Lezioni, Genetica medica

GENETICA UMANA

I CROMOSOMI E LA CROMATINA

A B

C

D E

F G

Nel cariotipo umano i cromosomi sono ordinati dal più grande al più piccolo (ad eccezione del

cromosoma 21 che pur essendo più piccolo del 22 lo precede, poiché solo negli anni ’70 è stato

possibile scoprire l’errore). Inoltre essi, oltre ad essere numerati, sono anche divisi in gruppi indicati

con le lettere dell’alfabeto:

⇒ 1->3 GRUPPO A

⇒ 4-5 GRUPPO B

⇒ 6->12 GRUPPO C

⇒ 13->15 GRUPPO D

⇒ 16->18 GRUPPO E

⇒ 19-20 GRUPPO F

⇒ 21-22 GRUPPO G

Nel cariotipo i cromosomi sono bicromatidici e metafasici, quindi cromosomi in cui DNA ha già

replicato. L’evento che dimostra tale replicazione è il fatto che ogni cromosoma è bicromatidico,

cioè formato da due cromatidi identici. In tale tipo di preparato è possibile osservare anche la

costrizione primaria, cioè la strozzatura che si presenta in una determinata posizione sul

cromosoma. Tale strozzatura sta ad identificare la presenza su ciascun cromatidio di un centromero,

o cinetocore, sul quale si legano i microtubuli che tirano ciascun cromatidio ai poli opposti della

cellula durante l’anafase.

La posizione dei centromeri cambia a seconda dei cromosomi. Possiamo tre grosse categorie di

cromosomi sulla base dei centromero:

1. CROMOSOMI METACENTRICI: con i centromeri al centro in modo da distinguere due

bracci circa uguali (sono metacentrici i cromosomi 1,

3, e del gruppo F);

2. CROMOSOMI ACROCENTRICI: con i centromeri localizzati presso un’estremità del

cromosoma (come i cromosomi del gruppo D e G) che 1

definisce un braccio molto piccolo;

3. CROMOSOMI SUB-METACENTRICI: la costrizione del centromero definisce un

braccio corto ed un braccio lungo. Il braccio corto è

indicato con “p” (dal francese petit), il braccio lungo è

indicato con “q”;

4. CROMOSOMI TELOCENTRICI: cromosomi presenti unicamente negli insetti.

I cromosomi metafasici sono il risultato della compattazione del DNA durante il ciclo cellulare.

Ciascun cromosoma è costituito da un’unica molecola di DNA che, una volta replicata ed associata

a delle proteine specifiche, subisce nel corso della mitosi o della prima meiosi un grado di

compattamento notevole (vedi diapositiva sottostante). Nei cromosomi metafasici, una volta

replicati, i due cromatidi risultano essere tenuti assieme dalla coesina (un complesso multiproteico)

e questo spiega perchè i cromosomi prometafasici appaiono costituiti da un’unica unità (i due

cromatidi non sono ancora evidenti come nei preparati che si osservano andando più avanti nelle

fasi del ciclo cellulare). La coesina viene liberata di modo che i due cromatidi fratelli divengano

evidenti alla fine della prometafase anche se non tutta la coesina viene eliminata: rimane attorno ai

centromeri e nelle regioni pericentromeriche (quindi tali regioni restano l’ultimo punto in cui i

cromatidi fratelli sono tenuti assieme dalla coesina) . Poi, in anafase, in seguito a stimoli, anche

quest’ultima isola di coesina verrà liberata, ed i due cromatidi fratelli potranno segregare ai poli

opposti della cellula. (a) Ciclo “cromosomico” e ciclo cellulare. (b) Cromosomi in profase

e (c) cromosomi metafasici a basso ingrandimento (ME). (d)

Cromosomi in profase precoce e (e) cromosomi in tarda profase a

maggiore ingrandimento (ME). (f) Cromatidi all’anafase. 2

Struttura del cromosoma

La condensazione cromosomica vede l’organizzazione della cromatina (l’associazione di DNA e

proteine) in diversi ordini gerarchici.

• DNA NUDO: il cui spessore è di 2nm;

• ORGANIZZAZIONE NUCLEOSOMALE: questa è l’organizzazione fondamentale della

cromatina. I nucleosomi non sono solo un elemento di organizzazione strutturale, ma sono

anche un importante elemento di regolazione dell’espressione genica e di regolazione di

struttura della cromatina tant’è che le malattie genetiche sono ora distinte in “malattie

genetiche dovute a mutazione di un gene specifico” ed in “malattie genetiche dovute a

mutazione dell’epigenotipo” (cioè quelle mutazioni che fanno sì che alcune regioni siano

espresse ed altre non lo siano, in relazione ai vari stimoli che avvengono durante la vita

cellulare). La condensazione nucleosomale è importante non solo a livello strutturale ma

soprattutto a livello funzionale. Nell’organizzazione nucleosomale, 147 nucleotidi di DNA si

avvolgono in due giri attorno a ciascun nucleosoma (nucleosoma costituito da un ottamero

di due unità H1, H2A, H2B, H3 ed H4. Oltre alle subunità istoniche canoniche, vi sono altre

varianti istoniche che hanno un ruolo più regolativo che strutturale e che vengono attivate in

seguito a determinati stimoli cellulari). La fibra cromatinica, organizzata come fibra

nucleosomale, ha uno spessore di 11nm e continua ad impacchettarsi a sua volta,

generalmente con una organizzazione a zig-zag, nella fibra cromatinica base;

• FIBRA CROMATINICA BASE: ha lo spessore di 30nm. Rappresenta la struttura in cui si

ritrova il DNA nel nucleo interfasico. Tale fibra, grazie all’intervento di altre proteine, si

organizza in una serie di loop (anse grandi solitamente da 50 a 200 kilobasi; possono

raggiungere in alcune regioni cromosomiche grandezza nell’ordine delle megabasi) che

prendono rapporto con la loro base, lo scaffold (impalcatura). Tale struttura costituita da

3

anse ha uno spessore di 300nm e rappresenta l’elemento costitutivo del cromosoma. Le anse

costituiscono a seconda dei casi sia l’unità di replicazione sia l’unità di trascrizione. Questa

struttura, a sua volta, può subire ulteriori ripiegamenti in una struttura che ha spessore di

700nm che è il tipico spessore del DNA della cromatina organizzata nel cromosoma.

Organizzazione della fibra cromatinica fibra cromatinica

50-200Kb

ma anche nell’ordine

di Mb

DNA topoisomerasi II Condensina

La fibra cromatinica base prende contatto con lo scaffold grazie ad alcune sequenze caratteristiche

che si chiamano SAR (Regioni Associate allo Scaffold), e sono delle sequenze di DNA

particolarmente ricche di actina. Lo scaffold è costituito da diverse componenti proteiche, le due più

importanti sono:

DNA-TOPOISOMERASI II (le topoisomerasi sono una classe di enzimi deputati

- alla decatenazione del DNA, cioè sbrogliano il DNA, come ad esempio la

topoisomerasi I, che agisce rompendo una singola elica del DNA o la topoisomerasi

II che rompe il DNA a doppia elica e sbroglia i superavvolgimenti);

CONDENSINA (che ha un ruolo nella condensazione del cromosoma).

-

Nel nucleo interfasico (diverso dal nucleo metafasico), lo scaffold prende il nome di matrice

nucleare e le sequenze che gli si associano si chiamano MAR (Regioni che si Associano alla

Matrice nucleare). In altri termini, la matrice nucleare è costituita da proteine che poi si

organizzeranno a formare lo scaffold dei cromosomi metafasici, ma che nel nucleo interfasico

garantiscono questa particolare struttura alla cromatina.

La relazione tra gli istoni ed il DNA non è statica ma è estremamente dinamica, nel senso che in

diverse fasi del ciclo cellulare ed in risposta ai diversi stimoli, il rapporto tra DNA e nucleosomi

varia e tale cambiamento è realizzato da un gruppo di complessi multiproteici che si chiamano

Complessi del Rimodellamento della Cromatina ATP-Dipendenti (ATP-dipendenti perché le

modificazioni del rapporto tra DNA e nucleosomi richiedono energia). 4

ATP-dependent chromatin remodelling complex

complessi costituiti da molte subunità proteiche che modificano la topologia dei nucleosomi con

modalità ATP dipendente, alterando le interazione DNA-istoni e consentendo così l’accesso dei fattori

di trascrizione, di replicazione e di riparo al DNA esposizione transitoria di

sequenze bersaglio

riconfigurazione con slittamento e riconfigurazione con

riposizionamento dei nucleosomi ricompattamento dei nucleosomi

Tali complessi multiproteici alterano la topologia dei nucleosomi con il DNA rendendo accessibili

alcune sequenze che prima non lo erano (a causa della compattazione del filamento di DNA) ad

attività come trascrizione, replicazione, riparazione del DNA e, una volta terminata l’attività si ha lo

slittamento ed il riposizionamento dei nucleosomi). Nella diapositiva è evidenziata una regione del

DNA bloccata attorno al nucleosoma. Se tale regione necessita dell’interazione con fattori di

trascrizione o altre proteine è necessario esporla. Intervengono così i complessi del rimodellamento

della cromatina facendo sì, ad esempio, che quella sequenza venga srotolata provvisoriamente e

quindi possa funzionare come sequenza bersaglio. Oppure questi stessi complessi fanno sì che la

sequenza da essere avvolta venga ad essere rilassata e passi nello spazio internucleosomale, ed

anche in questo caso la sequenza viene ad essere esposta (riconfigurazione con slittamento e

riposizionamento dei nucleosomi). Se, invece, la struttura deve essere ulteriormente ricompattata, i

complessi di rimodellamento della cromatina modificano l’avvolgimento del DNA attorno ai

nucleosomi in modo da ricompattare e ridurre la distanza dei nucleosomi (riconfigurazione con

ricompattamento dei nucleosomi). Molte malattie umane derivano da mutazione dei complessi di

rimodellamento, che avvenendo in un punto del genoma rendono impossibile l’espressione o la

replicazione di uno o più geni. Agiscono attraverso riarrangiamento non covalente dei nucleosomi.

Agiscono sulla cromatina in tre meccanismi principali:

1. scivolamento dell’ottamero prot. lungo il DNA

2. trasferimento in una altra zona

3. rimodellamento del nucleosoma 5

Modificazioni dell’organizzazione della cromatina

Questa diapositiva mostra come il rapporto tra nucleosomi e DNA nella fibra cromatinica sia

dinamico e come diversi complessi di rimodellamento, in associazione con altre proteine

modificano in maniera continua la relazione tra nucleosomi e DNA. 6

Diverse organizzazioni della cromatina:

- eterocromatina

- eucromatina

L’organizzazione della cromatina può modificarsi in specifici distretti del

genoma in risposta a stimoli cellulari e/o programmi differenziativi in

modo da attivare specifici patterns d’espressione genica.

Tali modificazioni devono essere trasmissibili alle cellule figlie : memoria

epigenetica

Meccanismi che modificano l’organizzazione della cromatina:

- ATP-dependent chromatin remodelling factors

modificazioni covalenti post-traduzionali delle code degli istoni

metilazione del DNA

Osservando il DNA del nucleo interfasico si possono distinguere 2 tipi di organizzazione

cromatinica, che si basano sui differenti gradi di compattazione e sul grado di affinità per

determinati coloranti:

• ETEROCROMATINA: è quel tipo di organizzazione cromatinica particolarmente

compatta che non è soggetta a trascrizione e che, nell’uomo, contiene geni inespressi. Ha la

struttura della fibra a 30nm ma può subire un ulteriore grado di compattazione ed

organizzarsi in una superstruttura diventando, così, impermeabile ad una serie di fattori

chiave di trascrizione;

• EUCROMATINA: è quella porzione di DNA con organizzazione cromatinica più rilassata

(diametro 10-30nm) e rappresenta la parte codificante del genoma, che contiene i geni che

saranno espressi. Non tutta l’eucromatina viene espressa e ciò dipende dal programma

differenziativo che la cellula subisce, per cui l’organizzazione dell’eucromatina dipende da

una serie di modificazioni in cui alcune regioni della stessa si trovano in uno “stato acceso”,

altre in uno “spento” dal punto di vista della trascrizione (esempio: i geni che sono trascritti

in una cellula muscolare sono diversi dai geni trascritti in una cellula nervosa).

L’eucromatina deve essere organizzata in modo tale da supportare un programma di

espressione differenziale, che prende il nome di Programmazione Epigenetica: tale

programmazione dipende dall’informazione del DNA e non si realizza direttamente

attraverso l’attivazione di determinati geni quanto piuttosto da un’organizzazione a livello

dei geni della cromatina, attraverso la loro modificazione. L’epigenotipo è un livello di

organizzazione superiore di DNA in cui intere regioni del genoma vengono organizzate in

modo da essere represse od espresse a seconda del tipo cellulare. La caratteristica delle

modificazioni epigenetiche è tale che può essere trasmessa alle cellule figlie ed alle

generazioni successive (le modificazioni epigenetiche hanno una memoria epigenetica,

potendo essere trasmesse). Una cellula differenziata, che può dividersi (e che quindi ha un

programma epigenetico preciso), trasmette alle cellule figlie tale programma epigenetico in

modo che esse facciano lo stesso lavoro delle cellule madri; quando viene alterato questo

meccanismo (se le cellule figlie si de-differenziano) si è innescato un processo tumorale.

MODIFICAZIONI EPIGENETICHE DELLA CROMATINA

Le modificazioni epigenetiche della cromatina si realizzano attraverso la cooperazione di 3 grossi

elementi:

1. Fattori di Rimodellamento della Cromatina ATP dipendenti 7

2. Modificazioni Covalenti Post-Traduzionali delle Code N-terminale degli Istoni: gli

istoni sono costituiti da un dominio testa e da un dominio coda amino-terminale che può

subire delle modificazioni chimiche covalenti. Tali modificazioni rappresentano una specie

di codice, per cui marcando una porzione di cromatina in senso funzionale, attivano o

inattivano la stessa. Tali modificazioni covalenti delle code degli istoni avvengono dopo la

traduzione del DNA attraverso un complesso di enzimi;

3. Metilazione del DNA.

A acetilazione Lys (K)



M metilazione Lys (K), Arg (R)



P fosforilazione Ser (S)



2. Modificazioni Covalenti Post-Traduzionali delle Code degli Istoni

In questa diapositiva sono riportati i 4 istoni che rappresentano il core.

Il core dell’istone è costituito da 2 molecole rispettivamente di H2A, H2B, H3 ed H4. L’istone H1

funziona come linker tra diversi nucleosomi. Gli istoni hanno anche altre isoforme dal ruolo tuttavia

estremamente preciso

esempio: esiste una isoforma dell’istone H3 che si chiama H3.3 capace di marcare quei geni

trascrizionalmente attivi. Un’altra isoforma è quella dell’istone H2A, la H2A-linked, ancorata a

quelle regioni di DNA che hanno subito danni: quando ciò avviene, il sistema di rimodellamento

della cromatina sostituisce nella posizione del danno l’istone H2A con H2A-linked e, quindi, marca

quella regione come una regione che ha subito un danno e necessita di un riparo e che vengono

posizionate non durante la replicazione del DNA (cosa che avviene con gli istoni canonici) ma

indipendentemente dalla replicazione del DNA.

Ciascun istone ha una testa e delle code. La maggior parte delle modificazioni epigenetiche

post-traduzionali avvengono a livello delle code istoniche che fuoriescono dal centro del

nucleosoma ed, in particolare, su amminoacidi specifici di ciascuna coda istonica e sono mediate da

sistemi enzimatici specifici. Le modificazioni possono coesistere sulla stessa coda, ma in particolari

condizioni. 8

Le principali modificazioni sono:

- ACETILAZIONE (indicata con “A”): viene effettuata a carico di specifiche LISINE (K)

della coda istonica. Tutti e 4 gli istoni canonici possono

subire acetilazione. È un’attivazione trascrizionale

- METILAZIONE (indicata con “Me”): può interessare le LISIN ed anche le ARGININE(R).

La metilazione interessa solo gli istoni H3 ed H4.

- FOSFORILAZIONE: avviene a carico delle SERINE.

La fosforilazione interessa tutti e 4 gli istoni.

- UBIQUITINAZIONE: aggiunta della piccola proteina UBIQUITINA soprattutto a livello

della testa degli istoni.

- SUMOILAZIONE: aggiunta della piccola proteina SUMO in particolari posizioni

alcuni istoni.

Ciascuna di queste modificazioni avviene a carico di uno specifico residuo amminoacidico del core

e che è mediato da uno specifico sistema enzimatico.

HAT

Acetilazione attivazione trascrizionale



HDAC

Deacetilazione repressione trascrizionale

 attivazione: K4H3 K36H3 K79H3

HMT

Metilazione  repressione: K9H3 K27H3 K20H4

L’acetilazione



È mediata dal complesso degli enzimi detti HAT (Istone-Acetil-Transferasi). L’acetilazione degli

istoni è una modificazione trascrizionale correlata alla trascrizione. Laddove c’è attivazione

trascrizionale si trova la cromatina marcata dall’acetilazione di specifici residui aminoacidici delle

code istoniche. L’acetilazione è un processo che viene facilmente eliminato grazie ad enzimi che

sono le DeAcetilasi degli Istoni (HDAC), che hanno il compito di deacetilare gli istoni ovvero di

reprimere la trascrizione. La regolazione della cromatina tramite acetilazione e deacetilazione è una

modalità rapida e dinamica rispetto ai diversi stimoli;

La metilazione

 9

È realizzata grazie ad un ampio complesso di enzimi detti HMT (Metil-Transferasi degli Istoni). La

metilazione in alcuni casi è associata ad attivazione trascrizionale, in altri casi è connessa alla

repressione trascrizionale. Ciò dipende dalla posizione del residuo amminoacidico metilato.

Per esempio, sono collegate con l’attivazione trascrizionale:

- meK4H3 (metilazione della lisina 4 dell’istone H3, dove “K” sta per lisina) trimetilato;

- meK36H3 (metilazione della lisina 36 dell’istone H3);

- meK79H3 (metilazione della lisina 79 dell’istone H3).

Mentre sono correlate alla repressione trascrizionale:

- meK9H3 (metilazione della lisina 9 dell’istone H3);

- meK27H3 (metilazione della lisina 27 dell’istone H3);

- meK20H4 (metilazione della lisina 20 dell’istone H4).

N