LTA Biochimica, laboratorio di tecnologie abilitanti

LTA Biochimica

Protocolli sperimentali per la purificazione e l’analisi di proteine

Introduzione

Lo scopo di questa dispensa è quello di descrivere la purificazione e la cinetica enzimatica di

un enzima. Verrà presa come esempio una lipasi ricombinante prodotta in E. Coli.

Le lipasi (triacilglicerolo acilidrolasi, triacilglicerolo lipasi EC 3.2.1.3) sono enzimi lipolitici che in

solvente acquoso idrolizzano il legame estere tra glicerolo e acidi grassi. In assenza di acqua

possono catalizzare la reazione inversa.

L’attività delle lipasi può essere misurata con vari metodi. I metodi turbidometrici si basano sulla

diminuzione della torbidità nel tempo a partire da sospensioni/emulsioni di trigliceridi. La

“chiarificazione” è una conseguenza della liberazione degli acidi grassi ed è proporzionale

all’attività enzimatica. tende a ridursi a causa degli acidi grassi liberati dall’azione della

Il pH

lipasi. Una misura dell’attività è data, infatti, dalla velocità con cui è necessario aggiungere una

base (ad esempio NaOH) per mantenere il pH ad un dato valore di partenza.

Esistono infine vari metodi spettrofotometrici basati sull’impiego di esteri tra p-nitrofenilfosfato e

un acido grasso. Il prodotto di idrolisi della lipasi è dato dal p-nitrofenilfosfato che assorbe alla

lunghezza d’onda di 410 nm.

La produzione della proteina di interesse avviene in forma ricombinante, in cellule di

Escherichia coli, indotta con lattosio o isopropil-tiogalattopinanoside (IPTG). LipB (una lipasi

fungina) è fusa con un tag di istidine che ne consente la purificazione mediante cromatografia

di affinità con resina al Nichel.

Cromatografia e Desalting

Frazionamento campioni proteici

Cellule di E. coli BL21 esprimenti LipB sono state risospese in tampone di lisi e listate mediante

un estrusore a pressione (French Press).

Dal lisato cellulare verranno prelevati dei campioni analitici, in parte destinati ad elettroforesi, ed

il campione preparativo di proteine solubili che verrà sottoposto a purificazione cromatografica.

Cromatografia di affinità (IMAC)

Questo tipo di cromatografia si basa sulla presenza di un tag di residui di istidina introdotto ad

una estremità di proteine ricombinanti. Allo scopo può essere utilizzata una resina coniugata

2+

Ni , che a loro volta potranno interagire con l’azoto

con acido nitricoacetico che coordina ioni

deprotonato dei gruppi imidazolici dell’istidina.

Dopo aver equilibrato la resina con il tampone di lavaggio, si progesterone prima al binding

della resina aggiungendo il campione preparativo delle proteine solubili (separate dal pellet a

seguito di centrifugazione). Successivamente occorre effettuare il lavaggio utilizzando il

tampone di lavaggio. Infine, si utilizza il tampone di diluizione per far eluire in 5 frazioni da 1ml

gli analisti che hanno interagito con la resina.

È possibile individuare le frazioni di eluizione a più alta concentrazione allestendo delle miscele

di reazione per il dosaggio proteico (metodo di Bradford). Successivamente si riuniscono le

frazioni di eluizione IMAC più ricche in proteine in un unico pool.

Cromatografia di gel-filtrazione (desalting con PD10)

Dopo la prima purificazione con cromatografia di affinità IMAC si utilizza la cromatografia di gel-

filtrazione per sostituire il tampone IMAC in cui sono immersi i campioni derivati dalla

cromatografia di affinità (tampone IMAC). Si tratta quindi di un passaggio di “desalting”. Allo

scopo saranno utilizzate colonne preimpaccate (PD10) e per rendere più efficace il desalting, la

cromatografia sarà applicata due volte.

Come prima cosa si purificano i campioni IMAC su colonna PD10. Questo tipo di cromatografia

prevede il caricamento del campione su colonna preequilibrata col tampone di interesse e la

raccolta delle frazioni di eluizione, senza che venga applicato alcun passaggio di lavaggio.

Successivamente, si individueranno i campioni (desalted PD10) più concentrati facendo un

dosaggio proteico.

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Dosaggio proteico, Dosaggio enzimatico e

Parametri cinetici

Dosaggio proteico (metodo di Bradford)

La concentrazione proteica viene determinata mediante il metodo di Bradford.

Il reattivo di Bradford contiene il Coomassie Brilliant Blue G-250, un colorante anionico. La sua

forma cationica assorbe a 470 nm. Il blu di Coomassie si lega ad arginina, tirosina, triptofano,

istidina e fenilalanina.

In ambiente acido le proteine reagiscono con il colorante carico negativamente formando un

complesso di un colore che varia da rosso-bruno a blu che ha un massimo di assorbimento a

una lunghezza d’onda di 595 nm. Il numero di molecole di colorante legato è

approssimativamente proporzionale al numero di proteine presenti.

Per determinare la concentrazione proteica si fa quindi reagire il campione con il reattivo di

(o l’assorbanza)

Bradford (direttamente in cuvetta) e si ricava il coefficiente di estinzione molare

a 595 nm tramite lo spettrofotometro. La misura ottenuta non è assoluta, e per quantificare le

proteine è necessario confrontare i dati del campione a concentrazione incognita con una retta

con quantità note di un’altra proteina, di solito si usa l’albumina di siero

di taratura ottenuta

bovino (BSA).

Per allestire la retta di taratura si riportano in ascisse i µg di proteina (a concentrazione nota) e

in ordinate i corrispondenti valori di estinzione (∆E).

l’estinzione molare del campione, si

Dopo aver ricavato determina la quantità (µg) o

concentrazione della proteina presente in cuvetta controllando sulla retta di taratura la

concentrazione che equivale all’estinzione molare trovata con lo spettrofotometro.

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Saggi di attività li politica su piastra (Halo Assay)

I saggi su piastra servono a realizzare screening rapidi e misure semi-quantitative di attività

esterasica/lipasica. Il saggio si basa sulla formazione di aloni di chiarificazione o di colorazione

intorno a campioni deposti su una piastra di medium agarizzato, da cui il termine “halo assay”.

Se il substrato forma un’emulsione opaca (come nel caso della tributirrina), e quindi

chiarificabile per effetto dell’idrolisi, si ottengono aloni di chiarificazione. Se il substrato non

forma un’emulsione opaca (come nel caso della trioleina), l’idrolisi del trigliceride avviene grazie

all’incorporazione nel medium di un cromogeno, che risponda con un viraggio di colore

all’acidificazione del mezzo, causata a sua volta dal rilascio di acidi grassi.

L’obiettivo di questo esperimento è riconoscere i ceppi che producono LipB e tra questi, il/i

migliore/i produttore/i.

Dosaggio enzimatico (dosaggio di attività)

La concentrazione di un enzima viene determinata in base alla velocità della reazione

catalizzata, quindi in base alla velocità con cui il substrato viene trasformato in condizioni

definite. La velocità della reazione catalizzata è direttamente proporzionale alla concentrazione

dell’enzima. La velocità della reazione viene seguita nel tempo misurando la scomparsa di

prodotto. Per la misura dell’attività, quindi, si seguono nel tempo le

substrato o la comparsa di

variazioni di un’opportuna proprietà del substrato o del prodotto, realizzando saggi con

concentrazioni saturanti del substrato. Il pH, la temperatura, cofattori o altri componenti della

miscela di reazione possono influire sulla velocità della reazione catalizzata.

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Attività enzimatica e tabella di purificazione

L’attività enzimatica, ovvero la velocità della reazione catalizzata, viene espressa in unità. Per

tutti gli enzimi, si definisce attività internazionale (U) l’attività

convenzione generale e per

enzimatica che, in condizioni definite di temperatura e di pH, trasforma una mole di substrato al

minuto. Le unità misurate vengono riferite ad un volume unitario del campione in esame o ai mg

di proteine presenti nel campione. Il rapporto U/mL di campione viene detto “attività relativa”.

L’attività dell’enzima si calcola tramite la seguente formula:

relativa ∆