Medicina di laboratorio - appunti

INDICE:

COLTURA CELLULARE 7

P 7

ROCEDURE PER ISOLARE LE CELLULE DA UN TESSUTO

L’ 8

INTEGRINA

L 8

A FIBRONECTINA

C - 8

O COLTURE

LINEE CELLULARI 8

SEPARAZIONE DI CELLULE 8

IMMORATALIZZAZIONE 9

TRASFORMAZIONE 9

TERRENI DI COLTURA 9

MEDIUM DI COLTURA 10

STERILITA’ 10

CONTROLLO MANUTENZIONE 11

PRECAUZIONE PER LA PREVENZOINE DELLE CONTAMINAZIONI 11

PIASTRE DI COLTURA 12

COLTURE DI CELLULE ADERENTI 13

COLTURE DI CELLULE IN SOSPENSIONE 13

C 13

ONSERVAZIONE DELLE CELLULE IN AZOTO LIQUIDO

MANTENIMENTI E ADESIONE CELLULARE A DIVERSI SUBSTRATI 13

F 13

IBROBLASTI

M 14

ANTENIMENTO CELLULARE

S 14

PLIT E CONTA

F 14

ISSAZIONE

S 14

UBSTRATI

PDMS 14

C 14

HITINA

SEMINA SU SUBSTRATI 14

LA CITOFLUORIMETRIA 15

C 15

ITROMETRIA A FLUSSO

D 16

EFINIZIONE DI FLUSSO LAMINARE 16

FUNZIONAMENTO DEL LETTORE OTTICO

RIFRAZIONE FRONTALE ("FORWARD SCATTER") 16

3

RIFRAZIONE LATERALE ("S S ") 16

IDE CATTER

LA FLUORESCENZA 17

FLUOROCROMI 18

COMPENSAZIONE 19

ANALISI DEI DATI 19

H 19

ISTOGRAM PLOT

D P 20

OT LOT

RICERCA CON LE CELLULE DEL SANGUE 20

CELLULE STAMINALI 22

L 23

E STAMINALI EMBRIONALI

M 23

ESENCHIMALI STAMINALI

M 24

ESENCHIMALI STAMINALI ISOLATE DAL TESSUTO ADIPOSO

TECNICHE DI DIGESTIONE ENZIMATICA E AMPLIFICAZIONE 25

25

LA DIGESTIONE MECCANICA

IMMUNOFLUORESCENZA 26

FLUORESCEINA RODAMINA 26

E

F 26

LUORESCENZA PRIMARIA

F 26

LUORESCENZA SECONDARIA

P 27

RINCIPALI FLUOROCROMI

M 27

ETODO DIRETTO

M 27

ETODO INDIRETTO

T 27

IPOLOGIE DI MARCATORI FLUORESCENTI

PROTOCOLLO DA SEGUIRE 29

F 29

ISSAZIONE

P 29

ERMEABILIZZAZIONE

S 29

ATURAZIONE DEI SITI DI LEGAME ASPECIFICI

A 29

NTICORPO PRIMARIO

A 29

NTICORPO SECONDARIO

C DNA DAPI H 29

OLORAZIONE DEL CON O OECHST

LE CELLULE STAMINALI 30

C (ESC) 30

ELLULE STAMINALI EMBRIONALI

C (ASC) 31

ELLULE STAMINALI ADULTE 31

LA NICCHIA

I 32

SOLAMENTO CELLULE MESENCHIMALI STAMINALI DAL MIDOLLO OSSEO

E 33

MATOPOIETICHE

M 33

ESENCHIMALI

I 1 33

NTERLEUCHINA

I 6 33

NTERLEUCHINA

I 8 33

NTERLEUCHINA

I 34

SOLAMENTO CELLULE MESENCHIMALI STAMINALI DAL SANGUE DEL CORDONE OMBELICALE

I 34

L PROTOCOLLO CHE SI SEGUE PER ISOLARE LE MESENCHIMALI

C 35

ELLULE MONONUCLEATE 4

EMATOPOIESI 35

E 37

TRITROPOIESI

G 38

RANULOCITOPOIESI

M 38

EGACARIOCITOPOIESI

I T 38

L PROGENITORE LINFOIDE

I 39

L PROGENITORE MIELOIDE

T C S E 40

RAPIANTO DI ELLULE TAMINALI MATOPOIETICHE

F 40

ATTORI TRAPIANTOLOGICI

T TCSE 41

IPOLOGIE DI

I 41

STOCOMPATIBILITÀ

CSE 42

C 43

ONDIZIONAMENTO

A CSE 44

TTECCHIMENTO INFUSE

R E I 44

ICOSTITUZIONE MOPOIETICA ED MMUNOLOGICA

I 45

NFEZIONI

R 46

IGETTO

M ’ (GVHD: G H D ) 46

ALATTIA DA TRAPIANTO CONTRO L OSPITE RAFT VERSUS OST ISEASE

FISIOPATOLOGIA DELLA GUARIGIONE DELLE FERITE 47

FERITA 47

P 47

ROCESSO DI GUARIGIONE

F 48

ASE INFIAMMATORIA

C IV V 48

OLLAGENE E

S 48

EROTONINA

M 49

ACROFAGI

F 50

ASE PROLIFERATIVA

A 51

NGIOGENESI

F 52

IBROPLASIA

R 52

IEPITELIZZAZIONE

R ( ) 52

IEPITELIZZAZIONE FERITE DELLA CUTE

F 53

ASE DI RIMODELLAMENTO

LE FUNZIONI DELLE MESENCHIMALI 55

COMUNICAZIONE TRA CELLULE 57

ALTRI FATTORI DA SAPERE 58

I PRINCIPALI CONTENUTI DEGLI ESOSOMI CHE DOBBIAMO STUDIARE PER L’ESAME 59

L’INGEGNERIA DEI TESSUTI 63

B 64

IOMATERIALI

B 64

IOMATERIALI DI SECONDA GENERAZIONE

B 64

IOMATERIALI DI TERZA GENERAZIONE

R ’ 67

ICOSTRUZIONE DELL EPIDERMIDE DELLA PELLE E LA SUA APPLICAZIONE

R ’ 71

IGENERAZIONE DELL EPITELIO ENDOTELIALE PER LA RIGENERAZIONE DELLE ARTERIE DI PICCOLO CALIBRO

R 73

ICOSTRUIRE UN TENDINE

L M B 74

A EDICINA IOMOLECOLARE

T 75

ERAPIA GENICA

L 75

A RICOSTRUZIONE DI UN OSSO

L ’ 77

E TECNICHE DI LABORATORIO CHE VENGONO UTILIZZATE PER ANDARE A STUDIARE UN TESSUTO RIGENERATO DELL OSSO

L 78

E ANALISI ISTOMORFOMETRICHE

IL 3D PRINTING 82

LA 4D PRINTING 83

5

6

COLTURA CELLULARE: crescita e differenziazione di una popolazione cellulare in vetro, al di fuori di un organismo,

permette lo studio di una singola popolazione cellulare o dell’interazione tra differenti linee cellulari in condizioni

controllate, l’obiettivo principale di una coltura cellulare è di ottenere una quantità di cellule sufficiente per garantire

una loro distribuzione in vitro simile a quella del tessuto di origine.

VANTAGGI: sistemi semplificati ed altamente riproducibili, consentono l’analisi dei meccanismi cellulari e molecolari del

fenomeno in esame, controllo ambientale, economicità e rapidità di risposta, disponibilità.

SVANTAGGI: sistemi semplificati rispetto ad un organismo integrato, condizioni di esposizione alle sostanze diverse da

quell’invasivo, difficoltà di correlare la concentrazione in vitro con quelli in vivo, le sostanze inoculate possono interagire

con il terreno di coltura.

PRO: riduzione dell’uso di animali da sperimentazione, possibilità di controllare l’ambiente extracellulare, in una linea

cellulare le cellule sono omogenee.

CONTRO: le cellule vivono in un ambiente artificiale, comportamento anomalo delle cellule rispetto alla situazione in

vivo, modello ancora scarsamente predittivo.

Le maggiori conquiste nelle colture cellulari sono:

- Uso di antibiotici che inibiscono la crescita dei batteri soluzione 100x si s streptomicina e penicillina.

- Uso della tripsina per staccare le cellule dalla piastra di coltura senza danneggiarla.

- Uso di terreni di coltura sintetici.

COLTURE CELLULARI: termine che indica una serie di procedure, anche molto diverse tra loro, che permettono di

coltivare in vitro, ossia in una piastra una fascia di coltura cellule animali vegetali., la maggior parte di esse è grado di

sopravvivere, moltiplicarsi ed esprimere funzioni differenziate in un terreno culturale adatto e con le appropriate

supplementazione di sieri nutrienti, dentro un termostato a concentrazioni fisse di CO2 e a una temperatura di 37°.

I fattori che influenzano i risultati sono: sede, età del paziente, condizioni generali, tempo d’ischemia e metodica

impiegata delle stazioni delle cellule.

La prima cultura che si ottiene dopo la semina delle cellule prelevate viene chiamata cultura primaria.

Quando la cultura primaria giunge a confluenza, cioè le cellule occupano tutto lo spazio disponibile, viene trasferito in

un recipiente più grandi o divisa in diversi recipienti prendendo il nome di subcultura.

Le colture primarie si hanno quando esse derivano da un espianto, secondarie quando deriva dall’altra piastra, le

cellule normali ovvero con un corredo cromosomico possono dividersi in coltura un numero limitato di volte.

Le colture continue derivano da cellule tumorali, che si sono trasformati in vivo.

Procedure per isolare le cellule da un tessuto:

1) Prelievo delle cellule da un campione, quale organo di un adulto o embrioni o uova.

2) Trattamento con tripsina ovvero eliminazione dei contatti proteici delle cellule con la matrice o collagenasi

eEDTA, un chelante del calcio, richiesto dall’integrina per ancorarsi alla fibronectina, questo trattamento serve

a disgregare i contatti fra cellule.

3) Si blocca digestione enzimatica con l’inibitore.

4) Si centrifuga la sospensione cellulare e le cellule vengono risospese. 7

A questo punto viene effettuato un controllo della vitalità cellulare come d’esempio si può fare tramite la colorazione

trip blue che penetra solo nelle cellule morte, danneggiando le membrane, per cui le cellule morte risultano incolori.

Le colture cellulari possono crescere anche monostrato ovvero seminate sul terreno solido in piastra Petri o in

sospensione, quando possono moltiplicarsi anche senza aderire ad un substrato o non presentano alcuna forma di

adesione.

Adesione alla matrice: le colture in monostrato derivano dal fatto che per crescere le cellule necessitano di segnali

della matrice extracellulare, Integrina e fibronectina mediano i contatti cellula-matrice, la fibronectina è una proteina

modulare contenenti motivi di contatto alla m.e.c. (collagene, fibrina, eparina…) ed all’integrina cioè una proteina di

membrana che riconosce sequenze RGD della fibronectina.

L’INTEGRINA è composta da due subunità a e b contenenti ponti disolfuro, le code C-terminali citosoliche sono molto

brevi, tramite un adattatore proteico interagiscono con i microfilamenti di actina, la subunità b lega ioni Ca++ richiesti

per un corretto legame della fibronectina.

La FIBRONECTINA è codificata da un unico gene che può subire splicing alternativo mentre sono presenti più geni

diversi per le catene a e b dell’integrina, con proprietà adesive diverse che permettono movimenti morfogenetico di

cellule durante lo sviluppo embrionale; il siero bovino, comunemente usato nel mezzo di coltura, contiene proteine che

si depositano fornendo un primo sito di attacco con le cellule.

COLTURE CLONALI: in questi tipi di cultura cellule vengono diluite prima della semina in modo tale da avere ogni cellula

venga separata dalle altre che prolifera formando una colonia singola.

Co-colture: in questo caso si coltivano nello stesso recipiente cellule di tipo diverso per permettere di ricostruire un

semplice sistema tissutale.

Tra la semina e la ripresa della crescita c’è un intervallo perché le cellule devono adattarsi.

La cultura primaria è caratterizzata da un tempo di raddoppio lento che aumenta notevolmente nei successivi

passaggi in cultura, quando si parla di linea cellulare primaria, nella terza fase i tempi di raddoppiamento sono più

lunghi a meno ché non intervenga un fenomeno di trasformazione che produce una linea cellulare stabilizzata in grado

di replicarsi indefinitivamente, altrimenti le cellule muoiono.

A seguito del prelievo, soltanto le cellule in grado di sopravvivere alla disgregazione sono in grado di aderire al

substrato e proliferare dando origine alla cultura primaria, che è quindi risultato di una prima selezione.

Nella cultura primaria le cellule discendano direttamente dalle linee del tessuto d’origine mantenendo quindi molte

delle caratteristiche funzionali riscontrabili in vivo.

Durante la crescita della cultura primaria avviene un ulteriore selezione in base al grado di proliferazione, in proporzione

aumentano le cellule attivamente proliferanti restano stazionarie a quelle in grado di sopravvivere ma non di duplicarsi,

mentre altri tipi di cellule sono incapaci di resistere in coltura.

LINEE CELLULARI:

Quando si effettua una subcultura si parla di linee cellulari, che possono essere divise in:

- Linee cellulari a vita finita: hanno un corredo cromosomico diploide, la maggior parte della popolazione cellulare ha

lo stesso cariotipo, resiste in coltura un numero limitato di cicli cellulari, crescono in monostrato risentendo dell’inibizione

da contatto e sono fortemente dipendenti da forti fattori di crescita presenti nel siero.

- Linee cellulari continue (trasformate): hanno origine da mutazioni che possono essere spontanee o indotte con agenti

chimici, fisici o biologici a partire da colture primarie dalle linee cellulari a vita finita e naturalmente possono essere

ottenuti direttamente da tumori, presentano una minore dipendenza da fattori del siero e minore inibizione da

contatto.

Le colture cellulari possono essere utilizzate come materiale di partenza per l’estrazione degli acidi nucleici e proteine

utilizzate per studi funzionali o di rigenerazione in vitro di tessuti organi.

SEPARAZIONE DI CELLULE: le cellule possono essere separate sulla base della loro capacità di sopravvivenza in

condizioni ambientali avverse. 8

La selezione può essere influenzata da vari fattori, come d’esempio la resistenza a infezioni o sostanze citotossiche,

inoltre la separazione può essere ottenuta sfruttando le differenti caratteristiche di sedimentazione mediante

centrifugazione o tramite cromatografia di affinità.

IMMORATALIZZAZIONE: le linee cellulari continue derivano da singole cellule in cui mutazioni spontanee o indotte hanno

annullato il programma genetico della senescenza, si dicono perciò immortali ovvero proliferano in modo continuo in

presenza degli opportuni metaboliti, molte linee cellulari continue sono state ottenute a partire da tessuti tumorali.

TRASFORMAZIONE: le cellule trasformate presentano caratteristiche simili alle cellule cancerose ovvero sono immortali,

proliferano in vitro fino a raggiungere una densità maggiore delle cellule normali e spesso crescono senza legarsi alla

alcuna superficie, per ottenere queste linee cellulari trasformate si ricorre a mezzi chimici o a virus che inducono il

tumore.

Le colture si distinguono a seconda che le cellule siano in sospensione o aderenti.

Le cellule di origine omopoietica, che normalmente crescono in un mezzo fluido, crescono in sospensione e si

moltiplicano in vitro senza aderire.

Le cellule che fanno parte di tessuti solidi crescono in vitro aderendo alla superficie delle piastre da cultura, l’adesione

è necessaria affinché avvenga la crescita in vitro, per avvenire essa richiede l’interazione di recettori di membrana con

proteine adesive, in molti casi i fattori di adesione devono essere aggiunti nel mezzo in cui si mettono in coltura le

cellule.

La crescita in vitro quindi è un ambiente assicurata da elementi nutritivi di base contenuti nel mezzo, fattori di crescita e

fattori di adesione.

TERRENI DI COLTURA:

I terreni usati per le colture cellulari (MEM; DMEM; ...) differiscono tra loro per il contenuto in amminoacidi e sali e per la

concentrazione di glucosio.

La composizione esatta dei singoli terreni ed il tipo di terreno adatto per una data linea cellulare viene di solito

specificato dalla ditta produttrice.

Per la crescita, le cellule richiedono un valore di pH del mezzo compreso tra 7.2 e 7.4. 9

I terreni liquidi non contengono antibiotici, siero e L- glutamina perché molto instabili; questi vanno perciò

aggiunti prima dell’uso.

Il siero è una miscela complessa di proteine plasmatiche, fattori di crescita, minerali... Il siero di uso più comune nelle

colture cellulari è il siero fetale di bovino o vitello (FBS o FCS).

MEDIUM DI COLTURA: il terreno base viene conservato a 4°C e prima di essere utilizzato viene complementato con:

- GLUTAMMINA (a essenziale e molto labile)

- ANTIBIOTICI (penicillina\streptomicina)

- SIERO (supplemento più comune delle colture cellulari)

Per avere un’indicazione visiva del pH i terreni vengono addizionati di rosso fenolo, un indicatore che ha un colore

rosso-arancio a pH 7.3, vira al gialloarancio a pH acido e al rosso viola a pH alcalino.

Se in contatto con la CO2 dell’atmosfera il terreno tenderà perciò ad alcalinizzare (diventa violaceo): in questo caso

non si può usare perché tossico per le cellule.

Per mantenere costante tale valore di pH si ricorre per lo più ad incubatori con una fase gassosa contenente il 5% di

CO2 e terreni contenenti NaHCO3.

In soluzione acquosa il bicarbonato dissocia e va incontro ad idrolisi basica (tende a riformare l’acido

debole di partenza) e poi si ha rilascio di CO2, la CO2 presente nell’incubatore tende a controbilanciare questo

aumento mantenendo così il giusto pH del terreno.

Se si vogliono mantenere le cellule embrionali staminali nel loro stato indifferenziato, invece, occorre usare un siero

adatto (FBS selezionato per cellule embrionali indifferenziate), le cellule aderenti che crescono in assenza di siero,

inoltre, necessitano dell’aggiunta di proteine di adesione purificate.

STERILITA’: al fine di mantenere la sterilità per la coltura cellulare il laboratorio di biologia cellulare deve essere esclusivo

ed è necessario lavorare sotto cappe a flusso laminare verticale alle quali vanno sostituiti periodicamente i filtri.

Per la sterilizzazione dei materiali:

- Stufa a secco, 180°C per 3 ore: per la vetreria 10

- Autoclave (calore umido), 1 atm - 121°C: per filtri, soluzioni saline, strumenti chirurgici

- Filtrazione con filtri da 0.22 µm: terreni di coltura, soluzioni organiche...

CONTROLLO MANUTENZIONE: pur operando in condizioni di sterilità lavorando con le colture cellulari c’è sempre rischio

di contaminazione da parte di batteri, funghi, micoplasmi e virus.

Mentre la contaminazione da batteri e miceti è facilmente identificabile (provoca un intorbidimento del terreno),

quella da virus e da micoplasmi è più difficile da identificare (tranne che si riscontri un effetto citopatico).

Per ridurre i rischi di contaminazioni, perciò, vengono aggiunti ai terreni da coltura degli agenti antibiotici

(penicillina, streptomicina, kanamicina...) e antimicotici (anfotericina B...).

La contaminazione da Micoplasmi viene rilevata tramite rilevazione di adenosina fosforilasi con colorazione con

fluorocromi del DNA...L’eliminazione del micoplasma si ottiene di solito tramite trattamento con l’antibiotico BM-ciclina.

PRECAUZIONE PER LA PREVENZOINE DELLE CONTAMINAZIONI:

4) Operare sempre sotto cappa a flusso laminare.

5) Utilizzare solo materiale sterile (di vetro o di plastica).

6) Utilizzare sempre pipettatori elettrici.

7) Pulire bene la cappa a inizio e fine lavoro.

8) Controllare periodicamente i filtri della cappa.

9) Mantenere con attenzione ben pulito l’incubatore a 37°C (pericolo miceti). 11

PIASTRE DI COLTURA: In commercio sono disponibili piastre per colture cellulari e piastre per batteriologia (queste

utilizzabili anche per la coltura di cell