Devo quindi normalizzare questi valori, cercando il minimo moltiplicatore in grado di portarmi a questo risultato.

Es. Calcolare la formula bruta di un composto incognito la cui analisi elementare sia: C=67,5%, H=5%, N=17,5%. Per trovare la O% faccio la differenza [100 - (67,5+5+17,5) = 10%]. Calcolo il numero di grammo-atomi (n) di ogni elemento grazie al PA. Nc = 67,5/PAC; nH=4,96/PAH ; nN=17,5/PAN ; nO= 10/PAO. Ottengo: nC= 5,62 ; nH=4,96 ; nN=1,25 ; nO= 0,625. Poiché la molecola deve avere un numero intero di atomi devo procedere alla normalizzazione. Il minimo moltiplicatore più vicino è 0,625 e di conseguenza ottengo: C=8,99 ; H= 7,94; N=2 ; O=1. A questo punto posso arrotondare e ottengo: C₉H₈N₂O.

Quando non sono ancora giunta ad un’approssimazione concessa devo normalizzare di nuovo usando il multiplo intero più piccolo che trasforma i numeri frazionari in interi. La formula bruta minima non è per forza la formula bruta della sostanza incognita: qualunque molecola la cui formula sia costituita da multipli interi della formula bruta minima avrà la stessa % di elementi. La conferma che la minima sia quella reale è data dalla spettrometria di massa!

Oltre alla composizione elementare, quale altra informazione si può ricavare dalla formula bruta?

Dalla formula bruta posso anche ricavare il grado di insaturazione (U) che rappresenta la deficienza di H, ed è importante per alcune informazioni riguardanti la molecola. Per una molecola di formula bruta C_hN_nO_oX_x il grado di insaturazione è espresso dalla formula:

Se U ≥ 4 potrebbe esserci un sistema aromatico, se U < 4 ciò non è possibile. Prima di analizzare gli spettri di qualunque composto incognito bisogna sempre determinare la sua formula bruta minima e da questa ricavare il grado di insaturazione.

Spettrometria di massa

Lo spettrometro è importante ed è lo strumento grazie cui ricavo l'informazione che altro non è che uno spettro di massa, composto da una serie di picchi che danno l'informazione. Esempio: benzammide. Ho l'info del picco molecolare, cioè il peso molecolare (basilare) che ci dice qual è la formula bruta della sostanza. Lo spettrometro di massa è uno strumento che trasforma le molecole in ioni che analizza determinandone appunto la massa o, più correttamente, il rapporto massa su carica (m/z). I cationi che vengono separati in base al rapporto, ma siccome molti hanno carica 1 si capisce come la massa discrimina questo rapporto, il grafico infatti è dato da massa su carica in ascissa e in ordinata l'intensità. Lavorare in spettrometria di massa molto spesso ci dice anche che ci possono essere frammenti caratteristici del tipo di gruppo funzionale.

Gli elementi che compongono uno spettrometro sono:

• Sistema di ionizzazione
• Sistema di differenziazione degli ioni in base al valore di m/z
• Sistema di rilevamento ioni

Componenti:

• Camera di iniezione (dove il campione viene iniettato)
• Analizzatore
• Ion detection: libero gli ioni
• Sistema di dati che trasforma questi dati in uno spettro (massa su carica)

In base al tipo di ionizzazione posso avere diversi tipi di massa:

• Di impatto elettronico (EI)
• Ionizzazione chimica (CI)
• Bombardamento di ioni o atomi (FAB)
• Elettrospray (ESI)
• Matrix-assisted laser desorption (MALDI)

Ionizzazione per impatto elettronico (EI)

Inserisco il campione nella camera sotto forma di vapore o gas e devo far sì che la molecola venga colpita da un fascio di elettroni ad alta energia per ottenere ioni: Le molecole di campione quindi vengono ionizzate per impatto con un fascio di elettroni ad alta energia, superiore di gran lunga all’energia di legame che tiene insieme gli atomi, quindi ottengo un radical catione che è lo ione molecolare (M+) che da informazioni più importanti, (forse genera anche un radical anione ma va ad attaccarsi all’anodo), ma insieme a questo si originano una serie di frammenti F1, F2, F3, ecc. (ricavo info per gruppi funzionali) perché le energie coinvolte sono molto alte (instabilità). Sono diversi campi elettrostatici che tutti gli ioni devono attraversare. Il filamento di tungsteno che produce fascio di elettroni, bombarda la sostanza e questi cationi vanno attraverso la camera per andare all’analizzatore.

Ionizzazione chimica

(Tecnica soft perché essendoci il metano mi permette di vedere solo il radical catione +1 (H))

In questo caso nella camera oltre alla molecola inserisco anche un gas che funge da specie ionizzante (di solito metano), il metano bombarda e quello che ottengo è il radical catione, questo radical catione interagisce con la molecola per dare un catione (molecola prende un H) e metano. È detta chimica perché avviene attraverso una sostanza che funge da ionizzante proprio grazie all’introduzione di gas. Qui la frammentazione è molto scarsa quindi quello che vedo è solo il picco molecolare che è molto intenso.

MALDI e FAB

Sono usate per molecole più polari. Il composto in esame viene disperso in una matrice su un foglio metallico e il composto viene desorbito e ionizzato dall’energia di un laser (MALDI) o colpito da un fascio di atomi di Xe o ioni Cs (FAB). Il campione non deve essere trasformato in gas o vapore ed è applicabile anche a grosse molecole con bassa tensione di vapore (es. peptidi), qui osservo ione addotto [M + H+], ioni addotto [M+Na+] o [M+K+] possono formarsi per la presenza di impurezze saline.

Ionizzazione elettrospray (ESI), accoppiata ad HPLC

Il campione entra e viene sciolto in un solvente in presenza di piccole quantità di acido. La soluzione viene nebulizzata passando attraverso un ugello che si trova ad un potenziale elevato. Le goccioline che contengono gli ioni vengono desolvatate a causa dell’elevata carica superficiale, esplodono diventando sempre più piccole. Alla fine restano i soli ioni che entrano nello spettrometro. Anche qui la molecola non viene vaporizzata quindi posso applicarla anche a molecole grandi e pesanti con basso tasso di vaporizzazione, ed estremamente polari. Es. la ionizzazione elettrospray positiva è prodotta dall’addizione di una molecola ad uno ione positivo, questa carica positiva carica lo ione al quale è addizionato come nel caso della lidocaina (catione), nel caso dell’ibuprofone carico la molecola negativamente.

Analizzatore a settore magnetico

Ce ne sono altri ma questo è il principale. Una volta che gli ioni sono usciti dalla camera attraverso l’acceleratore, gli ioni entrano nell’analizzatore che li separa in base al loro rapporto massa/carica. Da questa equazione ottengo che per un dato ione, r può essere aumentato o aumentando V o diminuendo B. Quindi posso usare una scansione di potenziale o magnetica, di solito gli strumenti usano quella magnetica, di fatto quando gli ioni escono dalla camera, gli ioni grandi tenderanno a urtare contro le pareti se non applico niente e quelli più piccoli idem perché agiscono forza centripeta che li spinge fuori e centrifuga che li spinge verso il centro (il r rimane costante), se aumento B arriveranno ioni con massa/carica crescente al collettore. Altro blocco è il rilevatore degli ioni che consente di trasformare gli ioni in corrente elettrica in maniera che posso rilevarlo con un grafico di massa e quello che si origina è lo spettro di massa (massa/carica che si sono formati).

Spettro di massa (EI)

In ascissa ho il rapporto m/z perché quello che fa la massa è separare i vari ioni ottenuti a seguito del bombardamento, in particolare ho i cationi perché solo questi arrivano al rilevatore, solitamente la z è 1 quindi quello che vediamo è la massa. Questo grafico (intensità vs m/z) è lo spettro di massa. In ordinata troviamo l’intensità relativa con un massimo di 100%. Tra tutti i metodi di massa quello EI è completo perché mi da tutte le frammentazioni, non solo il picco molecolare (che è quello più a dx), non sempre però il picco molecolare si vede, però di fatto possiamo usare questo EI come impronta digitale. Infatti per poter rompere i legami avrò bisogno di un determinato quantitativo di energia (+- 100kj) e a parità di eV le frammentazioni sono sempre le stesse per certe situazioni strutturali! Posso creare una library di spettri di massa.

Come si interpreta un grafico, ossia uno spettro di massa EI?

• Identificazione dello ione molecolare
• Identificazione di ioni caratteristici
• Identificazione di frammentazione caratteristici
• Ricostruzione della struttura della molecola sulla base della conoscenza di meccanismi di frammentazione standard

Devo tenere bene a mente questo schema per poter proseguire nell’identificazione di uno spettro di massa.

Ionizzazione

Si strappa l’elettrone più esterno, ottengo il radical catione e devo controllare che ci sia un bilancio di carica, in questo caso c’è.

Frammentazione

Il radical catione può essere scisso in un catione e un radicale. La specie carica in un altro processo di frammentazione può dare origine ad un altro catione e una molecola neutra. La specie che rileva la massa è il radical catione se c’è, o il catione, con un picco, di certo non vedo i radicali.

Riarrangiamento

Prevede la formazione di un nuovo radical catione con espulsione di una molecola neutra a partire dal radical catione di partenza. Cariche sempre bilanciate!

In questo caso potrei osservare un picco che corrisponde al peso molecolare del catione propilico, che equivale a 43. Se di una sostanza incognita faccio lo spettro, trovo che da una massa a bassa risoluzione, se la massa è 100 vedo il picco a 100, ma può essere più di una formula bruta quindi o la risolvo con l’aiuto dei picchi isotopici oppure lo trovo attraverso una massa ad alta risoluzione, quindi una massa esatta: quello che trovo non è solo 100 ma 100 con 4 cifre dopo la virgola, che tiene conto esattamente della formula bruta.

MS a bassa risoluzione = analisi dei picchi isotopici

MA ad alta risoluzione = massa esatta

Massa esatta e composizione elementare

Il livello di informazione che possiamo ottenere da uno spettrometro di massa dipende dal suo potere risolutivo. Strumenti a bassa risoluzione forniscono solo la massa nominale degli ioni. Strumenti ad alta risoluzione forniscono la massa esatta degli ioni, che in genere definisce univocamente la composizione elementare degli ioni corrispondenti, ovvero la formula bruta.

Picchi isotopici M+1 e M+2

Se osserviamo attentamente la zona dello ione molecolare scopriamo che oltre al segnale di M+, vi sono altri segnali a valori di m/z più elevati. Di solito si vedono due segnali a valori di m/z= M+1 e M+2 (cioè di una e due unità di massa superiori al segnale dello ione molecolare). Gli ioni M+1 e M+2 non sono dovuti a frammenti ma alla composizione isotopica degli elementi di cui è costituita la sostanza. L’intensità relativa di M+1 e M+2 rispetto a M+ non dipende dalle condizioni nelle quali è stato registrato lo spettro di massa, ma solo dalla composizione elementare della sostanza in esame. Ovviamente i picchi li riconosco quelli che sono isotopici perché ho una tabella che mi indica i valori della massa esatta. La massa luminale è calcolata sulla media di isotopi, la massa esatta invece è calcolata sull’isotopo più abbondante. M+1 significa che ho un isotopo con una carica in più e nel caso del C può essere il 13C.

Es. Immagino di avere una molecola di benzene, io vedrò un picco molecolare (bassa risoluzione) a 78 e due segnali più bassi M+1 e M+2, questi garantiscono la presenza di isotopi. Isotopi all’interno di una formula bruta che non è unica però. I segnali a M+1 e M+2 sono poco intensi e quindi sono picchi poco diagnostici. Negli alogeni però i segnali di M+2 sono molto più intensi e quindi in questo caso sono diagnostici. Oltre all’informazione sulla presenza di Br, Cl posso sapere sulla loro quantità.

Frammentazione negli spettri di massa EI

Nella ionizzazione a impatto elettronico, lo spettro di massa si trasforma in questo modo mano a mano che diminuisce l’energia del fascio di elettroni. Posso lavorare utilizzando sempre questa tecnica dosando l’energia. Cioè se mi interessa solo la massa molecolare posso usare un voltaggio basso, viceversa se voglio sapere i vari frammenti uso voltaggio più elevato. Quando l’energia del fascio di e diventa molto bassa si vede solo lo ione molecolare, mentre ad energie più alte si vedono altri ioni.

Frammentazione in EI

A causa della pressione estremamente bassa all’interno dello spettrometro di massa, avvengono pochissime collisioni tra i frammenti, principalmente decomposizioni unimolecolari. La probabilità di rottura di un legame è legata a:

• Energia di legame
• Stabilità dei frammenti, carichi e neutri

Il pattern di frammentazione è caratteristico dei gruppi funzionali.

Meccanismi di frammentazioni EI

Facendo ricorso a concetti standard di chimica fisica organica possiamo scrivere alcune regole generali per predire i picchi più importanti negli spettri EI.

• L’altezza relativa dello ione molecolare è maggiore per i composti a catena lineare e decresce all’aumentare del grado di ramificazione. Se una è molto ramificata può essere che il picco molecolare non lo vedo.
• L’altezza dello ione molecolare in genere decresce all’aumentare del peso molecolare all’interno di una serie omologa.
• Sono favorite le rotture di legame su atomi di carbonio recanti frammenti alchilici; più sono sostituiti più probabile è la rottura (riflette la stabilità dei carbocationi, se c’è la possibilità di fare un carbocatione più stabile questo è favorito).
• I doppi legami, le strutture cicliche e specialmente gli anelli aromatici (o eteroaromatici) stabilizzano lo ione molecolare e, pertanto, aumentano la probabilità della sua rivelazione.
• Gli anelli saturi tendono a perdere le catene laterali alchiliche con rottura del legame in α. La carica positiva tende a restare sul frammento di anello.
• Nei composti aromatici alchilsostituiti è molto probabile la scissione a livello del legame β rispetto all’anello (scissione benzilica), fornendo il catione benzilico o tropilico (m/z=91).
• I legami C-C prossimi a eteroatomi subiscono frequentemente la scissione; la carica resta sul frammento contenente l’eteroatomo, i cui elettroni di non legame possono stabilizzare la carica per risonanza.
• La scissione è spesso associata all’eliminazione di piccole molecole neutre stabili (CO, olefine, H₂O, NH₃, H₂S, HCN), spesso con riarrangiamenti.

Riarrangiamenti

Gli “ioni da riarrangiamento” sono frammenti la cui origine non può essere attribuita a semplici rotture di legami dello ione molecolare, ma è il risultato di riassestamenti intramolecolari che avvengono durante la frammentazione. I riarrangiamenti che coinvolgono migrazioni di atomi di H all’interno delle molecole contenenti eteroatomi sono particolarmente comuni. Il più importante è quello di McLafferty e si verifica quando ho in posizione α, β, γ rispetto ad...