LTA Genetica, laboratorio di tecnologie abilitanti

LTA genetiche

Protocolli e procedure per vari saggi genetici

Introduzione ai saggi genetici

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae è un organismo eucariote unicellulare. È ampiamente utilizzato come organismo modello dato che le sue cellule crescono rapidamente sia in coltura liquida che su terreno solido (superficie di agar). Ha un genoma piccolo e ben caratterizzato e inoltre può crescere sia allo stato aploide che diploide. L'analisi genetica risulta quindi essere semplice e si possono effettuare diversi saggi genetici.

Nomenclatura genetica

Nel lievito S. cerevisiae, i geni vengono indicati con tre lettere dell'alfabeto seguite da un numero e sono scritti in carattere italico. Per esempio, il gene TRP1 codifica per un enzima richiesto per il primo passaggio nella via biosintetica che porta alla sintesi dell'amminoacido triptofano. Così il gene LEU2 codifica per il secondo enzima nella via che porta alla sintesi dell'amminoacido leucina, etc. Geni che portano mutazioni recessive nei geni in oggetto sono indicati con le lettere minuscole (trp1, leu2 ecc.). I fenotipi selvatici o mutanti sono invece spesso indicati, rispettivamente, come + oppure -. Con + si indica la capacità di sintetizzare triptofano e/o leucina e, quindi, la capacità di crescere in assenza di tali amminoacidi nel terreno di coltura: organismi prototrofi. Con -, si indica l'incapacità di sintetizzare gli aminoacidi in oggetto e, quindi, gli organismi che portano tali mutazioni sono detti mutanti auxotrofici, e possono crescere solo se il triptofano e/o la leucina vengono aggiunti al terreno di coltura.

Mutanti letali condizionali

Altri mutanti estremamente importanti nell'analisi genetica formale sono i mutanti letali condizionali. Vengono così chiamati mutanti capaci di crescere in una certa condizione (detta permissiva) ma incapaci di crescere in una condizione alternativa (detta non-permissiva o restrittiva). Tra i mutanti letali condizionali più utilizzati ci sono i mutanti temperatura-sensibili che sono capaci di crescere ad una certa temperatura (il lievito normalmente a 30 °C), ma non ad una temperatura più alta (37 °C). Perché ciò avviene? Qui dobbiamo ricordarci che cosa è una mutazione. La mutazione è un cambiamento ereditabile nella sequenza nucleotidica di un gene, per cui il gene mutato può non essere in grado di svolgere la funzione tipica del gene selvatico e quindi mostra un fenotipo alterato.

Esperimenti di Mendel

Ricordando gli esperimenti di Mendel, l'allele che determinava il colore giallo del seme del pisello era indicato come Y (maiuscolo), mentre quello che determinava il colore verde era indicato come y (minuscolo). Poiché il pisello è un organismo diploide e quindi contiene due copie di quel gene, possiamo avere tre possibili situazioni: YY, Yy, yy. Il colore del seme è giallo sia nella situazione YY (omozigote) che in quella Yy (eterozigote) e questo perché l'allele Y (giallo) è dominante, mentre l'allele y (verde) è recessivo per cui le piante verdi possono essere solo di genotipo yy.

Vantaggi dell'utilizzo del lievito

I grandi vantaggi dell'utilizzo del lievito nell'analisi genetica classica sono essenzialmente due:

• Si può passare dallo stato aploide a quello diploide (e viceversa) con grande facilità;
• I prodotti di ogni meiosi (gameti) sono racchiusi in una struttura (asco), per cui è possibile analizzare il genotipo di ciascun gamete e, quindi, è più facile seguire la segregazione di un dato carattere.

Conteggio di una sospensione cellulare di Saccharomyces cerevisiae e determinazione del suo titolo vitale

La concentrazione di una sospensione cellulare di lievito viene determinata al microscopio. Per determinare al microscopio la concentrazione di una sospensione cellulare si utilizza la camera di Bürker: contare il numero di cellule presenti in 10 rettangoli o in 10 quadrati, farne la media, e risalire alla concentrazione cellulare della sospensione in cellule/ml.

In seguito ad opportune diluizioni della sospensione iniziale, viene piastrato su terreno YEPD (Yeast Extract + Peptone + Destrose) un numero predeterminato di cellule le quali origineranno colonie dopo due giorni di crescita a 30 °C. In questo modo viene determinato il titolo vitale della sospensione iniziale, ovvero la concentrazione delle unità formanti colonia (u.f.c.).

Trasformazione di lievito

La trasformazione di lievito è un processo per cui DNA esogeno viene incorporato all'interno di una cellula di lievito. I lieviti NON assumono spontaneamente DNA esogeno, quindi è necessario utilizzare metodi chimici o fisici per effettuare la trasformazione.

• Il trattamento con SALI (es. Litio Acetato) e PEG (polietilenglicole) aumenta l'efficienza di incorporazione grazie alla permealizzazione delle membrane cellulari.
• Un altro metodo prevede la degradazione della parete cellulare, i PROTOPLASTI così ottenuti assumono DNA piuttosto facilmente.
• Due metodi fisici sono l'ELETTROPORAZIONE (esposizione delle cellule a un breve impulso elettrico) e la MICROINIEZIONE (inserimento del DNA nel nucleo della cellula mediante una pipetta molto sottile), quest'ultimo metodo è utilizzato soprattutto per cellule animali e vegetali.

La trasformazione consente l'acquisizione di nuovi genotipi. Lo sviluppo delle tecniche di trasformazione ha reso il lievito particolarmente accessibile alla clonazione genica e a tecniche di ingegneria genetica. I vettori utilizzati per la trasformazione del lievito sono di tre tipi:

• Vettori integrativi YIp, che si integrano a bassa frequenza nel genoma;
• Vettori ad alto numero di copie YEp, che si replicano autonomamente grazie all'origine di replicazione del plasmide 2µ;
• Vettori a basso numero di copie YCp, che si replicano grazie ad una sequenza di replicazione autonoma (ARS) e che contengono anche una sequenza centromerica (CEN).

Sono inoltre disponibili gli YAC, cromosomi artificiali di lievito, che vengono utilizzati per clonare grandi frammenti di DNA (200-800 Kb); tali vettori sono lineari e contengono anche sequenze telomeriche oltre ad una origine di replicazione (ARS) e al centro ero (CEN).

Produzione di proteine eterologhe

Grazie alle tecniche del DNA ricombinante ed alla costruzione di vettori di clonaggio e di espressione, il lievito Saccharomyces cerevisiae viene utilizzato per la produzione di proteine eterologhe.

Trasformazione del lievito Saccharomyces cerevisiae con un plasmide e determinazione del fenotipo dei trasformanti

La trasformazione è il processo che porta all'incorporazione di DNA esogeno all'interno di una cellula. Se tale DNA porta dei geni, è possibile in questo modo modificare il genotipo ed il fenotipo della cellula ospite in modo, ad esempio, da complementare mutazioni recessive o introdurre geni che codificano proteine eterologhe. Il lievito Saccharomyces cerevisiae non è naturalmente competente alla trasformazione ma con opportuni trattamenti si può favorire l'incorporazione di DNA esogeno in cellule di lievito.

Ad esempio, prendendo il ceppo K2346.ade2-1:

• Genotipo: MATα, ade3, trp1-1, leu2-3,112, his3-11, ura3
• Fenotipo: Ade-, Trp-, Leu-, His-, Ura-

Cellule di lievito in crescita esponenziale in terreno ricco YEPD verranno rese temporaneamente competenti per la trasformazione: La sospensione cellulare sarà centrifugata a bassa velocità. Dopo l'eliminazione del terreno di coltura le cellule saranno lavate e quindi risospese in una soluzione di litio acetato 1 M (LiAc). Allestire in provette eppendorf da 1,5 ml una trasformazione (provetta T) e un controllo di trasformazione (provetta C). SOLO la provetta T dovrà contenere anche 1 µl di soluzione contenente il plasmide. Mischiare (al vortex per 10 secondi) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente aggiungere 6 µl glicerolo 60%, mischiare e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Incubare poi a 42 °C per 10 minuti (shock termico). Aggiungere 5 µl di acqua sterile e piastrare il contenuto di ogni provetta su una piastra di terreno selettivo privo di uracile (-ura). Incubare e piastre 2 giorni a 30 °C.

L'analisi dei trasformanti avviene contando il numero di colonie Ura+ cresciute sulla piastra T (sulla piastra C non dovrebbero essere cresciute colonie) e valutandone l'efficienza di trasformazione (n° di trasformanti/µg di DNA). L'efficienza di trasformazione vale quindi: n° di trasformanti/µg di DNA.

Servendosi di stuzzicadenti sterili, si possono prelevare 12 colonie e strisciarle su 1 piastra -ura. Le piastre con gli strisci verranno incubate a 30 °C e il giorno successivo si valuterà la capacità dei singoli cloni di crescere sulla piastra di terreno selettivo -ura. Il giorno successivo isolare il ceppo K2346 e 3 dei trasformanti ricresciuti sulla piastra su 1 piastra di terreno completo con basso contenuto di adenina. Incubare la piastra a 30 °C ed analizzare dopo 2 giorni la pigmentazione delle colonie cresciute.

Test di perdita plasmidica nel lievito S. cerevisiae

Un ceppo di lievito mutante ade2 forma colonie rosse, poiché accumula un intermedio rosso durante la biosintesi dell'adenina. Un ceppo di lievito mutante ade3 forma colonie bianche. Un ceppo doppio mutante ade2 ade3, invece, produce colonie bianche poiché la mutazione ade3 determina un blocco della sintesi dell'adenina ad un passaggio precedente le formazione dell'intermedio rosso.

Se tale ceppo doppio mutante ade2 ade3 viene trasformato con un plasmide portante il gene ADE3 selvatico, il gene ADE3 portato dal plasmide completerà la mutazione recessiva ade3. Perciò tale ceppo formerà colonie rosse su piastre non contenenti uracile, mentre su piastre contenenti uracile le colonie saranno rosse ma con settori bianchi. Quindi, in seguito alla perdita del plasmide, le cellule formeranno colonie...