LTA Microbiologiche, laboratorio di tecnologie abilitanti

LTA microbiologia: protocolli sperimentali per l’isolamento e la crescita di microrganismi

Le tecniche di sterilizzazione

Lo scopo della sterilizzazione è quello di distruggere o allontanare a un limitato settore (soluzioni, recipienti, utensili) batteri, spore, funghi, muffe, virus…

• Mezzi fisici
• Mezzi chimici
• Mezzi meccanici

L’azione battericida è progressiva. Questi processi possono venire tra loro combinati.

Mezzi fisici

Prevede l’utilizzo del calore. Un mezzo fisico di sterilizzazione. Il calore coagula le proteine plasmatiche e uccide i batteri. Nella loro forma vegetativa, la maggioranza dei batteri in un mezzo acquoso è distrutta da un riscaldamento fra i 52 e i 60°, per un periodo di 10-60 minuti. Le spore sono protette da un involucro ceroso: si possono distruggere mantenendoli a 115° per 1 ora.

La durata del periodo di riscaldamento ha una grandissima importanza. Il logaritmo della durata di sterilizzazione è inversamente proporzionale alla temperatura: un abbassamento da 115 a 105° dovrà essere compensato da un aumento della durata di almeno 6-7 volte!

Per la sterilizzazione, può essere usato sia il calore secco che il calore umido.

• Fiamma libera (Bunsen)
• Aria secca: stufa a doppia parete con aria a circolazione forzata. La temperatura standard di sterilizzazione in stufa è di 160°C, mentre il tempo standard di sterilizzazione in stufa è di 3 ore.

È possibile utilizzare il calore umido attraverso la sterilizzazione sotto pressione (autoclave). L’autoclave permette di sterilizzare a temperature molto inferiori rispetto al calore secco. L’umidità agisce sulle membrane delle spore, aumentandone la permeabilità.

I vantaggi del vapore acqueo sono:

• Alta percentuale di altre in rapporto al peso e al volume
• Cede il calore a una temperatura costante e controllabile
• Economico e abbondante
• Inodore, insapore, non tossico
• Facilmente distribuibile

La temperatura standard di sterilizzazione in autoclave è di 120°-121°C. I tempi standard di sterilizzazione in autoclave sono 20-30 minuti.

Radiazioni

Un altro mezzo fisico usato per la sterilizzazione oltre al calore consiste nelle radiazioni. Possono essere usati:

• Raggi UV (risultano però poco penetranti)
• Raggi gamma (viene utilizzato il Cesio 137. I raggi gamma causano danni alle proteine e al DNA) vengono usati su materiale già confezionato
• Raggi beta (bombardamento elettronico). Si tratta di sostanze termolabili. Permettono una sterilizzazione di massa continuativa ma hanno come svantaggi l’alterazione delle sostanze trattate, il pericolo e il costo

Mezzi chimici

I mezzi chimici di sterilizzazione prevedono l’uso di batteriostatici e disinfettanti da banco oppure la sterilizzazione con gas (ossido di etilene). Quest’ultimo metodo provoca alchilazione irreversibile delle proteine. Si tratta di un metodo molto usato per polveri, strumenti in plastica, prodotti già imballati, indumenti e bende. Tuttavia, non funziona sui liquidi.

Mezzi meccanici

Il metodo di sterilizzazione meccanico più usato è la filtrazione. Si utilizzano filtri a membrana con porosità controllata per allontanare dalla soluzione le particelle indesiderate.

Preparazione asettica

Non è una metodica di sterilizzazione, ma un modo per assemblare i vari componenti garantendo il mantenimento della sterilità. Si esegue in ambiente sterile, meglio se nel “blocco sterile” a partire da materiale già sterilizzato con altra metodica.

Sterilità dell’aria e flusso laminare

Non è possibile garantire sterilità assoluta dell’aria. I filtri “assoluti” (HEPA) trattengono solo il 99,97% delle particelle. Nel flusso laminare tutta l’aria si muove a velocità uniforme lungo vie di flusso parallele, con il minimo di turbolenza. Viene utilizzato il flusso laminare per la sterilità nei laboratori.

Introduzione all’osservazione dei microrganismi

I microrganismi si possono distinguere in colonie isolate, colture pure e cloni singoli. A livello morfologico, le colonie possono essere classificate seguendo questo schema.

Il microscopio

Le proprietà fondamentali del microscopio sono:

• Ingrandimento: nel caso di un microscopio composto, è il prodotto fra ingrandimento dell’oculare e quello dell’obiettivo
• Potere di definizione: è un parametro legato alla qualità delle lenti
• Potere di risoluzione: è la capacità di distinguere due punti come separati. Il limite di risoluzione dell’occhio umano è 0.1 mm.

La risoluzione vale: 0,61 · λ/n, dove 0,61 è una costante legata alle caratteristiche della vista, λ è la lunghezza d’onda della luce usata per osservare, n è l’indice di rifrazione del mezzo interposto tra preparato e obiettivo. In acqua n=1,3. Il limite di risoluzione minimo raggiungibile è 0.2 μm.

La percezione del campione in esame deriva dal contrasto tra le sue parti e/o tra il campione e il mezzo in cui è immerso. Gli organismi viventi assorbono pochissimo la luce. La colorazione (tramite un colorante) aumenta il contrasto tra il campione e il mezzo.

Gli oggetti visti in campo chiaro hanno poco contrasto; per migliorare le immagini è possibile sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare rispetto al mezzo circostante applicando nel condensatore delle variazioni di fase alla luce che raggiunge il preparato e applicando variazioni opposte nell’obiettivo: i raggi luminosi che sono stati modificati saranno soggetti a fenomeni di interferenza che li renderanno più chiari o più scuri. Per fare ciò, si utilizza il microscopio a contrasto di fase.

Valutazione della composizione microbica presente in un campione naturale

La valutazione della composizione microbica presente in un campione di origine naturale viene effettuata tramite la tecnica della conta vitale in piastra per diluizioni decimali. Il numero delle colonie che si svilupperanno su ogni piastra sarà funzione della carica microbica presente nel campione di partenza e della diluizione effettuata. Moltiplicando il numero di colonie contate sulla piastra per il fattore di diluizione (10ⁿ) si potrà risalire al numero di cellule presenti nel campione di partenza, e in grado di crescere nelle condizioni fornite, per unità di volume.

La presenza di batteri sporigeni nel campione di partenza viene rilevata mediante un trattamento di pastorizzazione che consente di eliminare le forme vegetative. Per la pastorizzazione, la provetta contenente la sospensione viene posta a 80°C per 10 minuti e successivamente la sospensione viene piastrata.

La determinazione della carica microbica per unità di volume fornisce un dato quantitativo, mentre la determinazione della morfologia di singole colonie rappresenta l’aspetto qualitativo dell’analisi. Come terreni colturali possono essere usati Nutrient Agar (NA) per batteri aerobi ed anaerobi facoltativi, Malt Agar (MA) per eumiceti.

Determinazione della carica microbica totale, sporigena e degli eumiceti

Ci si propone di analizzare la carica microbica del campione di partenza che è stato piastrato e incubato. In funzione della carica microbica del campione di partenza, si assisterà a una differente crescita (n.b.: il numero di colonie presente sulle piastre corrispondenti alle diverse diluizioni dipende anche dall’errore sperimentale effettuato diluendo il campione stesso).

Per determinare il numero di batteri o lieviti o, più precisamente...