Meccanismi di controllo delle proteine sull'RNA

Quindi questo meccanismo permette di eliminare tutti gli RNA

messaggeri che contengono dei segnali di terminazione prematuri.

Nonsense-Mediated Decay

Questo meccanismo quindi è chiamato

(NMD) perché legato ad un codone nonsenso. Ci sono dei casi in cui un

messaggero ha un emivita brevissima poiché su di esso è

costitutivamente segnalato il Nonsense-Mediated Decay perché questo

messaggero ha una struttura particolare. Quindi ci sono dei messaggeri

che hanno una composizione introne-esone particolare per cui nel

momento in cui entra nell’ apparato di traduzione, dopo questo primo

ciclo viene degradato, viene attaccato dai vari enzimi perché

evidentemente non viene rimosso il complesso EJC. Generalmente negli

organismi superiori gli introni riguardano la coding sequence e quindi se

non c’è un segnale prematuro di stop a valle delle giunzioni esoni-esoni,

il problema non si pone.

Se gli introni stanno nel 3’-UTR, il ribosoma scorre, arriva al segnale di

terminazione e si stacca; da lì nessuno li rimuove. Questo è il motivo per

cui è difficile trovare questo tipo di messaggeri. Ci sono comunque delle

indicazioni sul genoma che esistono, ma comunque quando il

messaggero viene caricato sui ribosomi dopo il primo ciclo viene

degradato. Ci sono delle condizioni patologiche in cui questi messaggeri

sono venuti fuori e in qualche modo sfuggono a questo tipo di controllo.

Nella figura in basso si vede come lo splicing alternativo della proteina

che regola lo splicing PTBP2 porta due forme; in una forma c’è l’

inclusione di questo esone (il 10) e quindi la normale traduzione del

messaggero. Questo esone è specifico per i tessuti nervosi e quindi viene

incluso solo nei nessuti nervosi in cui è assente la proteina regolatrice-

negativa PTBP1. 4

Nei tessuti in cui PTBP1 è espresso, quindi nei tessuti non neuronali, c’è

exon skipping,

un quindi l’ esone 10 non è incluso e c’è una

ricongiunzione degli esoni 9 e 11 ed entra un segnale di terminazione

prematuro per cui il messaggero è degradato e la proteina non è

prodotta. Quindi laddove c’è il PTBP1, non c’è il messaggero e la proteina

di PTBP2. Questo per un meccanismo di Nonsense-Mediated Decay.

Quindi abbiamo parlato di meccanismi che riguardano l’ RNA, ora

parliamo di meccanismi che riguardano il controllo della qualità delle

proteine. chaperonine

La struttura delle proteine viene facilitata da specifiche, che

aiutano la proteina ad assumere una conformazione corretta mediante

meccanismi dipendenti dall’ idrolisi dell’ ATP. Queste chaperonine sono

over-espresse in condizioni estreme come di shock termico che porta ad

un’ apertura della proteina e in questo caso vengono up-regolate : per

Heat Shock Proteins

questo inizialmente sono state descritte come (HSP).

Queste intervengono sul folding della proteina e, se non funzionano, la

proteina viene degradata dal proteasoma. Ne esistono due classi

principali : le HSP70 (70 e 70-like) e le HSP60.

Le HSP70 sono piccole molecole che si legano alla proteina

 contestualmente alla sua traduzione, per cui le HSP70 si legano a

domini idrofobici per impedire interazioni pericolose (interazioni

intermolecolari). Finchè la proteina non è sintetizzata

completamente, le HSP70 rimangono legate e solo quando il

prodotto è completo si ha il distacco che richiede l’ idrolisi dell’ ATP.

Le HSP60 sono dei complessi proteici, hanno una struttura molto

 grande, sono costituiti da diverse subunità e funzionano come delle

tasche in cui si va ad inserire la proteina unfolded. Avviene sempre

il folding della proteina dovuto all’ idrolisi dell’ ATP. La proteina

viene infine liberata per cambio conformazionale. C’ è

5

effettivamente una componente che funziona da coperchio, quindi

un cambio conformazionale porta all’ apertura e quindi alla

fuoriuscita della proteina ora strutturata correttamente e di minor

ingombro. Quindi la compattazione ne facilita la fuoriuscita.

pathway

Se il folding non avviene in modo corretto la proteina entra nel

del proteasoma (non entriamo nel dettaglio). E’ legato ad una

modificazione post-traduzionale delle proteine, per il legame dell’

ubiquitina che è un peptide piuttosto grande di 76 aa che viene legato

alla proteina mis-/unfolded e che costituisce il segnale per la

degradazione da parte del proteasoma. Questa è una struttura costituita

da diverse subunità, una subunità che riconosce la coda di poli-

ubiquitina, una subunità che denatura la proteina per inserirla in una

specie di tasca per promuoverne la degradazione proteolitica.

Ora vediamo come la cellula gestisce il lavoro delle chaperonine.

Abbiamo detto che le chaperonine si occupano della ristrutturazione delle

proteine e lo fanno in una sede particolare che è il reticolo

endoplasmatico. Nel lume del reticolo

endoplasmatico lavorano le

chaperonine per ricompattare le

proteine di nuova sintesi. Nel RE si

verificano tutti gli eventi

fondamentali relativi alla sintesi di

una proteina matura, quindi sulla

membrana del reticolo si verifica la

sintesi per presenza di poliribosomi

e all’ interno si avrà la maturazione.

6

Nel caso in cui la proteina debba essere maturata a livello post-

traduzionale, si verificano modificazioni chimiche post-traduzionali e si

verifica infine il folding della sua struttura terziaria. Se questo evento è

insufficiente, la soluzione più semplice è la fuoriuscita della proteina non

foldata correttamente e il suo caricamento sul proteasoma per la sua

degradazione.

Ci sono delle situazioni fisiologiche ma anche patologiche in cui si crea

uno stress da reticolo endoplasmatico : situazione in cui c’è un forte

accumulo di proteine unfolded. Vuoi per intensa sintesi proteica, vuoi per

difficoltà delle proteine a strutturarsi (magari per la presenza di

mutazioni), si ha un forte accumulo di proteine unfolded. A questo stress

del reticolo endoplasmatico la cellula risponde fondamentalmente in due

modi :

la prima risposta (transitoria) è sulla traduzione, proprio per evitare

 questo accumulo di proteine che non possono essere processate in

modo corretto.

la seconda risposta (più definitiva) riguarda l’ induzione dell’

 espressione delle chaperonine, per cui sono fornite più chaperonine

per portare a compimento questo lavoro di folding delle proteine

depositate all’ interno del lume del reticolo.

(Unfolded Protein Response)

I 3 effettori più importanti dell’ UPR sono :

 IRE1 (inositol requiring kinase 1)

 ATF6 (activating transcription factor 6)

 PERK (double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR)-like

endoplasmic reticulum kinase) 7

IRE1 è sicuramente l’ effettore dell’ unfolded protein response più

famoso perché è stato inizialmente scoperto nel lievito, nel lievito è stato

caratterizzato e in questo è il recettore più importante dell’ UPR.

PERK media la prima risposta transitoria sulla inibizione della traduzione

delle proteine. Questa è una chinasi che fosforila il fattore della

eIF2a

traduzione che nella forma fosforilata è inattivo. Quindi si ha una

diminuzione della traduzione; effetto, però, transiente.

L’ UPR si sviluppa soprattutto attraverso l’ induzione della sintesi delle

chaperonine.

IRE1 e ATF6 mediano l’ induzione della sintesi delle chaperonine

attraverso l’ attivazione dell’ espressione di fattori specifici di trascrizione

per le chaperonine.

IRE1 è una chinasi ma, come vedremo, ha una serie di altre attività; ATF6

è un fattore di trascrizione ed è qui rappresentato che agisce sui geni per

le chaperonine come anche vi agisce IRE1, però indirettamente.

Quindi abbiamo una prima risposta mediata da PERK con inibizione della

traduzione e poi successivamente una risposta mediata da IRE1 e ATF6

con stimolazione dell’ espressione di geni per le chaperonine e quindi

produzione di chaperonine che entreranno nel reticolo endoplasmatico

attivando il folding.

Questi sono gli effetti dello stress del reticolo endoplasmatico : quando

c’è accumulo di proteine unfolded, la cellula risponde così. E’ un effetto

fisiologico che avviene normalmente. E’ molto interessante perché è

mediato da 3 e più fattori che vengono accumunati da caratteristiche

specifiche legate alla loro regione transmembrana. Questa è sensibile

8

alla presenza di proteine unfolded. Qui è rappresentata per IRE1 che è

una molecola estremamente complessa ma estremamente interessante.

Nella sua forma inattiva IRE1 è un monomero costituito da una regione

transmembrana legata a una regione che entra nel lume del reticolo

endoplasmatico e da una porzione che affaccia sul citoplasma. La

regione che affaccia internamente al RE, funziona come da tasca per le

proteine unfolded, quindi aperte, che possono entrare. Quello che

succede è che in presenza di questo tipo di interazione, IRE1 attiva una

sua attività intrinseca di chinasi. Ma è una chinasi che lavora sulla

autofosforilazione

proteina stessa e quindi si ha di IRE1.

dimerizzazione

L’ autofosforilazione porta alla di IRE1 e a un

cambiamento conformazionale della regione che affaccia sul citoplasma

che è rappresentato in questa forma inattiva e in questa forma attiva.

Questa regione è responsabile di un’ attività endonucleolitica, in

particolare un’ attività rivolta verso gli RNA.

Quindi IRE1 funziona da sensore delle proteine unfolded, funziona da

chinasi per cui tramite autofosforilazione ha un cambio strutturale e una

dimerizzazione e funziona da RNAasi.

Il target di questa attività RNAasica è una proteina presente nel

citoplasma che ha come prodotto un fattore di trascrizione per le

chaperonine. Nel lievito il trascritto si chiama Hac1, nei mammiferi

XBP1. Questo trascritto in assenza di proteine unfolded e quindi in

assenza di stress del reticolo endoplasmatico è presente in una forma

inattiva; il loop rappresentato in figura sta a rappresentare la non

traduzione di questo messaggero. 9

Quando si ha lo stress del reticolo, l’ accumulo di proteine unfolded va a

segnalare la porzione interna di IRE1 che dimerizza. La dimerizzazione e

l’ autofosforilazione attivano il suo dominio RNAasico che va a lavorare

sul messaggero andando a rimuoverne una piccola porzione che è un

piccolo introne. A questo punto viene liberato il messaggero che può

essere tr