LTA Immunologia, laboratorio di tecnologie abilitanti

LTA immunologiche

Protocolli sperimentali per produzione di anticorpi monoclonali e altri saggi immunologici

Difesa immunitaria

La difesa immunitaria prevede due linee di difesa:

• L’immunità innata (naturale o aspecifica), attuata da macrofagi, neutrofili e linfociti NK. Questa difesa si realizza a livello dei tessuti periferici (epiteliali, connettivi, ecc.).
• L’immunità adattiva (acquisita o specifica), attuata dai linfociti. Nello specifico, i linfociti B sono responsabili della risposta umorale e della produzione di anticorpi, mentre i linfociti T sono responsabili della risposta cellula-mediata. Questa difesa si realizza a livello di organi linfoidi secondari (Linfonodi, Milza, MALT). L'immunità adattiva comprende l’immunità umorale e quella cellula-mediata.

I linfociti nella difesa immunitaria

I linfociti sono responsabili delle risposte immunitarie adattive. Le cellule T e le cellule B sono morfologicamente identiche quando non sono stimolate. Quando vengono stimolate da un antigene, si “attivano” e iniziano a differenziarsi. Le cellule B attivate diventano plasmacellule mentre le cellule T attivate diventano linfociti T helper e linfociti T citotossici.

Si ricorda che un antigene è una qualsiasi sostanza che può legare uno specifico anticorpo (proteine, carboidrati, acidi nucleici, molecole organiche). I linfociti migrano dagli organi linfoidi primari verso quelli secondari.

Immunità specifica

La Teoria della selezione clonale prevede che ogni organismo produca, soprattutto durante i primi anni di vita, un'enorme varietà di linfociti diversi in piccole quantità (cloni). Solo quelli che vengono in contatto con antigeni specifici possono proliferare. Il sistema immunitario adattivo funziona per selezione clonale.

Le cellule B e T stimolate dall’antigene specifico proliferano e maturano:

• Alcune producono una risposta immunitaria primaria.
• Altre cellule danno origine a cellule della memoria e producono una risposta immunitaria secondaria.

La risposta primaria, dopo l’incontro con un nuovo antigene, è lenta e poco efficace. La risposta secondaria è più rapida ed efficace. Le cellule con memoria immunitaria infatti sono già presenti e danno origine a cellule attivate che producono anticorpi.

Le cellule B: la produzione di anticorpi monoclonali

I linfociti B legano l’antigene, viene stimolata la riproduzione di cellule B e queste cominciano a differenziarsi in plasmacellule e cellule della memoria. Le plasmacellule producono anticorpi solubili mentre le cellule della memoria manifestano l’anticorpo sulla superficie. Il legame degli anticorpi con gli antigeni inattiva questi ultimi in vari modi.

Le immunoglobuline

Le immunoglobuline (gli anticorpi) sono delle proteine formate da catene leggere e catene pesanti tenute assieme da ponti di solfuro intra-catena e inter-catena. Esistono cinque classi di anticorpi (IgM, IgD, IgG, IgA e IgE). Queste classi possono essere distinte dalle differenze presenti nelle catene pesanti. Le differenze nelle catene pesanti (le regioni di coda) conferiscono distinte proprietà funzionali alle classi di anticorpi.

Ad esempio, nell’uomo, l’organizzazione strutturale dei principali isotopi delle Ig è questa. La produzione degli anticorpi può avvenire nei confronti di:

• Antigeni timo dipendenti, Ag TD, antigeni proteici, componenti virali, complessi aptene-carrier. In questo caso, la produzione degli anticorpi richiede l’attivazione delle cellule B da parte dei LT helper (CD4+, TH2). L’Ag viene ingerito da un fagocita (DC, MO), presentato alla cellula T helper che attiva la cellula B causandone la trasformazione in plasmacellula.
• Antigeni timo indipendenti, Ag TI, antigeni polivalenti con epitopi ripetuti (proprietà tipiche dei polisaccaridi batterici, polimeri proteici, lipopolisaccaridi, glicolipidi, acidi nucleici). Vanno direttamente:
• Sui recettori delle cellule B (immunoglobulina).
• Sul recettore del sistema immunitario innato (TLR).

Determinanti antigenici (epitopi)

Il sito specifico di un antigene che lega un anticorpo è chiamato determinante antigenico o epitopo. Molti antigeni hanno una varietà di epitopi che generano un numero di anticorpi differenti che sono chiamati policlonali. Un singolo ideotipo di anticorpo per un antigene è chiamato monoclonale.

Immunizzazione, immunogeno e adiuvante

L’immunizzazione è l’induzione deliberata di una risposta immunitaria. Un immunogeno è una qualsiasi sostanza in grado di scatenare una risposta immunitaria. Per ottenere una risposta immunitaria forte nei confronti di antigeni proteici è fondamentale che l’antigene sia iniettato insieme ad un adiuvante. Gli adiuvanti convertono gli antigeni proteici solubili in materiale particolato (più immunogenico). Inoltre, gli adiuvanti consentono un rilascio lento/prolungato dell’antigene. La maggior parte degli adiuvanti contiene componenti microbici che incrementano l’immunogenicità della preparazione. Un adiuvante è quindi una qualsiasi sostanza che incrementa l’immunogenicità delle sostanze ad essa mescolate.

Sterilizzazione

La sterilizzazione è il processo che si prefigge di distruggere su un substrato o in un determinato ambiente tutte le forme di vita, spore comprese. La sterilizzazione è perseguibile con:

• MEZZI FISICI (Filtrazione, calore e radiazioni).
• MEZZI CHIMICI.

Sterilizzazione con calore

Il calore è considerato il mezzo più sicuro, rapido ed economico per qualsiasi materiale che non sia termolabile. Il tempo di sterilizzazione decresce con l’aumentare della temperatura. Il calore può essere usato essenzialmente in due modi:

• SECCO
• UMIDO

In entrambi i casi, l’azione biocida del calore deriva dall’ossidazione dei costituenti cellulari con denaturazione irreversibile degli enzimi e delle strutture proteiche. La sensibilità del calore varia in rapporto al loro contenuto in acqua: più questa è alta, più sensibili sono i microorganismi al calore.

La sterilizzazione con il calore può essere ottenuta usando:

• Calore secco:
  • Incenerimento
  • Stufa di Pasteur
• Calore umido:
  • Ebollizione
  • Autoclave (vapore saturo)

Il principio fisico che sta alla base dei due diversi metodi è che il vapore è un migliore conduttore termico rispetto al calore secco, cioè: a parità di temperatura, la sterilizzazione è raggiunta in un tempo minore.

Per calore secco si usano le Stufe Pasteur o a secco in cui il calore si trasmette per convezione o irraggiamento dalle pareti della stessa. Utile per materiale termoresistente, non corrode. Per il calore umido invece, l’ebollizione è dell’acqua il metodo più semplice per la sterilizzazione e di oggetti in essa immersi o dei recipienti stessi. L’ebollizione va prolungata per almeno 20 minuti.

Per sterilizzazione con vapore saturo sotto pressione, si utilizza l’autoclave. Il ciclo di base è 121 °C per 15 minuti ad 1 atm. I parametri di funzionamento dell’autoclave sono:

• Temperatura
• Tempo
• Pressione

Sterilizzazione con radiazioni

La sterilizzazione può anche avvenire attraverso l’uso di radiazioni. Si usano:

• Radiazioni ionizzanti. I raggi gamma sono fotoni ad elevata energia. Le radiazioni ionizzanti agiscono trasferendo la loro energia all’interno della cellula colpita, la cui sensibilità è proporzionale alla quantità di DNA presente, che viene alterato. Tutto il materiale di plastica di solito è sterilizzato con radiazioni gamma.
• Raggi UV. Si tratta di radiazioni elettromagnetiche (elettroni). Risultano poco penetranti ed agiscono per trasformazione fotochimica delle basi pirimidiniche del DNA cellulare. La sterilizzazione con i raggi UV è adoperata soprattutto nei laboratori scientifici per trattare l’aria. Il tempo di esposizione può essere permanente e l’esposizione deve avvenire quando i locali trattati non sono utilizzati. Questo perché i raggi UV sono molto irritanti per le mucose (occhi in particolare).