LTA Biochimica, laboratorio di tecnologie abilitanti

LTA Biochimica: Protocolli sperimentali per la purificazione e l'analisi di proteine

Introduzione

Lo scopo di questa dispensa è quello di descrivere la purificazione e la cinetica enzimatica di un enzima. Verrà presa come esempio una lipasi ricombinante prodotta in E. Coli. Le lipasi (triacilglicerolo acilidrolasi, triacilglicerolo lipasi EC 3.2.1.3) sono enzimi lipolitici che in solvente acquoso idrolizzano il legame estere tra glicerolo e acidi grassi. In assenza di acqua possono catalizzare la reazione inversa.

L’attività delle lipasi può essere misurata con vari metodi. I metodi turbidometrici si basano sulla diminuzione della torbidità nel tempo a partire da sospensioni/emulsioni di trigliceridi. La "chiarificazione" è una conseguenza della liberazione degli acidi grassi ed è proporzionale all’attività enzimatica. Il pH tende a ridursi a causa degli acidi grassi liberati dall’azione della lipasi. Una misura dell’attività è data, infatti, dalla velocità con cui è necessario aggiungere una base (ad esempio NaOH) per mantenere il pH ad un dato valore di partenza.

Esistono infine vari metodi spettrofotometrici basati sull’impiego di esteri tra p-nitrofenilfosfato e un acido grasso. Il prodotto di idrolisi della lipasi è dato dal p-nitrofenilfosfato che assorbe alla lunghezza d’onda di 410 nm.

Produzione della proteina di interesse

La produzione della proteina di interesse avviene in forma ricombinante, in cellule di Escherichia coli, indotta con lattosio o isopropil-tiogalattopinanoside (IPTG). LipB (una lipasi fungina) è fusa con un tag di istidine che ne consente la purificazione mediante cromatografia di affinità con resina al Nichel.

Cromatografia e Desalting

Frazionamento campioni proteici

Cellule di E. coli BL21 esprimenti LipB sono state risospese in tampone di lisi e listate mediante un estrusore a pressione (French Press). Dal lisato cellulare verranno prelevati dei campioni analitici, in parte destinati ad elettroforesi, ed il campione preparativo di proteine solubili che verrà sottoposto a purificazione cromatografica.

Cromatografia di affinità (IMAC)

Questo tipo di cromatografia si basa sulla presenza di un tag di residui di istidina introdotto ad una estremità di proteine ricombinanti. Allo scopo può essere utilizzata una resina coniugata con Ni²⁺, che a loro volta potranno interagire con l’azoto deprotonato dei gruppi imidazolici dell’istidina. Dopo aver equilibrato la resina con il tampone di lavaggio, si procede al binding della resina aggiungendo il campione preparativo delle proteine solubili (separate dal pellet a seguito di centrifugazione). Successivamente occorre effettuare il lavaggio utilizzando il tampone di lavaggio. Infine, si utilizza il tampone di diluizione per far eluire in 5 frazioni da 1 ml gli analisti che hanno interagito con la resina.

È possibile individuare le frazioni di eluizione a più alta concentrazione allestendo delle miscele di reazione per il dosaggio proteico (metodo di Bradford). Successivamente si riuniscono le frazioni di eluizione IMAC più ricche in proteine in un unico pool.

Cromatografia di gel-filtrazione (desalting con PD10)

Dopo la prima purificazione con cromatografia di affinità IMAC si utilizza la cromatografia di gel-filtrazione per sostituire il tampone IMAC in cui sono immersi i campioni derivati dalla cromatografia di affinità (tampone IMAC). Si tratta quindi di un passaggio di "desalting". Allo scopo saranno utilizzate colonne preimpaccate (PD10) e per rendere più efficace il desalting, la cromatografia sarà applicata due volte.

Come prima cosa si purificano i campioni IMAC su colonna PD10. Questo tipo di cromatografia prevede il caricamento del campione su colonna preequilibrata col tampone di interesse e la raccolta delle frazioni di eluizione, senza che venga applicato alcun passaggio di lavaggio. Successivamente, si individueranno i campioni (desalted PD10) più concentrati facendo un dosaggio proteico.

Dosaggio proteico, Dosaggio enzimatico e Parametri cinetici

Dosaggio proteico (metodo di Bradford)

La concentrazione proteica viene determinata mediante il metodo di Bradford. Il reattivo di Bradford contiene il Coomassie Brilliant Blue G-250, un colorante anionico. La sua forma cationica assorbe a 470 nm. Il blu di Coomassie si lega ad arginina, tirosina, triptofano, istidina e fenilalanina.

In ambiente acido le proteine reagiscono con il colorante carico negativamente formando un complesso di un colore che varia da rosso-bruno a blu che ha un massimo di assorbimento a una lunghezza d’onda di 595 nm. Il numero di molecole di colorante legato è approssimativamente proporzionale al numero di proteine presenti.

Per determinare la concentrazione proteica si fa quindi reagire il campione con il reattivo di Bradford (direttamente in cuvetta) e si ricava il coefficiente di estinzione molare.