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ANTICORPALI
[Malattia autoimmunitaria → è una reazione immunitaria contro un antigene self].
Diagnosi.
Indagini immunologiche.
ANA.
L'anticorpo principale che troviamo sono gli ANA. Sono immunoglobuline antinucleo, cioè rinveniamo all'immunofluorescenza
anticorpi contro strutture self. Non ci sono solo nel Lupus, ma anche in:
• scleorsi sitemica,
• sindrome di Sjogren,
• nelle neoplasie,
• malattie infettive croniche (CMV, EBV, TBC).
L'ANA positività aumenta con l'età. Ci sono in donne giovani e anche in pz che prendono farmaci.
Il materiale nucleare è potenzialmente antigenico e ogni volta che abbiamo morte cellulare per necrosi, il materiale nucleare può
diventare antigenico. Nell'apoptosi, invece il materiale nucleico è protetto da un bilayer.
Come si studiano gli ANA?
Con l'IFI (immunofluorescenza indiretta): A un substrato costituito solitamente da cellule HEp-2 (cellule epiteliali di carcinoma
laringeo) che presentano nuclei in attiva replicazione e hanno forma fusata aggiungo il siero del paziente. Lascio in incubazione per ½
ora, aggiungo un anticorpo antisiero (anti-IgG) marcato con fluoresceina, lavo per eliminare eventuali residui di fluoresceina e osservo
almicroscopio. Se nel siero del paziente sono presenti ANA, si formeranno immunocomplessi visibili che, a seconda dei pattern di
distribuzione, potranno essere riconducibili a diversi quadri patologici.
Sono sensibili per il LES, ma poco specifici. E’ un esame qualitativo-semiquantitativo perché posso rendere il siero del paziente e
titolarlo.
Rappresentano un esame di screening in un paziente con sospetta connettivite.
Al microscopio a fluorescenza bisogna dire:
• se è positivo (valutazione qualitativa)
• quanto è positivo (valutazione semi-quantitativa). Per capire quanto è positivo occorre fare delle diluizioni successive del
siero (x es. partiamo da una diluizione 1:80 → 1 di siero e 80 di tampone. Se è ancora positivo diluisco ulteriormente 1:160;
1:320; 1:640 fino a quando non si negativizza). Pertanto trovare una positività alta per ANA o un pattern omogeneo, aumenta
il sospetto di LES.
Nella quasi totalità delle pz lupiche abbiamo diversi pattern:
• Il pattern omogeneo è il risultato del legame tra una miriade di antigeni nucleari e una miriade di anticorpi antinucleo che
finiscono per colorare diffusamente e omogeneamente tutto il nucleo, senza lasciare zone scoperte; si tratta quindi di una
reazione antigeneanticorpo globale, totale. Tale pattern non è riconducibile a un quadro patologico specifico. Se all’esame
di screening vediamo pattern omogeneo, in genere ci fermiamo, diciamo ANA positivi, possiamo dire le dimensioni (1:170,
1:1200 ecc.), ma non possiamo andare avanti con la tipizzazione degli antigeni.
• Nel pattern punteggiato invece la reazione è diretta verso specifici antigeni. Può presentarsi a piccoli punti (“fine speckled”)
o a zolle, “COARSE SPECKLED”, di aspetto granulare. Nella sclerodermia, in particolare, abbiamo anticorpi rivolti contro
i nucleoli. Quando abbiamo il pattern punteggiato dobbiamo andare a valutare gli ENA (Anticorpi anti antigeni nucleari
estraibili), che si studiano in immunoblotting o con ELISA. Il pattern punteggiato a volte nasconde una positività per il
CENTROMERO; si vedo proprio il fuso mitotico e per questo si usano cellule ad alta attività replicativa come quelle
tumorali. Spesso è presente solo una cellula su 100, ma deve essere sempre cercato. La positività per il centromero è
suggestiva di Sclerodermia.
• Viceversa c’è anche il pattern nucleolare in cui sono colorati solo i nucleoli e tutto il resto del nucleo è scuro, esattamente
al contrario rispetto al pattern punteggiato, come se fosse il negativo.
• Abbiamo anche il pattern che mette in evidenza gli anticentromero (simile al coarse speckled, con granuli brillanti), che
ritroviamo in una variante della sclerosi sistemica.
• Infine abbiamo il pattern periferico in cui il nucleo si presenta come una ciambella, con la fluorescenza che si distribuisce
solo alla periferia e non al centro. Da una serie di studi, condotti con immunofluorescenza, si è visto che questo pattern
correla con la presenza di anticorpi anti ds-DNA. Questo pattern è ancora più suggestivo, perché un pattern omogeneo può
anche avere gli ENA negativi, ma quello periferico suggerisce la presenza di Ab anti ds-DNA. Quando vediamo il pattern
periferico, poiché come dimostrato da studi di correlazione su ampie casistiche un pattern di questo genere è al 100%
correlato con la positività degli anti-dsDNA, dobbiamo procedere con la ricerca di questi specifici anticorpi, per confermarne
la presenza.
In entrambi i vetrini riconosciamo una fluorescenza antinucleare. Quando guardiamo un ANA, non ci possiamo fermare ad una
diluizione del siero. Avendo una tecnica che è grossolana, il modo per vedere gli anticorpi è diluire il siero progressivamente. Il
pattern è molto importante. Oltre che l'ultima diluizione a cui vediamo l'anticorpo, anche il pattern è importante.
Nel LES possiamo trovare quasi ogni tipo di pattern. Il pattern ci aiuta poco.
Pertanto nella Sclerodermia esistono 2 pattern specifici:
• Anti centromero
• Anti nucleolo
[A differenza dell’immunofluorescenza che non ci dice qual è l’antigene ma solo se è presente o meno, l’ ELISA mi permette di
conoscere l’antigene poiché ne uso uno solo per volta.
Mettiamo un singolo antigene sulla piastra, questa viene rivertita con la procedura di “coping”, quindi prendiamo il siero del paziente,
lo lasciamo incubare, il siero aderisce alla piastra, si effettuano una serie di lavaggi e poi lo marchiamo anziché con un fluorocromo,
con altre sostanze che poi allo spettrofotometro danno un viraggio di colore nel momento il cui aggiungo il secondo anticorpo. In
questo caso ho una positività verso uno specifico antigene.
Nell’Immunoblotting si ha un substrato che di solito è un AGAR gel in cui si fanno correre gli antigeni, di cui quindi conosco la
posizione nella striscia. Si lascia reagire l’antigene con l’anticorpo e si va ad osservare la linea di precipitazione a cui corrisponderà
una linea di controllo che mi dice di quale antigene si tratta. Questa è una metodica altamente specifica che mi permette di tipizzare
l’antigene].
Anti ds-DNA.
È sempre una metodica con fluorescenza, ma si utilizza un altro substrato rappresentato da un protozoo, la Crithidia Luciliae, dotato di
un flagello, di un nucleo, e un altro corpicciolo che è il kinetoplasto.Il nucleo di questo protozoo è caratteristicamente composto
interamente da ds-DNA, è come se fosse un substrato di solo ds-DNA.
Gli anti-dsDNA sono diversi dagli ANA, perchè hanno una specificità per il LES elevatissima. Abbiamo una dismissione molto
abbondante contro DNA a doppia elica, che non dovrebbe essere presente fuori dalla cellula. Con buona approssimazione, se dosiamo
il ds-DNA e lo troviamo positivo, il pz ha il LES; oppure il lab ha fatto un errore. La sensibilità cmq non è altrettanto alta. Non
tutti i pz con LES sono positivi al ds-DNA.
Per gli anti dsDNA ho Specificità 95% e Sensibilità 50-70%. Questo significa che circa la metà dei pazienti con LES può non
presentare una positività per il dsDNA.
ENA.
Abbiamo poi una serie di anticorpi che sono gli ENA che sono gli antigeni nucleari estraibili. Sono antigeni su cui possiamo dosare gli
anticorpi e che ci orientano sulla malattia del pz. Quelli che più si associano al LES sono:
• anti-SM (spec99% e sens 25%).
• anti-SM RNA
• anti-Ro,
• anti-La
• anti-RNP che sono presenti anche in altre patologie.
• Anti-istone
• anti-fosfolipidi (anticoagulante lupico e anti-cardiolipina)→ in questi casi si hanno falsi positivi nella reazione della VDRL
per la sifilide.
• Scl 70 (specifico della sclerodermia) → Gli anti SCL70 e gli anticentromero differenziano due subsets di sclerodermia:
1. Gli anti SCL70 → la forma più aggressiva, nella Sclerosi sistemica progressiva
2. Gli anticentromero → Nella variante limitata, chiamata Sindrome CREST (C = carcinosi, R = Raynaud, E = esofagite, S =
sclerodattilia, T = telangectasia) che ha una prognosi nettamente migliore.
• Jo-1 (specifici della polimiosite e dermatomiosite)
• CENP (proteina B centromerica)
Gli anticorpi anto-Ro/SSA e anti-La/SSB sono presenti soprattutto nella sindrome di Sjogren, anche se possono identificare un lupus
neonatale o un lupus cutaneo. Gli anticorpi anti-istone e anti-ssDNA sono troppo aspecifici per una diagnosi.
Dati di laboratorio:
• VES → elevata in quasi tutti i pz con malattia attiva,
• PCR → normale o poco aumentata.
• Gammaglobuline → aumentate spesso come espressione dell’attività policlonale dei linfociti B.
• Complemento → generalmente diminuito “da consumo”, anche se talvolta può essere espressione di un deficit congenito di
complemento (spesso associato al LES); le frazioni dosate sono C3 e C4.
Criteri diagnostici aggiornati (hochberg, 1997).
Visto che il LES è eterogenea e colpisce tutti gli organi, come facciamo diagnosi? Come ci mettiamo d'accordo con gli studi clinici?
Per la diagnosi devono essere soddisfatti 4/11 di questi criteri, anche non contemporaneamente presenti. Questo ci permette di fare
diagnosi con specificità del 95% e sensibilità dell’85%. Tali criteri sono significativi ma non diagnostici, rappresentano una guida ma
la diagnosi rimane comunque legata all’esperienza del clinico.
1. Rash Malare
2. Rash Discoide
3. Fotosensibilita'
4. Ulcere Orali
5. Artrite non erosiva, che coinvolge due o più articolazioni;
6. Sierosite: pleurite o pericardite;
7. Alterazioni Renali:
• proteinuria persistente (>di 0,5 g/die o 3+ se non quantizzata);
• o cilindri cellulari (di emazie, di emoglobina, cellulari, misti);
1. Alterazioni Neurologiche:
• criteri American College of Rheumatology (anche se nel 1997 restavano solo convulsioni e psicosi)
1. Alterazioni Ematologiche:
• anemia emolitica;
• o leucopenia (<4.000 mm3 in 2 o più esami);
• o linfopenia (<1.500 mm3 in 2 o più esami);
• o trombocitopenia (<100.000);
1. Alterazioni Immunologiche:
• anticorpi anti dsDNA con titolo alto o anticorpi anti-Sm; (specifici)
• o anticorpi antiPL (antifosfolipidi):
• elevati livelli sierici di aCL (antiCardioLipina) IgG/M
• LAC positivo (lupusanticoagulant)
• o falsa positività per la lue > di sei mesi;
1. Anticorpi Antinucleari:
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