Lezioni, Microbiologia generale

COMPOSIZIONE TERRENI

Devono contenere C,N,P,S, H O (per idrogeno e ossigeno) e si dividono in quelli di cui è nota la

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composizione esatta (Sintetici) e quelli di cui non è definita (Complessi).

I sintetici possono essere usati per stabilire specifiche proprietà metaboliche e stabilire se quell’organismo

è prototrofo (se in grado di sintetizzare tutto) o auxotrofo (non riesce a sintetizzare qualcosa anche in

seguito a mutazioni).

I complessi invece non hanno composizione totalmente nota poiché è ottenuto da estratti di animali o

microrganismi (come lieviti, soia o residui di macellazione) ma comunque ricchi di substrati molto vari per

crescere più tipi di microrganismi; Essendo più ricco di nutriente permette la crescita di colonie in circa 1/3

del tempo.

TERRENI SELETTIVI

Favoriscono la crescita di una specie e sfavoriscono tutte le altre grazie ad agenti selezionanti come i Sali

biliari: bloccano i G+ ma non influenzano i batteri enterici isolandoli quindi in una coltura.

TERRENI DIFFERENZIALI

Non sono inibitori, crescono più specie ma comportandosi diversamente l’una dall’altra; si distinguono

proprietà di tipo metabolico evidenziabili con cambiamenti di colore solo in alcuni di essi (es. Agar di

MacConkey che distingue in base al colore. È utile per colonie di partenza miste in cui i vari batteri si

comportano diversamente; MacConkey evidenzia la capacità degli enterobatteri di usare determinati

substrati: ci sono lattosio e peptone come fonti di carbonio ed energia, Sali biliari e due coloranti, rosso

neutro (indicatore di pH, rosso a pH acido e neutro a pH=9) e cristalvioletto che agisce come inibitore per i

G+. È differenziale per le due fonti di C utilizzabili dagli enterobatteri, evidenziando in scuro quelli con

metabolismo fermentatorio (sfruttando lattosio) e in chiaro quelli che non sfruttano gli acidi.

Coli è cresciuto e si è colorato perché fermenta

molti acidi e li inietta nell’ambiente variando il

colore rosso neutro in opaco per i Sali precipitati.

Salmonella non fermenta e usa il peptone

catabolizzando NH , basica, che schiarisce il

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colore e rimanendo traslucido mantenendo

integri i Sali.

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Esempio: MSA e Agar-Sangue Brodo con peptone e lattosio a cui viene

aggiunto del sangue animale defibrinato che

conferisce il colore rosso; crescono tanti

microrganismi, tra cui Streptococcus, il cui

comportamento cambia: dove scompare il

colore sono stati lisati tutti gli eritrociti in un

processo di β-emolisi per nutrirsi dell’eme

mentre dove esso rimane, l’eme si accumula

come prodotto di scarto (α-emolisi o no-

emolisi) indicando il tipo di batterio presente.

Il Mannitol Salt Agar (MSA) distingue tra

staphilococchi buoni e cattivi cambiando la

propria colorazione in presenza di patogeni e

rimanendo del rosa naturale se ce ne sono di

fisiologici. Il colorante è il rosso-fenolo che

reagisce al pH acido di S.Aureus, per l’utilizzo di

mannitolo mentre non reagisce per il

metabolismo peptonico. Salt pwechè contiene

Sali di NaCl inefficace sui Sttaphilococchi ma

agente selezionante sugli altri microrganismi.

REPLICAZIONE DNA PROCARIOTI

È un meccanismo semiconservativo che parte da

un’unica origine e procede in maniera bidirezionale; si

arresta quando le due forche si incontrano, caso non

presente in alcuni plasmidi come i plasmidi-F che sono

unidirezionali. La duplicazione nei procarioti avviene

grazie all’enzima DNA-Polimerasi che però non è in grado

di svolgere l’α-elica, di iniziare a partire da due

desossinucleotidi trifosfati (poiché necessita di primers) e

di unirli; sono in grado solo di estendere il filamento in

una sola direzione mentre per il resto sono necessarie

alcune proteine accessorie. Il meccanismo è discontinuo

perché su uno dei due filamenti la sintesi non avviene “in

continui” bensì a frammenti che prendono il nome di

frammenti di Okazaki la cui unione avverrà in seguito.

I buchi lasciati dai primers a RNA verranno poi riempiti e

legati da una serie di proteine ed enzimi. In E.Coli ci sono 5 DNA-Pol, di cui solo la

III e la I intervengono in questo

processo: III interviene nella

duplicazione e I interviene nella

riparazione dei frammenti mentre le

Isomerasi rilassano le molecole di DNA

e le DNA-Girasi agiscono sui due nuovi

filamenti di DNA e li separano. 22

L’inizio della sintesi avviene in una ORI-C di circa 250 bp, caratterizzata da alcuni elementi nucleotidici,

chiamati DNA-Box, riconosciuti dalla DNA-A, una proteina ATPsintasi sensibile a sequenze specifiche;

quando avviene il legame forma un dominio con essa che cambia la topologia della doppia elica arrivando

ad indebolire i legami idrogeno presenti a monte e separando i filamenti con una bolla in cui poi si inserirà

una Elicasi (due, una per filamento) il cui compito sarà di svolgere i filamenti in senso opposto.

Infine entra e si

lega anche SSB

(Single Strand

Binding) per

impedire la

riassociazione dei

due filamenti,

seguita da DNA-G,

altro nome della

RNA-Polimerasi che

sintetizzerà i

primers.

Tale processo negli

eucarioti inizia in

una certa fase del

ciclo cellulare, nei

batteri però è presente un tipo di controllo diverso: dipende dalla disponibilità di ORI-C a legarsi con DNA-A

e dalle DAM, metilasi presenti solo sul nuovo filamento e che ne impediscono la replicazione.

Il genoma di E.Coli misura circa 4,6 Mbp e, con la velocità di replicazione delle polimerasi, il tutto dovrebbe

completarsi in 35 minuti; sperimentalmente però si è visto che in laboratorio esso si riproduce in soli 30

minuti grazie ad una diversa modalità di controllo e coordinazione delle fasi del ciclo cellulare.

La DNA-Pol III ha 4 tipi di subunità:

Una catalitica (esonucleasi)

Una “sliding Clamp”: funge da morsetto

scorrevole sul DNA

Una Clamp-Loader (verde nel disegno)

Dimero Tau (τ): tiene uniti i due nuclei enzimatici

La RNA-Nucleasi H rimuove i primers a RNA formando dei “buchi” riempiti dalla DNA-Pol I con le sequenze

nucleotidiche di DNA mancanti e collegando i vari frammenti con legami fosfodiestere grazie all’intervento

di una ligasi a DNA; la terminazione avviene con lo scontro delle due forche in una zona ricca di sequenze

dette TER (da Termination) che richiamano proteine TUS per fermare il processo ed infine con l’intervento

di una Girasi (la topoisomerasi IV) che separa i due plasmidi ancora incastrati tra loro.

I dati indicano che mediamente viene sbagliata una base su un milione mentre l’aggiunta di basi extra è

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ancora più rara (1 su 10 ) vista la presenza di sistemi di correzione (chiamata anche Profreeding) svolta da

proteine accessorie al nucleo catalitico; ai virus questo invece capita molto più di frequente, circa 1 su

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10 /10 . 23

METABOLISMO

Si riferisce a reazioni biochimiche cellulari che

sintetizzano o demoliscono alcune molecole

per cui è necessaria dell’energia; i processi di

sintesi, nei procarioti e negli eucarioti, sono

simili a differenza di quelli catabolici poiché

quest’ultimi sono in grado di ricavare energia

dall’ambiente potendo attingere a diverse

fonti. Gli eucarioti sfruttano elementi come il

Carbonio organico (si parla di Chemio-

Organotrofi) così come alcuni procarioti ma

altri, come le piante, sono fototrofi. Troviamo

anche specie Chemio-Litotrofe cioè organismi in grado di vivere con molecole inorganiche come S, NH , CO,

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H e H S o Archea che, a differenza degli eucarioti, sono in grado di sfruttare la CO .

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L’uomo si definisce un Chemio-Organotrofo Eterotrofo poiché usa atomi di carbonio che ricava da

macromolecole come i carboidrati mentre le piante sono Fototrofe Autotrofe in quanto sfruttano il

Carbonio inorganico atmosferico per trasformarlo in composti organici.

CATABOLISMO

Produce elementi che permettono di compiere Anabolismo, ovvero processi di sintesi, come molecole ad

alta energia di idrolisi o con potere riducente; le reazioni che provocano sono redox cellulare dove il

substrato nutritivo può accettare o donare energia sfruttando molecole in grado di immagazzinarla

temporalmente come ATP, PEPE o acetilfosfato. I processi cellulari però comprendono anche reazioni di

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deidrogenazione, in cui gli elettroni (e ) vengono raccolti da coenzimi, come ad esempio il NAD, che passano

da una forma ossidata ad una ridotta per un certo periodo. 30.03.14

CONSERVAZIONE DELL’ENERGIA

La divisione più semplice che è possibile effettuare è tra metabolismi Aerobi ed Anaerobi: agli estremi

infatti troviamo i cosiddetti aerobi ed anaerobi Obbligati, organismi che necessitano assolutamente della

presenza o dell’assenza di una certa condizione per respirare e quindi vivere e compiere metabolismo.

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Tra gli Aerobi troviamo i Facoltativi, specie per cui non è strettamente necessaria la presenza di ossigeno

ma che ne traggono comunque benefici, dotati di metabolismo fermentativo alternativo ed i Microaerofili

in cui una tensione di ossigeno superiore a 20% risulta dannosa.

Tra gli Anaerobi invece troviamo gli Aerotolleranti, i quali pur reggendo l’ossigeno non lo mantenendo un

metabolismo a fermentazione.

FERMENTAZIONE

L’accettore ed il donatore di elettroni sono sempre molecole organiche, utilizzate in ambienti privi di

ossigeno come sacche di gas, paludi o il colon animale; l’ATP è prodotto in un processo chiamato

Fosforilazione a livello di substrato insieme ad una certa quantità di equivalenti riducenti che verranno

consumati (cioè ridotti a NADH e FADH ) e riossidati (recuperati come NAD e FAD) nel corso del

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metabolismo. È uno dei più antichi metabolismi, evolutosi per primo e rimasto uguale in alcuni organismi

mentre in altri viene usato come fase preliminare per una serie

di reazioni più ampie; i substrati sono carboidrati, polimeri di

monosaccaridi di cui il glucosio è il miglior esponente, e

proteine. Il metabolismo del glucosio incrocia diverse vie con

l’acido piruvico, suo prodotto ossidato (nel Glc ha 0 mentre nel

PYR il carbonio ha +2 o +3) i cui elettroni saranno accolti dai

coenzimi.

Nella Glicolisi il PYR viene ridotto per riossidare il potere

riducente del NAD che così viene riciclato: ciò avviene

riducendo il PYR in diverse molecole a seconda del tipo di

metabolismo dell’organismo in questione. Si divide in 6 tipologie in cui però i caratteri generali sono uguali

per tutti; sono molto importanti per scopi pratici come produzione di alimenti, molecole industriali e

diagnosi patologiche: