Lezioni, Genetica medica

XPA

ERCC/XPF XPG

5’ Frammento di 24-32 basi

DNA pol δ/ε (PCNA)

DNA ligase

Questo sistema opera su un intero nucleotide (mentre nel primo sistema si operava sulle basi):

interviene quando la distorsione della doppia elica del DNA è così grave (ad esempio a causa di un

dimero di timina), che non ci sono glicosidasi che possono riparare il danno; interviene anche

quando una base azotata o dei nucleotidi nella loro totalità vengono modificati, per esempio, da

mutageni chimici, che agiscono legando dei gruppi alchilici alle basi azotate, con modificazioni che

distorcono gravemente la doppia elica di DNA creando le condizioni perché si arresti la replicazione

del DNA. A questo punto deve intervenire questo sistema di riparo, che ha una doppia via:

• NER Global genome: sistema attivo su tutto il genoma in ogni momento del ciclo cellulare,

indipendentemente dalla trascrizione. Il danno viene monitorato da una specifica proteina

220

sensore (XPC) che fa lo scanner del DNA e quando incontra un danno recluta le proteine

utili al riparo;

• NER accoppiato alla trascrizione: entrerà in funzione quando, durante la trascrizione di un

gene, la RNA polimerasi II incontrerà l’ostacolo dovuto, ad esempio, a un dimero di timina.

La RNA polimerasi arriva a livello del danno, si blocca (riconoscimento per TFIIH) ed, a

questo punto, intervengono dei sensori specifici, CSA e CSB, che si legano al danno,

mandano via l’RNA polimerasi, perchè non è possibile continuare la trascrizione.

Successivamente le due vie s’incontrano nella via di riparo. Il riparo è effettuato alla stessa maniera.

Il riparo richiede l’intervento di varie proteine e si verificano i seguenti eventi:

- viene aperto il DNA che contiene il danno dall’elicasi (si forma una bolla di

riparazione);

- delle endonucleasi tagliano la singola elica che contiene il danno in maniera

simmetrica (viene tagliato un frammento di 24-32 basi a monte e a valle) che viene

così eliminato;

- le DNA polimerasi δ e ε riparano la lacuna che si è formata ricopiando la singola

elica normale;

- la DNA ligasi salda il tutto.

3. RIPARO MEDIANTE SINTESI DI TRANSLEZIONE

Stallo della replicazione, riparo

T T della lesione o collasso della

forca di replicazione.

Meccanismi di riparo che

rimuovono il danno, ma non

tutti i danni possono essere

rimossi.

TRANSLESION SYNTHESIS

replicazione nonostante la lesione

fatta da polimerasi a bassa fedeltà.

TT CC

AA AA X

TLS pol η TLS pol κ A

8-oxoG X = 8-oxoG o AP

C o A o G X

TLS Rev1 C

AP

G

E’ un sistema di riparo di emergenza, che interviene quando non è possibile utilizzare altre vie di

riparo. Ha lo scopo di non far bloccare la forca di replicazione e far andare avanti la replicazione

comunque, salvando la cellula dal blocco ed eventualmente dall’apoptosi ma introducendo

mutazioni.

Nell’immagine c’è una forca di replicazione ed un dimero di timina che non è stato replicato. A

livello del dimero di timina, sfuggito alla riparazione da parte del NER, la forca di replicazione si

blocca e sono possibili diverse evenienze con diverse conseguenze: nella migliore delle ipotesi il

collasso della forca di replicazione può innescare una serie di meccanismi di riparo basati sulla

ricombinazione omologa che rimuovono il danno. Però non tutti i danni possono essere riparati

221

(esiste sempre una certa percentuale di danno, specialmente se il danno è massiccio, che non è

riparato). Solo a questo punto interviene il meccanismo di recupero di sintesi di translezione:

consiste nella attivazione di particolari DNA polimerasi normalmente presenti allo stato inattivo.

Ci sono diverse DNA polimerasi che agiscono in questa modalità (e si chiamano sintesi di

translesione TLS polimerasi):

1. TLS pol η (eta): quando viene attivata in condizioni di emergenza, mette di fronte ai dimeri

di timina sempre delle sequenze AA. La mutazione viene riparata se il dimero iniziale era di

timina, ma se, ad esempio, era di citosina, si avrà una mutazione. La stessa polimerasi di

fronte ad una 8-oxoguanina può mettere una citosina, un’adenina o una guanina (in ordine di

frequenza) e non si avrà mutazione solo se mette la citosina. La stessa polimerasi di fronte a

un sito apurinico ci mette sempre una guanina e si ha mutazione;

2. TLS pol k: di fronte ad un qualsiasi danno (8-oxoguanina o sito apurinico) mette sempre

un’adenina;

3. TLS Rev1: di fronte all’8-oxoguanina o a un sito apurinico mette sempre una citosina.

Danni ai meccanismi di riparo sono molto gravi:

il danno di BER porta alla morte o a gravissime patologie per l’individuo.

il danno di NER spesso è causa dello xeroderma pigmentoso: produzione di numerosi tumori della

pelle. 222

EFFETTI FUNZIONALI DI UNA MUTAZIONE PER SOSTITUZIONE

Effetti di mutazioni puntiformi sulla regione codificante di una gene

o missense

Codoni di stop

UAA,UGA,UAG

Nella parte superiore dell’immagine è riportata una sequenza codificante per degli amminoacidi.

Poi vi sono le principali cassi di mutazioni già elencate. Nella parte inferiore è riportato il codice

genetico ovvero l’insieme dei 64 codoni con l’amminoacido che ciascun codone codifica (alcuni

aminoacidi sono sintetizzati da diversi codoni) e la frequenza x1000 dei singoli codoni: è

importante sapere che ciascun codone ha una ricorrenza differente e caratteristica.

Le mutazioni puntiformi, cioè che interessano una o più basi azotate di codoni di sequenze

codificanti (se interessassero sequenze non codificanti come nell’eterocromatina, contribuirebbero

al polimorfismo della stessa e non porterebbero a gravi conseguenze) sono:

• MUTAZIONI PER SOSTITUZIONE:

1. MUTAZIONI SINONIME e MUTAZIONE SENSO

Cambia la sequenza del codone ma questo continua a

GGC = glicina codificare per uno stesso aminoacido: succede questo perché

il codice genetico è degerato ovvero lo stesso aminoacido può

essere codificato da diversi codoni (il contrario non avviene

mai!)

Figura: sostituendo una citosina di un codone codificante la

GGA = glicina glicina, si ottiene un nuovo codone anch esso codificante la

glicina: il codone GGA prende il nome di codone sinonimo

proprio perché sintetizza lo stesso aminoacido del codone originario. 223

Si parla di siti degenerati e siti non degenerati quelle posizioni del codone che possono

generare o meno dei codoni sinonimi, infatti, sostituendo le basi di un codone non si

ottengono sempre dei codoni sinonimi. Normalmente sono degenerate le posizioni in terza

base (ad esempio: la prolina presenta quattro possibilità in terza base) e le posizioni in prima

base di alcuni codoni in particolari situazioni (ad esempio: l’arginina può avere in prima

base una timina o una citosina) mentre sostituzioni in posizione centrale, cioè di seconda

base, non sono mai degenerate e producono mutazioni non sinonime (o mutazioni

missenso), mutazioni in cui cambia non solo la sequenza del codone ma anche il suo

significato, ovvero l’aminoacido che esso specifica.

Queste mutazioni sono prodotte, quindi, se la sostituzione cade su un sito non degenerato e il

sito non degenerato per eccellenza è la seconda base (ma anche la prima e la terza possono

essere in alcuni codoni non degenerati)

2. MUTAZIONI NON-SENSO

La sostituzione causa la formazione di un codone di stop* pretermine causando della

perturbazioni nella trascrizione con gravi conseguenze.

3. MUTAZIONI READTHROUGH (“Leggere attraverso” il codone di stop)

Mutazione molto rara in cui il codone di stop per sostituzione diventa un codone leggibile

facendo continuare la traduzione sino ad un altro codone di stop.

Riassumendo: l’effetto di una sostituzione in un codone dipende dalla posizione in cui questa cade,

infatti, la sostituzione può cadere in un sito degenerato avendo, così, una mutazione sinonima o può

cadere in un sito non degenerato avendo, così, una mutazione missenso o può generare un codone di

stop prematuro o, raramente, un codone di stop può essere trasformato in un codone leggibile.

* I codoni di stop sono 3: UAA, UGA e UAG. Il codone di stop è tale perché non esiste un anti-codone, un tRNA che lo

riconosce e, non appena questo finisce nel sito amminoacidico del ribosoma non viene letto dal ribosoma, si attivano i

224

Fattori di Terminazione ERF1 e ERF2 che innescano una serie di reazioni che portano all’idrolisi della catena

.

polipeptidica con la sua liberazione

• MUTAZIONI PER INSERZIONE E DELEZIONE:

Si intende l’inserzione o delezione di uno o pochi nucleotidi. Quando si hanno inserzioni e

delezioni più grosse si parla di un altro tipo di mutazioni, come quelle prodotte dalle sequenze

ALU e LINE che inseriscono attraverso la trasposizione. Nell’immagine sono riportate le

sequenze e sotto di esse ci sono gli amminoacidi codificati dai rispettivi codoni.

Mutazioni per inserzione/delezione di nucleotidi

A

ATG CAG GTG ACC TCA GTG TTT AGC inserzione

Met Gln Val Thr Ser Val Phe Ser

ATG CAG GTG AAC CTC AGT GTT TAG C frameshift +1

Met Gln Val Asn Leu Ser Leu stop

ATG CAG GTG ACC TCA GTG TTT AGC delezione

ATG CAG GTG ACC CAG TGT TTA GC frameshift -1

Met Gln Val Thr Gln Cys Leu ..........

1. MUTAZIONI PER INSERZIONE o MUTAZIONI FRAMESHIFT +1

A

CAG GTC ACC TCA

CAG GTC AAC CTC

In figura: una adenina viene inserita in una posizione qualsiasi della sequenza codificante

(se si tratta di una sequenza non codificante non da’ problemi!!). Prima dell’inserzione tutto

è normale; dopo l’inserzione il Frame (Registro di Lettura) si sposta in avanti di una

225

posizione (non si legge più ACC ma AAC), portando in avanti di una posizione il

Frameshift (Modulo di Lettura) e causando la codifica di aminoacidi differenti dal punto

si inserzione sino a valle (linea tratteggiata), creando disordini enormi. Con un solo evento

di mutazione è stato modificato NON un solo codone (come avviene nell’inserzione dei

nucleotidi) ma tutti i codoni a valle del punto di inserzione.

Le mutazioni per inserzione danno mutazione frameshift +1, cioè mutazioni di spostamento

del modulo di lettura di una o più posizioni a seconda di quanti nucleotidi si siano inseriti (a

valle).

2. MUTAZIONI PER DELEZIONE o MUTAZIONI FRAMESHIFT -1

GTC ACC TCA GTG

GTC ACC CAG TGT

Si può avere la delezione di uno o pochi nucleotidi.

In figura: una timina viene deleta.

Prima della mutazione tutto è normale; dopo la mutazione il frameshift arretra di una

posizione (non si legge più TCA ma CAG)e causando la codifica di aminoacidi differenti