Lezioni, Microbiologia generale

Microbiologia

Lo studio dei microrganismi che vivono come singoli individui costituiti da una sola cellula (unicellulari). Alcuni possono relazionarsi in gruppi chiamati clusters, diversi dai tessuti animali o vegetali, rimanendo in grado di crescere e nutrirsi indipendentemente. La cellula animale/vegetale può sopravvivere in vitro ma con dei limiti in replicazione e nutrimento a differenza di quanto accade per le cellule batteriche: esse in coltura si associano in colonie di 1-10 milioni di individui.

Dimensioni di batteri e virus

In ordine decrescente di grandezza troviamo:

• Epiteli animali (10-20 µm)
• Eucarioti (es. Saccaromyces Cerevisiae: 7-8 µm)
• Batteri (es. Procarioti: 1-2 µm)
• Virus (10-20 nm)

Per vedere i virus è necessario servirsi di un microscopio elettronico, mentre per gli altri basta quello ottico.

Si sono stimate nel mondo circa 2,5x10³⁰ cellule procariote distribuite per il 60% sul fondale marino, per il 25% sulla terra ma anche in tutti gli habitat, uomo compreso.

Funzioni della cellula

La cellula:

• Compie del metabolismo estraendo energia dall’ambiente
• Si riproduce
• Può differenziarsi con substrato genetico ed ambientale favorevole cambiando il proprio comportamento
• Comunica scambiando informazioni ed interpretando i segnali come sistemi
• Si muove
• Si evolve favorendo le caratteristiche genetiche utili alla sopravvivenza nell’ambiente in cui vivono

Impatto sull’uomo

Batteri e virus sono responsabili di malattie molto importanti sulla specie umana ma sono solo una piccola percentuale; per di più essi causano la malattia soltanto in determinate situazioni. La restante parte di loro ha, se possibile, effetti ancora più importanti giocando un ruolo significativo nell’alimentazione (sfruttati nella preparazione di pane, birra e yogurt), in ambito industriale (es. proteine microbiche), agricolo (azotazione del terreno) ed allevamento (il rumine delle mucche è ricco di batteri che sintetizzano le cellulasi permettendo la digestione della cellulosa).

Le più classiche tecniche di conservazione come sale e zucchero (es. confetture e marmellate) agiscono sull’acqua minimizzandone la quantità disponibile impedendo ai batteri di trovare un buon posto per riprodursi.

Le malattie infettive si sono molto ridotte dal '900 grazie anche alla scoperta di tecniche di prevenzione, vaccini e tecniche terapeutiche come gli antibiotici, il cui compito è eliminare direttamente la fonte della malattia. L’avvento degli strumenti necessari a scoprire queste forme di vita si verificò nel 1664 con Hooke ed il primo microscopio, ma il momento più prolifico è stato tra il 1850 ed il 1900 in cui oltre ad osservare è stato possibile anche replicare le forme di vita grazie alle scoperte di Pasteur.

Esperimento di Pasteur (1864)

Grazie all’utilizzo di fiasche a collo di cigno è stato provato che non esiste la generazione spontanea e che era necessaria una contaminazione dopo una sterilizzazione per riportare i microrganismi nel liquido.

Koch ha scoperto l’agente responsabile della Tubercolosi umana ma soprattutto è riuscito ad isolare e riconoscere determinate caratteristiche, chiamate postulati, che vengono usate ancora oggi per riconoscere e classificare le malattie umane dovute a microrganismi. È anche stato in grado di definire il concetto di coltura pura: coltura omogenea, solo di uno specifico microrganismo, effettuata su terreno solido per far sì che le (eventuali) varie colonie non si mischino tra loro: egli dapprima utilizzò delle fette di patata, poi la gelatina e infine l’Agar, un estratto di alghe rosse che sciolto a caldo in acqua la rendeva solida a temperatura ambiente.

Postulati di Koch

Non devono essere presi in senso assoluto ed accettare eccezioni; sono utilizzati ancora oggi come nel caso della SARS in modo da poter individuare il virus responsabile, ma Koch li sviluppò su una patologia animale ed umana presente ai suoi tempi e causata da un batterio: il Carbonchio.

• L’organismo sospetto patogeno deve essere presente in tutti i casi malati ed in nessuno dei sani. Le eccezioni sono i portatori sani, coloro che ospitano l’organismo ma senza presentare infezione.
• L’organismo sospetto deve poter crescere in coltura pura.
• Cellule ottenute da una coltura pura se iniettate in soggetti sani devono causare la malattia.
• L’organismo deve poter essere nuovamente isolato e se ne deve poter dimostrare l’identità con la coltura originale.

Il mondo microbico

La cellula procariote (letteralmente: falso nucleo) mostra un genoma sparpagliato, un citoplasma, ribosomi, una membrana citoplasmatica, una parete cellulare e risulta essere molto più piccola di una Eucariote. La cellula eucariote (nuovo nucleo) presenta invece una membrana che racchiude il materiale genetico oltre a tutta una serie di organelli assenti nella collega; inoltre è di dimensioni molto maggiori.

Relazioni tra procarioti ed eucarioti

Originariamente la vita era divisa in 3 regni: protista (comprendente alghe, funghi, protozoi e batteri), animale e vegetale ma l’arrivo del microscopio permise di trovare nuove differenze e nuove similitudini arrivando a dividere le forme di vita tra procarioti (cioè i batteri) e gli eucarioti (protozoi, alghe, funghi, animali e piante).

Al giorno d’oggi vi sono 3 Domini, scelti per aspetti fenotipici ed evolutivi in cui si è divisa la vita a partire da un progenitore comune: sono state seguite 3 vie evolutive:

• Batteri
• Archea
• Eucarioti

Si è cercato di trovare le differenze e le somiglianze per sequenze geniche con la stessa funzione, ad esempio i geni per l’RNA ribosomiale 18S animale confrontato con quello 16S batterico. Il punto di partenza, radice dell’albero, è LUCA, acronimo di Last Universal Common Ancestor, vissuto 3,5 miliardi di anni fa ed ultimo organismo avente tratti comuni a tutti e 3 i domini.

Struttura e funzione dei procarioti

Sono quasi sempre più piccoli degli eucarioti: E.Coli misura 1x3 µm, Hemophilus Influenzae 0,25x1,2 µm mentre Streptococcus Pneumoniae è molto piccolo, costituito da sferette di 0,8 µm. Esistono però delle eccezioni come Oscillatoria che arriva a misurare 8x50 µm.

Le forme sono molto variabili e sono determinate solo in parte dal citoscheletro; troviamo:

• Cocchi: diplococchi se dopo la divisione rimangono uniti in fila, tipico di specie come Streptococcus Pn., ma anche grappoli di 4 o 8 tipici di poche specie (stafilococchi) sia patogeni che non.
• Bacilli: singoli ma anche a coppia (diplobacilli), catene (streptobacilli).
• Vibrioni: piccoli bacilli con una leggera piega dell’asse lungo, es. Colera.
• Spirilli e spirochete: asse lungo attorcigliato su se stesso, agenti rispettivamente della Malattia di Lyme e della Sifilide.

Il rapporto S/V deve rimanere alto per offrire vantaggi metabolici, infatti sono favoriti più cocchi piccoli piuttosto che quelli grandi; un altro fattore che influenza la forma del batterio è la produzione di proteine con forme diverse ma strutturalmente simili ad actina e tubulina (es. MRE-B, FTSZ e Crescentina).

Parete cellulare

È riconducibile a due modelli fondamentali ma non è presente nella totalità dei batteri, infatti clamidie e micoplasmi risultano esserne privi e gli Archea ne hanno una versione molto più eterogenea dal punto di vista della composizione biochimica.

È rigida, dà forma e protegge il batterio all’interno come una corazza, resistendo agli urti, alle compressioni e a differenze di pressioni osmotiche anche elevate; nonostante queste caratteristiche è flessibile in determinate condizioni ed è vitale per quei batteri che vivono in ambiente ipotonico, funzionando anche come selettore permeabile. Però funge anche da bersaglio per l’azione degli antibiotici che vanno ad intervenire unicamente su quelle componenti esclusive del batterio ed assenti nell’ospite secondo un principio di Tossicità Selettiva. La lisi di questa parete libera dei frammenti nocivi per l’ospite, scatenando stati febbrili, e risposte immunitarie anche importanti risultando anche fatali.

I virus sono molto più difficili da colpire seguendo questo ragionamento perché si riproducono all’interno delle cellule dell’ospite e rendono necessario l’utilizzo di Antivirali.

Colorazione di Gram

Si esegue su un vetrino una colorazione utilizzando due coloranti diversi per ottenere la distinzione tra Gram Positivi (G+) e Gram Negativi (G-) solo però dopo aver ucciso i batteri, per consentire al colorante di penetrare all’interno delle cellule, per disidratazione da passaggio su fiamma di Bunsen in un processo chiamato Fissazione al calore. I due coloranti sono Cristalvioletto e Fucsina: la prima colorazione, con il cristalvioletto, rende tutte le cellule viola e precede un trattamento con del KCl il cui compito è formare dei complessi di colorante anche all’interno del microrganismo; in seguito un solvente, applicato per 20 secondi, tira fuori il complesso colorato solo da alcune cellule che risulteranno poi evidenziate da una seconda colorazione con la fucsina (anche chiamata Safranina) diventando di colore rosa/rosso.

Gram+: Violette (es. Staphilococcus Aureus)
Gram-: Rosa/Rosso (es. E.Coli)

Questa differenza è riconducibile alla diversa composizione e struttura della parete cellulare:

• G+: Sono più spesse e con un unico strato, ricche di peptidoglicani (esclusivo solo del dominio batterico) e acidi teicoici ma povere di lipidi, proteine, lipoproteine e lipopolisaccaridi.
• G-: Risultano più sottili e formate da un unico strato povero di peptidoglicano, senza acidi teicoici ma con elevate quantità di lipidi, lipoproteine, proteine e lipopolisaccaridi.

I G+ si presentano molto più uniformi e lisce rispetto a G- perché quest’ultime sono formate da un doppio strato di cui uno interno (di peptidoglicano) e uno esterno (lipopolisaccaridico e proteico) più simile alla membrana citoplasmatica. Il peptidoglicano, presente in entrambi i tipi ma in concentrazioni diverse, è costituito da monomeri (chiamati glicante-trapeptidi) di disaccaride di N-acetilglucosammina (NAG) e acido N-acetilmuranico (NAM) uniti da legame β(1,4), sensibile al lisozima, a cui risulta legato un peptide di 4 AA che si unisce ad una molecola di acido lattico. L’acido glutammico, uno dei 4 AA coinvolti, è presente in forma D solo per formare questo peptide resistente alle proteasi in uno schema L-D-L-D alternati diversi e specifici per G+ e G-.

Il legame tra NAM e NAG è di tipo β(1,4) ed è il sito di attacco del Lisozima che, presente in lacrime, saliva ed albume, difende i pluricellulari dai batteri tagliando la loro parete cellulare come componente della immunità innata.

Struttura degli aminoacidi

Gli AA che si alternano nel caratteristico schema L-D-L-D sono utilizzati solo per la struttura e non per l’alimentazione e vengono ripetuti per un numero variabile di volte a seconda della specie: E.Coli ha 20-40 ripetizioni mentre Staph. Aureus 18-20.

Nei G- il primo AA, unito all’acido lattico di collegamento con NAM, è la L-alanina seguita quasi sempre dall’acido glutammico; il terzo è l’acido Diamino-Pimelico (abbreviato come DAP) dotato di un COOH e un NH in più, seguito da una D-Alanina.

Nei G+ gli AA in posizione 1,2 e 4 sono mantenuti mentre il terzo è sostituito dalla L-Lisina, anch’essa però in grado, avendo a disposizione un altro gruppo NH, di formare altri legami peptidici tra tetra peptidi appartenenti a diverse file parallele.

In posizione 3, sia nei G+ che nei G-, ci sono altri legami potenzialmente disponibili, come ad esempio tra 3-L-DAP e 4-D-Ala di due file diverse tipico dei G-, che legano covalentemente le catene parallele rinforzando l’intera struttura di peptidoglicano. G+ ha sempre legame tra 3-L-Lys e 4-D-Ala ma esso risulta essere indiretto perché si interpongono 5 glicine in un ponte glicinico con un C-term che si lega alla 3-L-Lys ed un N-term che si lega alla 4-D-Ala.

Acidi teicoici

È un polimero, caratteristico dei G+, di ribitol-fosfato (5C), o glicerol-fosfato, a forma di lunga catena che si inserisce verticalmente nello spessore di peptidoglicani fino quasi a giungere alla membrana citoplasmatica associandosi con i lipidi in essa contenuti formando gli Acidi Lipoteicoici.

Micoplasmi

Esistono dei G+ che si colorano male utilizzando la colorazione di Gram pur avendo una parete cellulare anche se organizzata diversamente; un esempio è il Mycobacterium Tuberculosis, che presenta strato peptidoglicanico interno circondato da molecole caratteristiche, gli acidi micolici (grassi a lunga catena) rivestiti da glicolipidi fenolici. I peptidoglicani interni sono molto compatti ed uniti agli acidi micolici da Arabinogalattati in una struttura che risulta impermeabile ai coloranti ma anche a sostanze chimiche come farmaci o antibiotici.

Per colorarli quindi uso una colorazione acida e alcol-resistente (Ziehl-Nielsen) sfruttando un colorante rosso ed uno azzurro: il primo però richiede condizioni più estreme per poter penetrare la membrana, come ad esempio un intenso calore che lo vaporizzi in cicli (fiamma-vapori-stop fiamma-stop vapori) ripetuti per 3-4 minuti, in modo da colorare tutte le cellule presenti. È molto difficile da rimuovere una volta che è stato applicato quindi con acido ed alcol decoloro tutto ciò che non è micoplasma per poi applicare il blu di metilene: la positività al rosso è molto specifica per la presenza di Mycobatteri e come ulteriore controprova si può effettuare una PCR o una coltivazione.

Gram negativi

Hanno come modelli E.Coli, la parete cellulare è più sottile, con meno peptidoglicani, totalmente priva di acidi teicoici ma molto ricca di lipoproteine, lipidi ed il caratteristico Lipopolisaccaride. Il periplasma è lo spazio compreso tra la membrana esterna e quella citoplasmatica diverse tra loro per una mancanza di simmetria nella prima e due diversi foglietti lipidici costituenti: quello interno della membrana esterna è fosfolipidico proprio come i due della membrana interna mentre quello esterno ha composizione lipopolisaccaridica.

Lipopolisaccaride: È costituito da una parte saccaridica e una lipidica, risultando perciò anfipatico; la parte lipidica (gialla) è chiamata Lipide-A e risulta idrofoba mentre il core polisaccaridico (viola), unito al Polisaccaride-O (o Antigene-O) è la porzione che induce la risposta immunitaria nell’ospite con diversi anticorpi a seconda non solo della specie ma anche del singolo individuo.

Il Lipide-A si affaccia ai fosfolipidi interni poiché è un dimero di NAG (con ossidrili fosforilati e con acidi grassi a lunga catena) per formare le code; attaccato ad esso troviamo il core polisaccaridico costituito da monosaccaridi anche a 7C ma soprattutto KDO (acido 2-Cheto-3-DesossiOttonico) che si lega covalentemente al com il lipide in una struttura decisamente tipica dei G-.

Il polisaccaride-O è costituito da 4 zuccheri ripetuti in numeri diversi a seconda dell’individuo effettuando una selezione molto specifica degli anticorpi di cui provoca la formazione. Il Lipopolisaccaride (LPS) è esclusivo dei G- ed è un elemento strutturale che contribuisce a determinare la capacità di provocare un danno all’ospite (patogenicità) mentre il lipide-A è un vero e proprio veleno metabolico; 1 grammo di LPS o un'infezione di G- non controllata porta inevitabilmente al decesso per emorragia diffusa, shock settico e stato febbrile a causa dei frammenti litici della membrana batterica.

Gli ospiti più evoluti però hanno sistema immunitario specifico con cellule dotate di recettori, chiamati TLR, Toll-Like-Receptor, in grado di riconoscere delle molecole-firma dei batteri, come ad esempio i peptidoglicani, i LPS o gli acidi teicoici, rispondendo con molecole pro-infiammatorie (come le Citochine) che avvisano dell’infezione. Es. TLR-4 riconosce il LPS ma se esso è presente in quantità eccessiva la risposta immunitaria diventa eccessiva e patologica in un processo simile all’infezione virale.

Anche i G- sono dotate di proteine sulla membrana che la attraversano per tutto lo spessore, come accade per gli acidi teicoici nei G+, che la collegano al peptidoglicano ricoprendo un ruolo fondamentale nella comunicazione tra esterno e periplasma o nell’importazione di molecole con permeabilità selettiva (Porine): sono organizzate in strutture secondarie che permettono l’assemblamento di barili-β cavi, antiparalleli e cilindrici il cui compito è fungere da setaccio molecolare e consentire l’ingresso solo di determinate molecole per diffusione facilitata senza l’impiego di energia.

Nei G- non tutti i tetrapeptidi formano legami con le catene parallele (20-30%) e risultano negativi al Gram poiché lo strato di peptidoglicano è più sottile e non riesce a trattenere il cristalvioletto.

Sintesi del peptidoglicano

Il precursore è il GlicanTetrapeptide composto da 5 AA con la D-Alanina terminale ripetuta due volte e costruito all’interno della cellula per poi essere associato a nella membrana citoplasmatica ad un trasportatore, il Bactoprenolo (polialcol a 5C situato all’interno della memb. Plasmatica) che ne permette il passaggio verso l’esterno; una volta fuori le transglicosidasi e le transpeptidasi formeranno i legami tra le file parallele interni ed incrociati grazie all’energia ricavata dall’idrolisi tra il 4° ed il 5° AA. Le transpeptidasi però sono anche il sito di legame per le Pennicilline (PBP: penicillin binding protein) che si legano.