LTA Genetica, laboratorio di tecnologie abilitanti

Test di complementazione nel lievito

Incrociando due ceppi aploidi di lievito portanti mutazioni recessive si ottiene un diploide che può essere utilizzato per un test di complementazione. Il test di complementazione viene fatto per stabilire se due mutazioni che danno luogo allo stesso fenotipo si trovano su un unico gene o su due geni diversi che regolano singoli eventi di una catena metabolica.

Incrociando i due ceppi di lievito mutati, se le mutazioni sono su geni differenti si ottiene un fenotipo non mutato e le due mutazioni si dice che "complementano". Viceversa, se esse sono sullo stesso gene, il fenotipo rimane mutato e le mutazioni complementano proprio perché riguardano il medesimo gene e di conseguenza il medesimo enzima.

Ad esempio, ho isolato due ceppi mutanti aploidi His-. So che entrambe le mutazioni che conferiscono fenotipo His- alterano ciascuna un unico gene e sono recessive. Per sapere se le due mutazioni alterano lo stesso gene o geni diversi, incrocio tra di loro i due ceppi.

His-:14Selezione dei diploidi

La complementazione può essere sfruttata per selezionare cellule diploidi originatesi dalla coniugazione di due aploidi che portano mutazioni recessive che determinano esigenze nutrizionali diverse; il diploide si potrà selezionare su un terreno che manca di alcuni nutrienti in modo che potrà crescere solo il ceppo diploide ma non gli aploidi originali. Questo avviene perché nel diploide le esigenze nutrizionali di uno dei due ceppi possono venire compensate o "complementate" dal corredo genetico dell'altro ceppo o viceversa.

Controllo di sporificazione

Cellule diploidi di S. cerevisiae, se poste in terreno povero di azoto e di fonti di carbonio, possono andare incontro a meiosi (ovvero sporificare) e dare origine a 4 gameti o spore aploidi racchiuse in una speciale struttura a sacchetto chiamata asco, formando quella che viene chiamata tetrade. Mediante micromanipolazione è possibile separare le 4 spore di

ciascunasco e farle germinare e dividere su piastra, in modo da ottenere colonie aploidi in cui tutte lecellule derivano da una singola spora. Successivamente é possibile analizzare il fenotipo dellespore che derivano da ciascun asco e risalire, eventualmente, al genotipo del diploide che le haoriginate.

La presenza di aschi in una popolazione di cellule diploidi, mantenuta per almeno 48 ore su unapiastra di terreno adatto alla sporificazione, verrà controllata al microscopio dopo preparazionedi una sospensione di queste cellule su un vetrino.

Controllo del fenotipo del diploide FY1679 e dei suoi segreganti aploidi

Il genotipo verrà ricostruito mediante questa analisi. Ciascun gruppo preleverà con unostuzzicadenti sterile una piccola quantità di cellule del diploide FY1679 e dei suoi segregantimeiotici provenienti da 3 tetradi diverse e le striscerà su terreni sintetici contenenti glucosio etutti gli aminoacidi e basi azotate (terreno completo)

O mancanti rispettivamente di uracile (-ura), leucina (-leu), triptofano (-trp) o istidina (-his). In questo modo vengono analizzate le possibili richieste nutrizionali (auxotrofie) delle singole spore e del diploide e determinata la segregazione di eventuali mutazioni. Le piastre vengono incubate a 30°C fino al giorno successivo.

Il giorno successivo si procederà a verificare i fenotipi del diploide FY1679 e dei suoi segreganti, mediante valutazione delle crescita degli strisci sui diversi terreni. Sulla base dei risultati ottenuti, si procederà alla ricostruzione dei genotipi dei segreganti e del diploide di partenza.

Il ciclo cellulare in Saccharomyces cerevisiae

Il ciclo cellulare meiotico è un ciclo cellulare specializzato, che prevede una 1° divisione, detta riduzionale, in cui i cromosomi omologhi (duplicati durante la precedente fase S) segregano ai poli. La successiva divisione, equazionale, che NON ha una fase S, comporta la separazione dei cromatidi.

fratelli. La segregazione dei cromosomi in S. cerevisiae avviene in maniera simile a tutti gli altri eucarioti con una prima ed una seconda divisione meiotica. Durante la meiosi, le cellule di S.cerevisiae vanno incontro a cambiamenti morfogenetici. Ogni cellula diploide produce quattro spore aploidi contenute in un asco, chiamato anche tetrade. L'associazione fisica di tutti i prodotti di una singola meiosi all'interno di una tetrade, consente un'analisi genetica della progenie molto precisa. L'analisi genetica dei prodotti meiotici all'interno di una tetrade richiede un metodo noto come "dissezione delle tetradi" che consiste nella separazione delle quattro spore di una tetrade su un terreno solido. Qui le spore germineranno e intraprenderanno il ciclo di vita mitotico. Per la dissezione delle tetradi è necessario un trattamento con un enzima litico (zimoliasi) che digerisca parzialmente la parete dell'asco. Quindi, con l'ausilio di un micromanipolatore,È possibile separare le spore. Scopi dell'analisi delle tetradi:

1. Separare mutazioni
2. Verificare l'effetto di una mutazione
3. Stabilire l'associazione tra due marcatori genetici ed analizzare la distanza sul cromosoma
4. Creare doppi mutanti
5. Verificare la relazione esistente tra due geni mediante l'analisi del doppio mutante

Al termine della meiosi, le quattro cellule figlie sono diverse dalla cellula madre perché hanno la metà del numero di cromosomi della cellula madre: sono APLOIDI e sono diverse tra di loro per:

• Separazione casuale degli omologhi alla I divisione meiotica
• Eventuale crossing-over

Se due geni sono indipendenti, la meiosi di cellule eterozigoti per i due geni deve dare origine a una tetradi di tipo PARENTALE (PD) e di tipo NON PARENTALE (NPD) con la stessa frequenza. Tetradi di tipo TETRATIPO (TT) si possono originare da un diploide eterozigote per due geni indipendenti abbastanza lontani dal proprio centromero da poter.

Il lievito S. cerevisiae si divide per gemmazione in modo asimmetrico, generando ad ogni ciclo cellulare una cellula figlia più piccola rispetto alla cellula madre. La fase G1 è l'unica fase non di divisione in cui una cellula figlia più piccola si forma del ciclo cellulare.

Analisi morfologica di mutanti cdc di S. cerevisiae e determinazione del loro titolo vitale dopo 5 ore di incubazione alla temperatura restrittiva (37°C)

L'isolamento di mutanti che alterano il ciclo cellulare ha permesso di identificare i geni coinvolti nella progressione del ciclo cellulare. Poiché la divisione cellulare è un processo essenziale per la vitalità cellulare, è necessario identificare questi mutanti fra i mutanti condizionali, cioè che inattivano il prodotto genico in particolari condizioni e non in altre (es. mutanti temperatura sensibili, ts). La definizione di mutanti alterati nel ciclo di divisione cellulare (mutanti cdc o ricombinare con esso.

“cell18division cycle”) è basata sul criterio che, in condizioni che permettono l’espressione dellamutazione (ad es. alta temperatura nel caso di mutazioni ts), essi si bloccano in una fasespecifica del ciclo cellulare e questo li differenzia da mutazioni in geni che controllano processicontinui come la crescita o il metabolismo. Il blocco in una fase specifica comporta che lecellule di un mutante cdc, in condizioni restrittive, si arrestino con una morfologia uniforme, cheriflette la particolare fase del ciclo cellulare che non è possibile superare in mancanza delprodotto genico mutato.

Verrà analizzata la morfologia di 3 mutanti cdc di lievito rispetto a quella di un ceppo selvaticoisogenico dopo trasferimento delle colture in condizioni restrittive di temperatura.

Saranno utilizzati i seguenti ceppi:

1. Selvatico (wt)
2. cdc28
3. cdc4
4. cdc17

La sera precedente i suddetti ceppi saranno inoculati in YEPD e fatti crescere o/n a 25°C (condizioni di

temperatura permissive). Il giorno successivo le 4 colture saranno trasferite a 37°C (condizioni non permissive di temperatura) per 5 ore. Dopo 5 ore saranno prelevate aliquote da 1 ml di cellule dalle 4 colture trattate con ultrasuoni (sonicazione). Depositare 10 µl di ogni coltura su vetrino e osservare al microscopio la morfologia delle cellule prelevate dalle 4 colture, paragonando il ceppo selvatico con i 3 mutanti cdc.

Per valutare il titolo vitale dei mutanti cdc dopo 5 ore di incubazione a 37°C, si dovranno diluire le sospensioni iniziali (di cui sarà nota la concentrazione) mediante diluizioni seriali (diluizione massima 1:50; volume massimo in provetta 2 ml; volume minimo della sospensione da diluire 40 µl) in modo da piastrare su 1 piastra di YEPD per ciascun ceppo 100 µl di sospensione contenente 300 cellule. Incubare le piastre a 25°C (condizioni di temperatura permissive).

Il fato lambdaII fago lambda è un batteriofago temperato che

infetta Escherichia coli. Una volta che il fago fail suo ingresso nell'ospite, il suo genoma può integrarsi all' interno del genoma dell'ospite stesso. In questo caso, è chiamato profago, e risiede all'interno dell'ospite apparentemente senza arrecare danno. In questa fase il profago duplica con Ia duplicazione del DNA dell'ospite, che avviene prima di ogni divisione cellulare. Questa fase è quella definita lisogena. In seguito a segnali specifici (es. stress cellulare), il profago si riattiva, il suo DNA viene exciso dal genoma ospite e si avvia il ciclo litico. Il fago riattivato inizia a produrre grandi quantità di mRNA a partire dal proprio DNA, al fine di costituire un elevato numero di unità fagiche. Quando tutte le risorse della cellula sono esaurite a causa dell'assemblaggio di nuovi fagi, la sua membrana viene distrutta ed i fagi prodotti sono riversati all'esterno. Alcuni ceppi batterici erano resistenti

all'infezione da parte di particolari fagi, tuttavia questi batteri resistenti potevano provocare la lisi di batteri non resistenti quando i due ceppi venivano mescolati. I batteri resistenti capaci di indurre la lisi di altre cellule batteriche furono chiamati batteri LISOGENICI o LISOGENI. I ceppi lisogenici erano in qualche modo in grado di "portare" i fagi e però di essere immuni alla loro azione di lisi. Lwoff ipotizzò che i batteri lisogenici dovevano contenere un fattore non infettivo trasmesso ai batteri di generazione in generazione, ma talvolta questo fattore determinava la produzione di particelle fagiche infettive. Lwoff definì questo fattore PROFAGO. I fagi possono essere classificati in due tipi:

1. FASI VIRULENTI: hanno un ciclo infettivo che è sempre litico.
2. FAGI TEMPERATI: possono in talune circostanze avviare un ciclo litico, ma di solito si integrano nel cromosoma batterico, entrando in un ciclo LISOGENICO in cui il fago

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