Lezioni, Microbiologia generale

Microbiologia 05.03.14

E’ lo studio dei microrganismi che vivono come singoli individui costituiti da una sola cellula

(UNICELLULARI). Alcuni possono relazionarsi in gruppi chiamati clusters diversi dai tessuti animali o

vegetale, rimanendo in grado di crescere e nutrirsi indipendentemente.

La cellula animale/vegetale può sopravvivere in vitro ma con dei limiti in replicazione e nutrimento a

differenza di quanto accade per le cellule batteriche: esse in coltura si associano in colonie di 1-10 milioni di

individui.

Ma quanto sono grandi batteri e virus? In ordine decrescente di grandezza troviamo:

Epiteli animali (10-20 µm)

Eucarioti (es. Saccaromices Cereviasiae: 7-8 µm)

Batteri (es. Procarioti: 1-2 µm)

Virus (10-20 nm)

Per vedere i virus è necessario di servirsi di microscopio elettronico mentre per gli altri basta quello ottico.

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Si sono stimate nel mondo circa 2,5x10 cellule procariote distribuite per il 60% sul fondale marino, per il

25% sulla terra ma anche in tutti gli habitat, uomo compreso.

Cellula: compie del metabolismo estraendo energia dall’ambiente

si riproduce

può differenziare con substrato genetico ed ambientale favorevole cambiando il proprio

comportamento

comunicano scambiando informazioni ed interpretando i segnali come sistemi

si muovono

si evolvono favorendo le caratteristiche genetiche utili alla sopravvivenza nell’ambiente in cui

vivono

IMPATTO SULL’UOMO

Batteri e virus sono responsabili di malattie molto importanti sulla specie umana ma sono solo una piccola

percentuale; per di più essi causano la malattia soltanto in determinate situazioni. La restante parte di loro

ha, se possibile, effetti ancora più importanti giocando un ruolo importante nell’alimentazione (sfruttati

nella preparazione di pane, birra e yogurt), in ambito industriale (es. proteine microbiche), agricolo

(azotazione del terreno) ed allevamento (il rumine delle mucche è ricco di batteri che sintetizzano le

cellulasi permettendo la digestione della cellulosa).

Le più classiche tecniche di conservazione come sale e zucchero (es confetture e marmellate) agiscono

sull’acqua minimizzandone la quantità disponibile impedendo ai batteri di trovare un buon posto per

riprodursi.

Le malattie infettive si sono molto ridotte dal ‘900 grazie anche alla

scoperta di tecniche di prevenzione, vaccini e tecniche terapeutiche

come gli antibiotici, il cui compito è eliminare direttamente la fonte

della malattia. L’avvento degli strumenti necessari a scoprire queste

forme di vita si verifico nel 1664 con Hooke ed il primo microscopio

ma il momento più prolifico è stato tra il 1850 ed il 1900 in cui oltre

ad osservare è stato possibile anche replicare le forma di vita grazie

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alle scoperte di Pasteur.

Esperimento di Pasteur (1864): grazie all’utilizzo di fiasche a

collo di cigno è stato provato che non esiste la generazione

spontanea e che era necessaria una contaminazione dopo una

sterilizzazione per riportare i microrganismi nel liquido.

Kock ha scoperto l’agente responsabile della Tubercolosi umana

ma soprattutto è riuscito ad isolare e riconoscere determinate

caratteristiche, chiamate postulati che vengono usate ancora oggi per riconoscere e classificare le malattie

umane dovute a microrganismi. È anche stato in grado di definire il concetto di coltura pura: coltura

omogenea, solo di uno specifico microrganismo, effettuata su terreno solido per far si che le (eventuali)

varie colonie non si mischino tra loro: egli dapprima utilizzo delle fette di patata, poi la gelatina e infine

l’Agar, un estratto di alghe rosse che sciolto a caldo in acqua la rendeva solida a temperatura ambiente.

06.03.14

POSTULATI DI KOCK

Non devono essere presi in senso assoluto ed accettare eccezioni; sono utilizzati ancora oggi come nel caso

della SARS in modo da poter individuare il virus responsabile ma Kock li sviluppò su una patologia animale

ed umana presente ai suoi tempi e causata da un batterio: il Carbonchio.

1. L’organismo sospetto patogeno deve essere presente in tutti i casi malati ed in nessuno dei sani. Le

eccezioni sono i portatori sani, coloro che ospitano l’organismo ma senza presentare infezione.

2. L’organismo sospetto deve poter crescere in coltura pura.

3. Cellule ottenute da una coltura pura se iniettate in soggetti sani devono causare la malattia.

4. L’organismo deve poter essere nuovamente isolato e se ne deve poter dimostrare l’identità con la

coltura originale.

IL MONDO MICROBICO

La cellula Procariote

(letteralmente: falso

nucleo) mostra

genoma sparpagliato,

un citoplasma,

ribosomi, una

membrana

citoplasmatica, una

parete cellulare e

risulta essere molto

più piccola di una

Eucariote.

La

La cellula Eucariote (nuovo nucleo) presenta invece una membrana che racchiude il materiale genetico

oltre a tutta una serie di organelli assenti nella collega; inoltre è di dimensioni molto maggiori.

Ma come sono imparentate?

Originariamente la vita era divisa in 3 regni: protista (comprendente alghe, funghi, protozoi e batteri),

animale e vegetale ma l’arrivo del microscopio permise di trovare nuove differenze e nuove similitudini

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arrivando a dividere le forme di vita tra Procarioti (cioè i batteri) e gli Eucarioti (protozoi, alghe, funghi,

animali e piante).

Al giorno d’oggi vi sono 3 Domini, scelti per aspetti

Fenotipici ed evolutivi in cui si è divisa la vita a partire

da un progenitore comune: sono state

seguite 3 vie evolutive

Batteri

Archea

Eucarioti

Si è cercato di trovare le differenze e le somiglianze

per sequenze geniche con la stessa funzione, ad

esempio i geni per l’RNA ribosomiale 18S animale

confrontato con quello 16S batterico.

Il punto di partenza, radice dell’albero, è LUCA, acroni_

mo di Last Universal Common Ancestor, vissuto 3,5 miliardi di anni fa ed ultimo organismo avente tratti

comuni a tutti e 3 i domini.

STRUTTURA E FUNZIONE DEI PROCARIOTI

Sono quasi sempre più piccoli degli eucarioti: E.Coli misura 1x3 µm, Hemophilus Influenzae 0,25x1,2 µm

mentre Streptococcus Pneumoniae è molto piccolo, costituito da sferette di 0,8 µm. Esistono però delle

eccezioni come Oscillatoria che arriva a misurare 8x50 µm.

Le forme sono molto variabili e sono determinate solo in parte dal citoscheletro; troviamo:

COCCHI: diplococchi se dopo la divisione rimangono

uniti in fila, tipico di specie come Streptococcus Pn.,

ma anche grappoli di 4 o 8 tipici di poche specie

(stafilococchi) sia patogeni che non. 3

BACILLI: singoli ma anche a coppia (diplobacilli)

catene (streptobacilli)

VIBRIONI: piccoli bacilli con una leggera piega

dell’asse lungo, es. Colera.

SPIRILLI e SPIROCHETE: asse lungo attorcigliato su

se stesso, agenti rispettivamente della Malattia di

Lyme e della Sifilide.

Il rapporto S/V deve rimanere alto per offrire vantaggi metabolici, infatti sono favoriti più cocchi piccoli

piuttosto che quelli grandi; un altro fattore che influenza la forma del batterio è la produzione di proteine

con forme diverse ma strutturalmente simili ad actina e tubulina (es MRE-B, FTSZ e Crescentina).

PARETE CELLULARE

È riconducibile a due modelli fondamentali ma non è

presente nella totalità dei batteri, infatti clamidie e

micoplasmi risultano esserne privi e gli Archea ne han_

no una versione molto più eterogenea dal punto di vis_

ta della composizione biochimica.

È rigida, da forma e protegge il batterio all’interno come

una corazza, resistendo agli urti, alle compressioni e a dif_

ferenze di pressioni osmotiche anche elevate; nonostante

queste caratteristiche è flessibile in determinate condizioni

ed è vitale per quei batteri che vivono in ambiente ipotoni_

co, funzionando anche come selettore permeabile. Però

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funge anche da bersaglio per l’azione degli antibiotici che vanno ad intervenire unicamente su quelle

componenti esclusive del batterio ed assenti nell’ospite secondo un principio di Tossicità Selettiva. La lisi di

questa parete libera dei frammenti nocivi per l’ospite, scatenando stati febbrili, e risposte immunitarie

anche importanti risultando anche fatali.

I virus sono molto più difficile da colpire seguendo questo ragionamento perchè si riproducono all’interno

delle cellule dell’ospite e rendono necessario l’utilizzo di Antivirali.

COLORAZIONE DI GRAM

Esegue su un vetrino una colorazione utilizzando due coloranti diversi per ottenere la distinzione tra Gram

Positivi (G+) e Gram Negativi (G-) solo però dopo aver ucciso ai batteri, per consentire al colorante di

penetrare all’interno delle cellule, per disidratazione da passaggio su fiamma di bunsen in un processo

chiamato Fissazione al calore. I due coloranti sono Cristalvioletto e Fucsina:

la prima colorazione, con il cristalvioletto, rende tutte le cellule viola e precede un trattamento con

del KCl il cui compito è formare dei complessi di colorante anche all’interno del microrganismo

in seguito un solvente, applicato per 20 secondi, tira fuori il complesso colorato solo da alcune

cellule che risulteranno poi evidenziate da una seconda colorazione con la fucsina (anche chiamata

Safranina) diventando di colore rosa/rosso.

GRAM+: Violette (es. Staphilococcus Aureus)

GRAM -: Rosa/Rosso (es. E.Coli)

Questa differenza è riconducibile alla diversa composizione e struttura della parete cellulare:

G+: sono più spesse e con un unico strato, ricche di peptidoglicani (esclusivo solo del dominio batterico) e

acidi teicoici ma povere di lipidi, proteine, lipoproteine e lipopolisaccaridi.

GRAM POSITIVI GRAM NEGATIVI

G-: risultano più sottili e formate da un unico strato povero di peptidoglicano, senza acidi teicoici ma con

elevate quantità di lipidi, lipoproteine, proteine e lipopolisaccaridi.

I G+ si presentano molto più uniformi e lisce rispetto a G- perché quest’ultime sono formate da un doppio

strato di cui uno interno (di peptidoglicano) e uno esterno (lipopolisaccaridico e proteico) più simile alla

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membrana citolasmatica. Il peptidoglicano, presente in entrambi i tipi ma in concentrazioni diverse, è

costituito da monomeri (chiamati glicantetrapeptidi) di disaccaride di N-acetilglucosammina (NAG) e

acido n-acetimuranico (NAM) uniti da legame β(1,4),

sensibile al lisozima, a cui risulta legato un peptide di 4 AA

che si unisce ad una molecola di acido lattico. L’acido

glutammico, uno dei 4 AA coinvolti, è presente in forma D

solo per formare questo peptide resistente alle proteasi in

uno schema L-D-L-D alternati diversi e specifici per G+ e G-

Il legame tra NAM e NAG è di tipo β(1,4) ed è il sito di

attacco del Lisozima che, presente in lacrime, saliva ed

albume, difende i pluricellulari dai batteri tagliando la loro

parete cellulare come componente della immunità innata.

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Gli AA che si alternano nel caratteristico schema L-D-L-D

sono utilizzati solo per la struttura e non per

l’alimentazione e vengono ripetuti per un numero

variabile di volte a seconda della specie: E.Coli ha 20-40 ripetizioni mentre Staph. Aureus 18-20.

Nei G- il primo AA, unito all’acido lattico di collegamento con NAM, è la L-alanina seguito quasi sempre

dall’acido glutammico; il terzo è l’acido Diamino-Pimelico (abbreviato come DAP) dotato di un COOH e un

NH in più, seguito da una D-Alanina.

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Nei G+ gli AA in posizione 1,2 e 4 sono mantenuti mentre il terzo è sostituito dalla L-Lisina, anch’essa però

in grado, avendo a disposizione un altro gruppo NH , di formare altri legami peptidici tra tetra peptidi

2 appartenenti a diverse file parallele.

In posizione 3, sia nei G+ che nei G-, ci sono altri

legami potenzialmente disponibili, come ad esempio

tra 3-L-DAP e 4-D-Ala di due file diverse tipico dei G-,

che legano covalentemente le catene parallele

rinforzando l’intera struttura di peptidoglicano.

G+ ha sempre legame tra 3-L-Lys e 4-D-Ala ma esso

risulta essere indiretto perché si interpongono 5

glicine in un ponte glicinico con un C-term che si lega

alla 3-L-Lys ed un N-term che si lega alla 4-D-Ala.

ACIDI TEICOICI

È un polimero, caratteristico dei G+, di ribitol-forsfato (5C), o glicerol-fosfato, a forma di lunga catena che si

inserisce verticalmente nello spessore di peptidoglicani fino quasi a giungere alla membrana citoplasmatica

associandosi con i lipidi in essa contenuti formando gli Acidi Lipoteicoici.

MICOPLASMI

Esistono dei G+ che si colorano male utilizzando la colorazione di Gram pur avendo una parete cellulare

anche se organizzata diversamente; un esempio è il Mycobacterium Tubercolosis che presenta strato

peptidoglicanico interno circondato da molecole caratteristiche, gli acidi micolici (grassi a lunga

catena)rivestiti da glicolipidi fenolici. I peptidoglicani interni sono molto compatti ed uniti agli acidi micolici

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da Arabinogalattati in una struttura che risulta impermeabile ai coloranti ma anche a sostanze chimiche

come farmaci o antibiotici.

Per colorali quindi uso una colorazione acida e alcol-resistente (Ziehl-Nielsen) sfruttando un colorante rosso

ed uno azzurro: il primo però richiede condizioni più estreme per poter penetrare la membrana, come ad

esempio un intenso calore che lo vaporizzi in cicli (fiamma-vapori-stop fiamma-stop vapori) ripetuti per 3-4

minuti, in modo da colorare tutte le cellule presenti. È molto difficile da rimuovere una volta che è stato

applicato quindi con acido ed alcol decoloro tutto ciò che non è micoplasma per poi applicare il blu di

metilene: la positività al rosso molto specifica per la presenza di Mycobatteri e come ulteriore controprova

si può effettuare una PCR o una coltivazione.

GRAM NEGATIVI

Hanno come modelli E.Coli, la parete cellulare è più sottile,

con meno peptidoglicani, totalmente priva di acidi teicoici

ma molto ricca di lipoproteine, lipidi ed il caratteristico

Lipopolisaccaride. Il periplasma è lo spazione compreso tra la

membrana esterna e quella citoplasmatica diverse tra loro

per una mancanza di simmetria nella prima e due diversi

foglietti lipidici costituenti: quello interno della membrana

esterna è fosfolipidico proprio come i due della membrana

interna mentre quello esterno a composizione

lipopolisaccaridica.

Lipopolisaccaride: è costituito da una parte saccaridica e una

lipidica, risultando perciò antipatico; la parte lipidica (gialla)

è chiamata Lipide-A e risulta idrofoba mentre il core

polisaccaridico (viola), unito al Polisaccaride-O (o Antigene-

O) è la porzione che induce la risposta immunitaria

nell’ospite con diversi anticorpi a seconda non solo della

specie ma anche del singolo individuo.

Il Lipide-A si affaccia ai fosfolipidi interni poiché è un dimero di NAG (con ossidrili fosforilati e con acidi

grassi a linga catena) per formare le code; attaccato ad esso troviamo il core polisaccaridico costituito da

monosaccaridi anche a 7C ma soprattutto KDO (acido 2-Cheto-3-DesossiOttonico)che si lega

covalentemente al com il lipide in una struttura decisamente tipica dei G-.

Il polisaccaride-O è costituito da 4 zuccheri

ripetuti in numeri diversi a seconda

dell’individuo effettuando una selezione

molto specifica degli anticorpi di cui

provoca la formazione.

Il Lipopolisaccaride (LPS) è esclusivo dei G-

ed è un elemento strutturale che

contribuisce a determinare la capacità di

provocare un danno all’ospite

(patogenicità) mentre il lipide-A è un vero

e proprio veleno metabolico; 1 grammo di

LPS o una infezione di G- non controllata

porta inevitabilmente al decesso per

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emorragia diffusa, shock settico e stato febbrile a causa dei frammenti litici della membrana batterica.

Gli ospiti più evoluti però hanno sistema immunitario specifico con cellule dotate di recettori , chiamati TLR.

Toll-Like-Receptor, in grado di riconoscere delle molecole-firma dei batteri, come ad esempio i

peptidoglicani, i LPS o gli acidi teicoici, rispondendo con molecole pro-infiammatorie (come le Citochine)

che avvisano dell’infezione. Es. TLR-4 riconosce il LPS ma se esso è presente in quantità eccessiva la risposta

immunitaria diventa eccessiva e patologica in un processo simile all’infezione virale.

Anche i G- sono dotate di proteine sulla membrana che la attraversano per tutto lo spessore, come accade

per gli acidi teicoici nei G+, che la collegano al peptidoglicano ricoprendo un ruolo fondamentale nella

comunicazione tra esterno e periplasma o nell’importazione di molecole con permeabilità selettiva

(Porine): sono organizzate in strutture secondarie che permettono l’assemblemento di barili-β cavi,

antiparelleli e cilindrici il cui compito è fungere da setaccio molecolare e consentire l’ingresso solo di

determinate molecole per diffusione facilitata senza l’impiego di energia.

Nei G- non tutti i tetrapeptidi formano legami con le catene parallele (20-30%) e risultano negativi al Gram

poiché lo strato di peptidoglicano è più sottile e non riesce a trattenere il cristalvioletto.

SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO

Il precursore è il GlicanTetrapeptide composto da 5 AA con la D-Alanina terminale ripetuta due volte e

costruito all’interno della cellula per poi essere associato ad nella membrana citoplasmatica ad un

trasportatore, il Bactoprenolo (polialcol a 5C situato all’interno della memb. Plasmatica) che ne permette il

passaggio verso l’esterno; una volta fuori le transglicosidasi e le transpeptidasi formeranno i legami tra le

file parallele interni ed incrociati grazie all’energia ricavata dall’idrolisi tra il 4° ed il 5° AA. Le transpeptidasi

però sono anche il sito di legame per le Pennicilline (PBP: pennicillin binding protein) che si legano