LTA Immunologia, laboratorio di tecnologie abilitanti

Descrizione delle cellule in coltura

Le cellule in coltura sono in genere descritte in base alla loro morfologia (forma e aspetto) o alle loro caratteristiche funzionali. Esistono tre morfologie di base:

• Epiteliali: cellule che sono attaccate a un substrato e appaiono piatte e di forma poligonale
• Linfoblastiche: cellule che normalmente non sono attaccate a un substrato ma rimangono in sospensione con una forma sferica
• Fibroblastiche: cellule che sono attaccate a un substrato e appaiono allungate e bipolari, nelle colture molto ricche formano spesso vortici

È importante ricordare che le condizioni di coltura svolgono un ruolo importante nella determinazione della forma e che molte colture cellulari sono in grado di mostrare diverse morfologie.

Il mezzo extracellulare comprende:

1. Fase gassosa
2. Temperatura
3. Terreno di coltura
4. Substrato di adesione

La fase gassosa deve avere saturazione umidità. È presente CO2 prodotta dalle cellule e CO2 fornita alla concentrazione

del terreno di coltura è fondamentale per garantire la crescita e la sopravvivenza delle cellule in vitro. I terreni di coltura più comuni includono l'IMEM, il DMEM e l'RPMI. Questi terreni differiscono tra loro per il contenuto di aminoacidi, sali e la concentrazione di glucosio. L'IMEM è un terreno completo che contiene tutti gli aminoacidi essenziali, sali e una concentrazione di glucosio di solito intorno al 5%. Il DMEM è simile all'IMEM, ma ha una concentrazione di glucosio più elevata, di solito intorno al 10%. L'RPMI è un terreno specifico per le colture di linfociti e ha una composizione diversa rispetto agli altri terreni. Il pH del terreno di coltura è mantenuto intorno a 7.2-7.4 utilizzando un sistema tampone a base di bicarbonato/acido carbonico. Il pH viene monitorato utilizzando un indicatore come il rosso fenolo, che diventa giallo a pH acido e rosso-viola a pH alcalino. Le cellule di mammifero crescono in genere a una temperatura di 37 °C, in un ambiente umido e tamponato a pH circa 7.3. Queste condizioni sono ottimali per la crescita e la sopravvivenza delle cellule in vitro. La crescita delle cellule in vitro è garantita dalla presenza di elementi nutritivi di base come il glucosio, gli aminoacidi e i sali minerali, oltre ai fattori di crescita presenti nel siero. Questi nutrienti forniscono alle cellule l'energia e i substrati necessari per la loro crescita e funzionamento. Infine, il substrato di adesione utilizzato per le colture cellulari può essere di due tipi: trattato o non trattato. Le plastiche trattate sono utilizzate per le colture tissutali aderenti, mentre le plastiche non trattate sono utilizzate per le colture in sospensione. In conclusione, la scelta del terreno di coltura e delle condizioni di coltura è fondamentale per garantire la crescita e la sopravvivenza delle cellule in vitro. La composizione del terreno, il pH, la temperatura e il substrato di adesione sono tutti fattori importanti da considerare per ottenere risultati ottimali nelle colture cellulari.

Esatta dei singoli terreni ed il tipo di terreno adatto per una data linea cellulare viene di solito specificato dalla ditta produttrice.

Per la crescita, le cellule richiedono un valore di pH del mezzo compreso tra 7.2 e 7.4. Per mantenere costante tale valore di pH, si ricorre per lo più ad incubatori con una fase gassosa contenente il 5% di CO2 e terreni contenenti NaHCO3.

L'ingresso indesiderato di microorganismi nel terreno di coltura è dannoso, in quanto questi competono con le cellule in coltura (che generalmente hanno ritmo di crescita inferiore) e possono secernere sostanze tossiche. Tipici contaminanti sono batteri, micoplasmi, lieviti, muffe.

In caso di infezione batterica il terreno vira in fretta (acidifica) e intorbidisce. Le infezioni da micoplasmi sono più subdole, in quanto il microorganismo è meno visibile e richiede un paio di settimane per formare colonie visibili.

Questo pericolo determina la prassi di aggiungere antibiotici al terreno (es:

streptomicina-penicillina); va ricordato che sono stabili per pochi giorni a 37 °C.

Un terreno completo per le cellule di mammifero prevede antibiotici, siero e glutammica oltre al medium normale (IMDM).

Plastiche per colture cellulari:

• sono generalmente in polistirene
• materiale rigido con superficie lucida
• buona resistenza chimica a soluzioni acquose
• limitata resistenza a solventi
• totale assenza di tossicità per le cellule in coltura
• trasparenza che consente una osservazione diretta al microscopio
• la superficie è trattata chimicamente per renderla idrofila e carica negativamente (per favorire i legami stabili con i fattori di adesione presenti nel siero)

L'adesione è un fenomeno attivo che richiede l'interazione dei recettori di membrana, le integrine, con le proteine adesive, quali la fibronectine, adsorbite sulla piastra di coltura.

Linee cellulari particolarmente utilizzate

Conservazione delle cellule in azoto

liquidoPer la conservazione delle cellule per lunghi periodi si ricorre allo stoccaggio in azoto liquido (-196 °C). Il congelamento in azoto liquido mantiene le cellule vive in completa quiescenza per anni.

Lecellule prima del congelamento devono essere in fase di crescita logaritmica. Il congelamentoviene fatto in presenza di terreno di crescita, siero e agenti crioprotettivi (DMSO).

La velocità con cui il campione viene congelato è fondamentale perché congelamenti tropporapidi portano alla formazione di cristalli di ghiaccio (troppo grossi) all’interno delle cellule,questi, al momento dello scongelamento, provocheranno lisi della membrana plasmatica.

Durante il congelamento il metabolismo cellulare si ferma quando tutta l'acqua è convertita inghiaccio. Il congelamento può avvenire con due diverse velocità:

➢ lentamente, questo porta alla deposizione di ghiaccio nell’ambiente extracellulare chedeterminerà un forte

Sbilanciamento osmotico per l'aumento della concentrazione di soluti. Per minimizzare i danni occorre che la concentrazione interna di soluti sia sufficientemente alta in modo da rendere la concentrazione dell'acqua intracellulare minore di quella extracellulare.

Velocemente, il congelamento rapido porta alla formazione di cristalli di ghiaccio (troppo grossi) all'interno della cellula, cristalli che, al momento dello scongelamento, portano alla rottura della membrana plasmatica.

Il processo si controlla aggiungendo al terreno di congelamento un agente crioprotettivo permeabile come il dimetilsolfossido (DMSO) o il glicerolo, agente che riduce la formazione di grossi cristalli di ghiaccio intracellulari ed extracellulari.

Il processo inizia con la formazione di piccoli cristalli di ghiaccio nel mezzo extracellulare, l'acqua viene sottratta alle cellule perché la tensione di vapore del ghiaccio è più bassa di quella del citoplasma, prevalentemente acquoso.

L'acqua esce dalle cellule finché le tensioni di vapore sono all'equilibrio. Per regolare il processo al tasso ottimale di congelamento attraverso una periodica immissione di azoto liquido sono state ideate e sviluppate camere di congelamento.

Il Mr. Frosty è un contenitore riempito con 200 ml di isopropanolo a temperatura ambiente e le vials di congelamento contenenti le cellule sono posizionate in un rack posto all'interno del contenitore stesso. Questo posto in un freezer -80 °C. Il ruolo dell'isopropanolo è quello di consentire alle vials di raggiungere la temperatura di congelamento lentamente, circa 1 °C al minuto. Una volta che il contenitore ha raggiunto -80 °C (in 4 ore o più, overnight), le vials devono essere rimosse dal Mr. Frosty e immediatamente poste nel bidone dell'azoto liquido. Le cellule sono stoccate alle temperature dell'azoto liquido, perché lo sviluppo dei cristalli di ghiaccio è

ritardata al di sotto dei -130 °C. Per massimizzare il recupero delle cellule dopo lo scongelamento, le cellule devono essere riscaldate molto rapidamente, posizionando le vials direttamente dall'azoto liquido al bagnetto riscaldato a 37 °C. Non appena l'ultimo cristallo di ghiaccio si è sciolto, le cellule devono essere diluite nel medium di coltura pre-riscaldato.

Produzione di anticorpi monoclonali

Le cellule B attivate contengono un mix di anticorpi diretti verso differenti epitopi (policlonali). Quando crescono in coltura, le cellule B hanno un periodo di vita limitato. Come possiamo selezionare un singolo clone di una cellula B (monoclonale) a propagarne la linea cellulare?

Ibridoma

I linfociti B possono mutare in cellule tumorali che risultano in un tipo di cancro chiamato mieloma. Le cellule del mieloma diventano immortali e cresceranno in coltura. La fusione di una singola cellula B attivata e una cellula di mieloma creeranno un ibridoma che può crescere.

indefinitamente in coltura.
Nel 1975, Kohler e Milstein realizzarono per primi la fusione dei linfociti per produrre una linea cellulare che fosse sia immortale che produttrice di specifici anticorpi. I due scienziati ricevettero per questo il Nobel per la medicina nel 1984.
Il sistema del topo nella produzione di anticorpi monoclonali
Gli anticorpi possono essere sviluppati nel topo attraverso l'iniezione di un antigene. Iniezioni ripetute generano una certa quantità di cellule B attivate.
La rimozione della milza del topo e la fusione con le cellule di Milano crea degli ibridomi. La diluizione e la coltura generano molte linee cellulari monoclonali.
Selezione degli ibridomi
È necessario creare delle condizioni di coltura in cui solo gli ibridomi siano capaci di sintetizzare il DNA.
Per questo è stato sviluppato il sistema HAT (ipoxantina-aminopterina-timidina).
La sintesi di DNA è condizionata alla presenza di NTP sintetizzati a partire dairispettivi monofosfati. Gli NTP si formano da:

• Sintesi De novo (via normale)
• Via di salvataggio (via alternativa)

Nel sistema HAT:

1. L'ipoxantina è usata come sorgente esogena di purine
2. A = aminopterina. L'aminopterina blocca tutte le reazioni dell'enzima diidrofosfato redattasi (DHPR) che è coinvolto nella sintesi de novo di AMP e GMP. Di conseguenza, la cellula diventa completamente dipendente dalla via di salvataggio per produrre i trifosfati purinici e pirimidinici per la sintesi del DNA.
3. T = timidina. La timidina è usata come sorgente esogena, è fosforilata dalla timidina chinasi (TK) per formare TMP.

In condizioni normali, le cellule sintetizzano i nucleotidi purinici e timidilato (componenti indispensabili per la sintesi del DNA) a partire da fosforibosilpirofosfato e uridilato; ma il quali

L'aminopterina inibisce tale sintesi secondo il pathway di trattamento con farmaci anti-folato normale, obbligando le cellule stesse ad usare un pathway alternativo. Il pathway alternativo richiede (per la sintesi di purina e timidilato) l'apporto esogeno di timidina, che infatti sono insieme all'aminopterina i componenti del medium di selezione denominato HAT. Per sintetizzare, mediante ipoxantina e timidina, i sopracitati nucleotidi, sono indispensabili i rispettivi enzimi:

• Ipoxantina-guanina fosforibosil-transferasi (HGPRT)
• Timidina chinasi (TK)

Normalmente questi enzimi sono presenti negli splenociti (e quindi negli ibridomi che ne derivano), ma che mancano appositamente nelle linee di mieloma usate come partner di fusione. Ne consegue che dopo la fusione solo gli ibridomi riescono a sopravvivere nel medium HAT.

Riepilogo