Virologia e biotecnologie fitopatologiche

Caratteri generali dei virus

I virus costituiscono un regno a sé in quanto non hanno struttura e organizzazione cellulare. Sono agenti infettivi costituiti da una o più molecole di acido nucleico (DNA o RNA) di un solo tipo, normalmente incapsidate in un rivestimento lipoproteico, in grado di organizzare la propria replicazione entro una cellula ospite.

Definizioni

• Un sistema biologico elementare avente alcune caratteristiche in comune con le forme viventi (come, ad esempio, il genoma e la capacità di adattarsi ad ambienti diversi), ma profondamente differente in quanto non dotato di organizzazione cellulare.
• Acidi nucleici (singola o doppia elica) rivestiti da un capside proteico in grado di infettare gli organismi.
• Entità effettive, costituite da una o più molecole di un solo tipo di acido nucleico (RNA o DNA), rivestite da un capside proteico e in grado di moltiplicarsi solo in cellule vive.

Fitovirus

• I virus delle piante sono entità infettive e patogene, ossia in grado di insediarsi e moltiplicarsi all'interno di una pianta ospite, dando origine a un processo di infezione e causando eventualmente una malattia.
• Sono meno complessi rispetto ad altri patogeni delle piante, dai quali differiscono per forma, dimensioni e organizzazione genomica. Nella maggior parte dei casi la loro struttura è composta da un acido nucleico (DNA o RNA) e un rivestimento proteico detto capside.
• Nei fitovirus prevalgono i virus ad RNA a singola catena (ssRNA = single stranded RNA). Esistono anche virus a doppia catena di RNA (dsRNA = double stranded RNA), dsDNA e ssDNA.
• In tutti i casi, le informazioni contenute nell'acido nucleico virale sono necessarie per la replicazione del virus stesso e per regolare i suoi rapporti con la pianta e i vettori.

Forme e dimensioni

Ogni specie virale è costituita da particelle (virioni) che hanno una propria forma e proprie dimensioni. Le forme dei fitovirus sono riconducibili a tre tipologie fondamentali:

• Virus tubuliformi (o a forma allungata): hanno forma di un tubo, più o meno lungo a seconda della specie virale (100-2000 nm. Inferiori ai 400 nm: forma a bastoncino; oltre i 600 nm: aspetto filamentoso). Il diametro: 10-20 nm ed è solitamente minore.
• Virus isometrici (o isodiametrici o poliedrici o sferici): diametro 17-18 nm a 80-90 nm.
• Virus bacilliformi: hanno l'aspetto di un cilindro, per lo più con le estremità arrotondate.

Struttura e composizione

Una particella virale (o virione, a volte chiamato nucleocapside) è costituita da una o più molecole di acido nucleico, rivestite da subunità di natura proteica (capsomeri) legate all'acido nucleico ed ordinate in modo da formare un elemento di rivestimento detto capside.

Il capside protegge l'acido nucleico virale ed interviene anche nei processi di traslocazione del virus nella pianta ospite. In molti fitovirus (in quelli più semplici) i capsomeri sono costituiti da un solo tipo di proteina.

L'acido nucleico può essere costituito da RNA o DNA (mai da entrambi nello stesso virus). Il genoma monopartito ha l'informazione genetica distribuita su una molecola di acido nucleico, mentre il genoma multipartito ha l'informazione genetica distribuita su due, tre o più molecole di acido nucleico. In questo caso queste possono trovarsi nella stessa particella virale (virus monocomponenti a genoma diviso) o "incapsidate" singolarmente in particelle distinte (virus multicomponenti).

In tutti i casi però l'acido nucleico è formato da differenti regioni geniche codificanti (ORF) ovvero contenenti l'informazione per la sintesi di una proteina.

Il processo di replicazione

Ingresso del virus nella cellula

I virus hanno localizzazione intracellulare e dipendono totalmente dalla cellula ospite per la loro replicazione e per la regolazione del loro rapporto con la pianta. I virus non sono in grado di superare la cuticola integra delle cellule epidermiche della pianta: possono infettare solamente se si verifica una continuità di tessuti con un ospite già infetto (es. innesto) o se essi vengono introdotti nella pianta da un vettore o se immessi attraverso microlesioni del rivestimento cuticolare (es. potatura).

In ogni caso la penetrazione è un fattore passivo: i virus vengono immessi o trascinati all'interno della pianta.

Decapsidazione e traduzione dei geni precoci che esprimono proteine funzionali

Una volta che il virus è penetrato nella cellula, vi si insedia in modo irreversibile e dà subito inizio al processo di replicazione attraverso la decapsidazione e il disassemblaggio dell'involucro proteico (dovuto probabilmente a variazioni di ph). Il genoma virale agganciato dai ribosomi viene tradotto in proteine simultaneamente alla decapsidazione, sono tradotte prima le proteine funzionali o precoci che catalizzano la trascrizione/replicazione del genoma virale.

Replicazione (trascrizione) del genoma virale

Il processo replicativo porterà alla formazione di particelle virali identiche a quelle di partenza. L'RNA virale viene riconosciuto dai ribosomi della cellula ospite come RNA messaggero e attraverso questo meccanismo vengono codificate proteine atte alla sua replicazione.

L'RNA virale dà origine a una molecola di RNA complementare, la quale agisce come stampo per la sintesi di nuove catene di RNA (identiche a quelle originale del virus) o più corte. I virus hanno sviluppato diverse strategie di replicazione per la sintesi proteica al fine di poter far utilizzare dal sistema cellulare il loro RNA policistronici (gli RNA messaggeri sono monocistronici) e differenziare nel tempo e in quantità l'espressione di alcune proteine.

Strategie usate dai diversi virus per la lettura e la traduzione del messaggio virale:

• Poliproteina: Meccanismo di duplicazione dei virus più diffuso e più facile (proprio dei potivirus). Avviene nel citoplasma. La traduzione dell'RNA virale da quindi origine ad un'unica poliproteina, che successivamente viene idrolizzata; si formano così differenti proteine ed enzimi che sono necessari alla replicazione del virus, alla sua diffusione nella pianta e alla trasmissione mediante vettori. La proteolisi avviene ad opera di enzimi codificanti dallo stesso genoma virale.
• Sintesi di RNA subgenomici (TMV, Closrovirus, PVXl): Questa strategia consente ai virus di esprimere i geni e sintetizzare le proteine situati all'interno del loro RNA genomico. La formazione di RNA subgenomici fa sì che le proteine a valle delle ORFl si trovino sempre in posizione terminale S' dell'RNA.
• Frameshift: La lettura della sequenza dell'RNA virale può "slittare" di un nucleotide (in avanti o indietro), dando così la possibilità di ottenere dalla stessa sequenza due o tre prodotti genici differenti.
• Readthrough: Superamento dell'informazione di arresto (stop codon) della traduzione: così il virus, a seconda delle sue necessità, ha la possibilità di sintetizzare due proteine aventi dimensioni e caratteristiche differenti.

La replicazione per i virus a RNA avviene nel citoplasma, mentre per i virus a DNA avviene principalmente nel nucleo della cellula.

Traslocazione nella pianta

Diffusione nell'ospite: la diffusione del virus o del suo acido nucleico avviene dapprima da cellula a cellula e poi a lunga distanza attraverso il sistema vascolare. Possono diffondersi sia attraverso il floema (più frequentemente e in maggiore quantità in quanto i vasi floematici sono costituiti da elementi vivi, determinando un ambiente favorevole) che lo xilema.

Un fenomeno piuttosto frequente, soprattutto nelle piante legnose, è l’assenza di virus nei meristemi apicali.

I rapporti patogeno-pianta

Diffusione e movimento dei virus

Un virus, una volta avviata la replicazione in una cellula, non rimane confinato in essa, ma tende a diffondersi nell'ospite in due momenti fondamentali:

• Trasferimento a breve distanza, da cellula a cellula, tramite plasmodesmi o strutture tubulari che si estendono attraverso la parete cellulare.
• Trasferimento a lunga distanza, o diffusione sistemica, attraverso i tessuti conduttori (tipicamente floema).

Solitamente la localizzazione è il risultato dell'interazione incompatibile tra virus e ospite, che si manifesta con la reazione di ipersensibilità.

Proteine di movimento (MP) da cellula a cellula

• Codificate dal virus, le quali inducono un aumento del limite di esclusione dei plasmodesmi (SEL). Attraverso la sintesi di queste molecole i virus possono passare attraverso i plasmodesmi o come un complesso nucleo-proteico in cui le MP si legano all'acido nucleico o come virioni.
• Sono geneticamente intercambiabili (ma non sempre).
• Possono complementare la mancanza di movimento in un ospite particolare.
• Possono far superare restrizioni legate al tipo di tessuto in cui il virus si replica.

Trasporto intercellulare attraverso i plasmodesmi (PD) con due meccanismi:

• Modificazione permeabilità del plasmodesma.
• Modificazione struttura del plasmodesma (tuboli inseriti nella parete o nei PD che hanno perso i desmotuboli). Le particelle virali passano attraverso questi tuboli alla cellula adiacente.

Il trasporto a lunga distanza richiede che il virus possa superare le cellule della guaina del fascio, quelle del parenchima floematico ed i tubi cribosi.

Principali espressioni sintomatologiche dei virus

Non sempre a un'infezione virale in atto, corrisponde la manifestazione di sintomi da parte della pianta infetta. In generale i sintomi causati da fitovirus si notano sia sulla parte aerea sia su quella ipogea. Sviluppo della pianta fortemente rallentato fino ad arrivare a nanismo e rachitismo. Internodi corti e foglie e fiori di piccole dimensioni.

Malformazioni dei diversi organi. Alterazioni di colore: a mosaico, variegatura (longitudinali), striatura (lineari), maculatura (anulari), necrosi nelle fasi più avanzate.

Epidemiologia

Trasmissione per parti di pianta

Trasmissione meccanica o per succo

• Anche indicata con i termini "trasmissione per contatto" e "trasmissione per strofinamento".
• Contatto tra il succo fuoriuscito o estratto da una pianta infetta e la superficie meccanicamente lesa di un organo di una pianta sana.
• Tipo di trasmissione piuttosto rara in natura (TMV).
• Usata, per la sua semplicità, nelle prove sperimentali su piante di saggio indicatrici (importanza diagnostica).

Trasmissione per propagazione vegetativa e per innesto

• I virus generalmente invadono la pianta infetta in ogni sua parte. La propagazione vegetativa (per talea, tuberi, rizomi…) è una via di diffusione estremamente efficace.
• Essendo infetta ogni porzione che si preleva da una pianta virosata, risulta infetta tutta la discendenza che da questa deriva. Si ha cioè il 100% di trasmissione infezioni (salvo eccezioni).

Trasmissione seme

• Trasmissioni non superiori al 30%. Ottimo mezzo di conservazione e diffusione dei virus in quanto:
  • Il virus si mantiene a lungo infettivo nel seme anche per anni (la sua infettività comunque dura solitamente meno della vitalità del seme).
  • I semi, poiché per motivi commerciali vengono trasportati, rappresentano il mezzo più efficace di diffusione a lunga distanza.
  • Molti virus trasmissibili per seme possono essere trasmessi anche da vettori molto efficaci (come gli afidi).
• La trasmissione per seme può essere embrionale (virus nell'embrione) o non-embrionale (virus circoscritti al tegumento seminale).
• La modalità di trasmissione non-embrionale è propria di quei virus molto stabili ed in grado di mantenersi infettivi per molto tempo nei semi disseccati e sono facilmente inoculabili per contatto (attraverso microlesioni formatesi durante lo sfregamento delle cotiledoni contro i tessuti di rivestimento nel seme quando si sviluppano e si distendono (trasmissione seme-contatto).
• La trasmissione embrionale può essere diretta o indiretta ma in entrambi i casi l'infezione è resa difficile sia dalla mancanza di connessioni vascolari fra i tessuti della pianta madre e il polline, la cellula uovo (oosfera), il sacco embrionale e lo stesso embrione, sia dalla degenerazione dei plasmodesmi durante le divisioni meiotiche che portano alla formazione di gameti maschili, di una cellula uovo e di nuclei polari aploidi.
• I virus che si trasmettono per seme presentano alcune caratteristiche comuni:
  • Sono facilmente trasmissibili per via meccanica.
  • Provocano in genere mosaici o maculature clorotiche.
  • Inducono la comparsa di sintomi evidenti nel periodo immediatamente successivo all’infezione (fase acuta) che poi si attenuano fino a scomparire del tutto quando l'infezione entra in fase cronica.
• Fattori che influenzano la % di semi infetti:
  • Virus e ceppi virali.
  • Pianta ospite e varietà.
  • Temperatura ed età del seme.
  • Epoca in cui la pianta madre ha contratto la malattia.

Trasmissione per polline

• Il polline, oltre ad agire da vettore di virus nel sacco embrionale, in alcuni casi determina anche la trasmissione di un virus direttamente da una pianta all'altra. Questo avviene quando le particelle virali trasportate dal polline si diffondono ai tessuti della piante portatrice dei fiori impollinati.
• Questa trasmissione avviene anche grazie all'azione dei tripidi che si sporcano le zampe e trasmettono spostandosi lungo la superficie e rompendo occasionalmente i tricomi.

Trasmissione per vettori

• Vettore: qualsiasi organismo capace di trasmettere un patogeno (e quindi anche un virus) da una pianta all'altra.
• Esiste un adattamento anche molto specifico tra il patogeno e l'insetto (vettore).
• Questi, dopo una fase di acquisizione e di latenza (o incubazione) risulta capace di trasmettere la malattia nella fase di inoculazione, anche per un lungo periodo di tempo (persistenza).
• Durante l'incubazione il patogeno entra spesso in circolo nel vettore:
  • Penetrando nelle sue ghiandole salivari da dove può essere inoculato (trasmissione circolativa).
  • Può addirittura replicarsi (virus) o moltiplicarsi (batteri, fitoplasmi) all'interno del vettore (trasmissione propagativa).
  • Penetrare nelle sue gonadi ed essere trasmesso ai suoi discendenti.

Esempio di vettori di virus

• Insetti: Non persistente, Semipersistente, Circolativo, Persistente, Propagativo.
• Aracnidi.
• Nematodi.
• Funghi.

Trasmissione per insetti

La trasmissione di un virus mediante vettori è un processo caratterizzato da specifiche relazioni biochimico-fisiche tra virus e vettore che si riflettono sui tempi e le modalità di trasmissione. Nel caso di vettori animali la trasmissione del virus si realizza tramite le seguenti fasi:

Periodo di acquisizione

• Tempo di alimentazione sulla pianta infetta necessario per poter acquisire una sufficiente quantità di virus.