Lezioni di immunoematologia prof.ssa Santini

Lezione 1

Emopoiesi

Il sangue è composto per il 40% da cellule (elementi corpuscolati) e per il 60% da plasma che contiene proteine che formano il mezzo in cui si trovano le cellule del sangue. Il rapporto tra parte corpuscolare e parte plasmatica è fondamentale per il buon funzionamento dell'organo sangue. Questa percentuale viene indicata come ematocrito: parte di sangue occupata principalmente dai GR in minima parte da piastrine e leucociti, è un volume espresso in percentuale.

L'ematocrito cambia nel tempo, ci sono patologie in cui viene modificato in maniera importante. Di norma quello degli uomini è superiore rispetto a quello delle donne, il neonato ha un ematocrito elevato (53-68%), bambino più grande si avvicina all'ematocrito della norma. La diminuzione della parte plasmatica o corpuscolare costituisce una patologia.

Il midollo osseo è un tessuto che si sviluppa all'interno delle ossa. Queste ultime sono composte da una matrice ossea con trabecole e ci sono due tipi di cellule: osteoblasti che formano il nuovo tessuto osseo e osteoclasti che rimaneggiano l'osso, quando questo equilibrio si altera si hanno patologie dell'osso, spesso legate a patologie emopoietiche.

All'interno dell'osso ci sono degli spazi vuoti riempiti di midollo osseo. Il midollo osseo contiene le cellule emopoietiche dalla c. staminale alla c. matura. È un tessuto potentemente vascolarizzato in modo da mettere le cellule in circolo. Ci sono anche cellule stromali, gli adipociti, i fibroblasti, i macrofagi tessutali, i mastociti, la matrice extracellulare che fa da supporto e da microambiente al midollo osseo.

Osteoblasti e osteoclasti producono citochine che interagiscono tra di loro e con le varie cellule grazie alla presenza sui progenitori di recettori specifiche (proteine di membrana che legano citochine trasduzione del segnale che porta all'attivazione di vie specifiche e poi daranno trascrizione genica e moduleranno la maturazione). Bastano piccole alterazioni in questo sistema per avere uno sbilanciamento delle cellule emopoietiche.

L'emopoiesi nell'adulto ha luogo nel midollo osseo, nel feto prima nel sacco vitellino e poi nel fegato e nella milza. Il midollo osseo si localizza in diverse zone: coste, vertebre, bacino, parte iniziale delle ossa lunga, teca cranica.

Gerarchia emopoietica

Negli anni '70 e '80, prendendo cellule da midollo di esseri umani o da topi, mettendole in incubazione, mettendole in colture in terreni liquidi e semisolidi, seminando in piastra le cellule emopoietiche all'inizio centrifugazione con gradiente di ficoll (mononucleate) perché si pensava che queste fossero le più primitive, al microscopio si vedevano degli agglomerati di cellule (cluster < 40 cellule), invece di cellule isolate. I diversi raggruppamenti contenevano diversi tipi di cellule eritroidi.

Questa cellula iniziale è stata definita come "colony forming unit eritroid" (unità formante colonie CFU) ed è una cellula in grado di dar luogo soltanto a cellule eritroidi. Quindi, sulla base del tipo di colonie, si sanno quali cellule progenitrici ci sono. Se si trovano solo colonie miste penso di aver seminato una cellula mieloide staminale, se si trovano sia granulociti neutrofili che monociti si è seminato un precursore CFUGM (colony forming unit granulocyte macrophage).

Quindi ci sono delle linee che hanno una potenzialità maggiore delle altre. Da questo concetto in vitro è nata la concezione gerarchica dell'emopoiesi in cui c'è una cellula staminale indifferenziata che ha due proprietà: si autorinnova e, proliferando, dà luogo a cellule un po' più mature. Le cellule staminali sono pochissime a livello del midollo osseo perché hanno funzione di riserva, ma nonostante tutto riescono a mantenere l'emopoiesi.

Le cellule staminali

Le cellule staminali non si vedono al microscopio come tali, si vedono cellule non differenziate; con lo studio dell'immunofenotipo (glicoproteine di superficie) si è riusciti a determinare il numero delle cellule staminali presente. Prima di questo, si faceva con le colonie: si mettono cellule a crescere nelle piastre, poi si contavano e si valutava la presenza di cellule staminali mieloidi. Si faceva in caso di trapianto per capire se il midollo che si andava a trapiantare funzionava o meno. Ora si valuta la presenza di cellule CD34 positive nel midollo, si valuta nel sangue periferico.

La cellula staminale pluripotente dà origine a tutte le linee cellulari, replicando se stessa, quindi mantenendo la riserva, dando origine a cellule più mature. Cellule più mature: cellula linfoide che formerà i linfociti T e B che si formeranno i primi nel timo e i secondi nei linfonodi; la linea mieloide ed eritroide invece vanno nel midollo e lì si commissionano dando origine alle cellule mature. Da qui in poi si può capire morfologicamente, guardando uno striscio sul vetrino, che tipo di cellula abbiamo (i progenitori primitivi non sono distinguibili al microscopio con l'aspetto morfologico).

Quindi le CFU sono cellule in grado di dare origine a una linea specifica. La GMCFU dà origine ai macrofagi ma anche al mieloblasto e al promielocita che dà origine al neutrofilo. I progenitori eosinofili arrivano fino all'eosinofilo maturo. Tutti hanno un progenitore in comune quindi alla fine tutte derivano dalle stesse cellule. Il megacariocito ha un progenitore molto piccolo, sono precursori delle piastrine, queste ultime non sono cellule ma lembi di citoplasma che si staccano dal megacariocito. La linea eritroide va fino al GR maturo, che espelle il nucleo durante la fase di maturazione.

Regolazione dell'emopoiesi

La maturazione e il commissionamento avvengono nel midollo emopoietico con le cellule di accompagnamento, con un microambiente particolare ed è condizionato dalla produzione di citochine e ormoni che interagiscono tra loro e portano alla maturazione diversa di una linea o dell'altra a seconda del fabbisogno. Le malattie neoplastiche del sangue possono avere origine a diversi livelli (più grave se avviene a livello della cellula staminale perché così tutto il midollo sarà malato). La cellula staminale può addirittura andare indietro e generare altri tessuti come il miocardio, ha una grande flessibilità.

A regolare tutto questo sono delle citochine prodotte dalle cellule monocitarie, da quelle della matrice, da quelle adipose, dai fibroblasti eccetera. Carenza di ossigeno -> eritropoietina -> GR. Infezione -> GMCSF (fattore stimolante granulociti e macrofagi) vengono stimolate le CFU -> produzione di monociti, macrofagi e neutrofili. Andando avanti nella gerarchia si perde la capacità di replicazione ma aumenta quella di differenziazione. Nell'ultimo step, la cellula somatica non è più capace di proliferare ma solo di funzionare.

La cellula staminale pluripotente ha delle citochine che ne stimolano la replicazione e in parte anche il commissionamento: SCF, IL-1, IL-6, IL-11 e due fattori di crescita G-CSF (fattore di stimolo dei granulociti) e la trombopoietina. In clinica si fa un pre-trattamento con G-CSF quando si vogliono raccogliere le cellule staminali per un trapianto, questo sblocca le cellule staminali e stimola la produzione di cellule dalle ossa.

Specializzazione delle citochine

Per quanto riguarda le cellule linfoidi e mieloidi il tipo di stimolazione è dato da citochine abbastanza diverse. Man mano che le cellule vanno verso la specializzazione si specializzano anche le citochine. Le colonie basofile sono molto responsive all'IL-3 e al SCF. Per quanto riguarda le cellule della linea rossa sono stimolate dall'IL-3 e dall'eritropoietina, più maturano e più hanno selettività (solo eritropoietina). Le CFU megacariocitarie hanno una stimolazione dovuta alla trombopoietina (TPO). Le GM sono stimolate da GMCSF da IL-3, da G-CSF, poi si specializzeranno e ognuno avrà la propria citochina specifica. Quindi man mano che si differenziano ci sarà anche una specializzazione delle citochine stimolanti.

Striscio di sangue

• Il sangue viene colorato con colorazione panottica di May-Grunwald e Giemsa.
• Preparazione: non prelevare dalla provetta ma utilizzando il sangue del malato, perché si possono avere artefatti aspecifici dovuti all'anticoagulante della provetta.
• Si mettono 40 microlitri a un lato del vetrino, poi si striscia con mano ferma e si va a vedere la morfologia delle cellule, il vetrino deve essere sufficientemente sottile.

Slide 9: GR normali con piastrine. Slide 10: granulocita neutrofilo normale. Aumentano in corso di infezioni batteriche. La segmentazione del nucleo ne dà l'età: quelli molto giovani hanno un nucleo quasi a ferro di cavallo (forme band?) hanno soltanto un nucleo con due lobature, più invecchia più si segmenta il nucleo e aumentano i lobuli (dura circa una settimana). Si può anche distinguere il sesso: le donne hanno un corpuscolo in più detto corpo di Barr.

Slide 11: eosinofilo normale. Hanno granulazioni più grandi rispetto ai neutrofili, hanno enzimi contenuti nei granuli completamente diversi, e un nucleo con due lobi soltanto. Slide 12: linfocita normale. Sono poco più grandi dei GR, hanno un nucleo con la cromatina ben addensata, praticamente non hanno citoplasma. Solo quando sono attivati hanno un po' più di citoplasma con dei granulini all'interno.

Slide 13: monocita normale. Aumentano in corso di infezioni virali oltre che batteriche. Hanno dimensioni più grandi, un nucleo contorto, non a lobuli, non hanno granuli e hanno un citoplasma evanescente. Slide 14: granulocita basofilo normale. Hanno molti granuli che coprono completamente il nucleo. Sono rarissimi normalmente (0-1%). Slide 15: GR che non hanno un sufficiente contenuto di emoglobina.

Emocromo

L'emocromo è il primo esame che mi dà un'idea della patologia emopoietica. Dà un sacco di informazioni. Deve essere verificato che sia attendibile. Quando ci sono valori inaspettati è importante, oltre a segnalarlo, ripetere l'esame. Ci sono degli intervalli di normalità che variano da persona a persona, con il sesso, con l'età, con il gruppo etnico (es. neutrofili). L'emoglobina serve a trasportare l'ossigeno ed è l'unico indice di anemia, definita come diminuzione dei livelli di emoglobina (il numero dei GR non c'entra). I livelli di Hb variano tra uomini (tra 14 e 17 g/dl) e donne (tra 12 e 15 g/dl).

Il numero dei GR è relativamente importante, ci sono delle possibili variazioni dovute al volume di GR. Quest'ultimo si indica come volume globulare medio e oscilla tra 80 e 95 femtolitri. Se i GR sono al di sotto del valore di riferimento si definiscono microciti se sono al di sopra si chiamano macrociti. Nell'emocromo si trovano anche l'emoglobina corpuscolare media e la concentrazione di emoglobina corpuscolare media che ci possono far capire se c'è un errore, un'alterazione o se c'è un'anemia di un tipo o di un altro.

I reticolociti sono dei GR giovani in cui ci sono ancora residui di organelli, variano, nell'emocromo sono scritti in percentuale ma noi dobbiamo ricavare il valore assoluto per poterli confrontare al numero dei GR per capire se il midollo ne sta producendo tanti e quindi sta lavorando tanto, importante nel valutare le anemie (ci sono delle anemie in cui i reticolociti sono diminuiti e altre in cui sono aumentati). Se sono pochi vuol dire che il midollo sta funzionando poco quindi anemia ipo-rigenerativa, se sono molto aumentati si tratta di anemia iper-rigenerativa (il midollo ha premura di compensare la causa dell'anemia producendo tanti GR).

Globuli bianchi i leucociti comprendono tutti i GB. I GB totali stanno tra 4000 e 10000 e sono divisi percentualmente in ogni tipo. I maggiormente rappresentati sono i neutrofili poi i linfociti, monociti, gli eosinofili e i basofili. Sono valori assoluti non percentuali, ed infatti bisogna misurarli in assoluto non in percentuale. Neutropenia < 2000 e neutrofilia >7500. Si parla di neutropenia, linfopenia e linfocitosi tutte e 3 possono essere sia assolute che relative.

Per quanto riguarda le piastrine l'intervallo va da 150000 a 400000 per microlitro. Le piastrine sono influenzabili da come è stato fatto il prelievo, da se e quanto è stata agitata la provetta, si possono verificare delle aggregazioni in provetta e allora possono sembrare meno rispetto a quello che sono realmente.

Aspirato del midollo

L'aspirato del midollo viene effettuato ogni volta che abbiamo un'incertezza diagnostica o un sospetto di una patologia neoplastica ematologica. Slide 17: le macchie più scure sono frustoli ovvero piccole quantità di tessuto midollare che contengono tutti i precursori. L'aspirato viene fatto con un ago che arriva al di sotto del periostio del bacino (cresta iliaca) si aspira il sangue midollare e si fa valutazione morfologica del midollo. Si procede facendo prima una visione a piccolo ingrandimento in cui si valuta la cellularità, quanti megacariociti ci sono (cellule grandi con buona visibilità anche a piccolo ingrandimento).

Se non vedo nulla significa che non c'è abbastanza cellularità. Dopodiché si guarda a grande ingrandimento la reale morfologia dei precursori. Nella slide 18 una plasmacellula con un grande citoplasma, un precursore della linea mieloide, della linea eritroide, un precursore monocitario e uno mieloide. Si valuta se i precursori sono presenti a tutti gli stadi maturativi, quanti ne ho e si fa un rapporto. Nel midollo prevalgono i precursori dei GB. Le cellule linfoidi sono molto rare nei midolli e aumentano con l'età.

Biopsia osteomidollare

La biopsia osteomidollare viene fatta facendo un carotaggio del tessuto di osso di 2-3 cm processato in anatomia patologica, fissato, colorato e dà informazioni diverse rispetto all'aspirato midollare. Questa viene vista dall'anatomo patologo (non dall'ematologo come l'aspirato) e dà informazioni riguardo l'architettura dell'osso, la distribuzione delle cellule emopoietiche all'interno dell'osso, quanto prevale il tessuto osseo su quello emopoietico, fa vedere anche la vascolarizzazione e dà notizie sulla presenza di fibre collagene.

Dà anche più notizie percentuale di quanti linfociti e plasmacellule ci sono. Quindi nelle malattie linfoproliferative ci dà più notizie. Nelle leucemie acute non si fa la biopsia, è sufficiente l'aspirato. La biopsia ci può far vedere anche se ci sono cellule non appartenenti al sistema ematopoietico come le cellule metastatiche. Si guardano tutti gli stadi dal mieloblasto al neutrofilo/basofilo/eosinofilo segmentato, c'è un mielogramma, una formula che deve essere mantenuta per considerare il midollo normale.

Bisogna vedere se le proporzioni tra i vari precursori sono mantenute e riconoscere i vari precursori. Slide 23: pro-mielociti sono elementi cellulari che non si replicano, hanno una grande quantità di granuli aspecifici, sono i precursori dei granulociti neutrofili. I granulociti vengono prodotti nel midollo, vengono divisi i loro precursori in due parti: pool proliferante o mitotico, ancora capace di proliferare, che tiene dentro mieloblasti, monoblasti, pro-mielociti e parzialmente monociti e poi il pool di deposito che sono ormai a maturazione terminale, sono granulociti e monociti, sono pronti per essere immessi in circolo per eventuali necessità dell'organismo.

I granulociti dal pool di deposito passano in circolo in due maniere: pool circolante sta nella corrente assiale dei vasi (corrono con la corrente sanguigna, sono quelli contati dall'emocromo), e neutrofili marginati, tenuti alle pareti dei vasi, che fluiscono lungo le pareti ad una velocità ridotta (non si possono contare), sono più di quelli in circolo. Se si fa il prelievo ad una persona ansiosa, l'organismo produce adrenalina, e si può avere una leucocitosi neutrofila, questo avviene perché il pool marginato in pochi minuti dalla produzione dell'adrenalina si mette in circolo.

Invece in caso di infezione il GMCSF manda dal midollo i neutrofili nel circolo, ma ci mette alcune ore. In caso di dolore e allergia e si fa una terapia con cortisone si può avere anche in questo caso un aumento dei granulociti neutrofili. I neutrofili normalmente aumentano nelle infezioni tuttavia in alcune persone che fanno cortisone possono aumentare in maniera significativa, è una cosa variabile da individuo a individuo. In un vetrino di sangue periferico la neutrofilia si nota perché in un campo invece di vederne 1 se ne vedono 5 o 6.

Leucocitosi: aumento di GB generico sopra i 10000. Ci possono essere dei casi in cui questo aumento non è reale (pseudo-leucocitosi), o in cui la leucocitosi c'è ma non è determinata da una malattia ma da una reazione fisiologica, o infine c'è una leucocitosi francamente patologica. Pseudo-leucocitosi: rarissima, capita che il numero dei GB sia alto ma poi si guarda il vetrino e non c'è niente.

Possibili cause: eritroblasti (precursori dei GR con il nucleo, lo strumento facendo un emocromo vede una cellula con il nucleo e la scambia per un linfocita), alterazioni tecniche (presenza microcoaguli, aggregati piastrinici), presenza crioglobuline (ormai con gli strumenti attuali non si verifica più questo problema).

Variazioni fisiologiche: più alti nel neonato e nel lattante, in chi pratica attività fisica molto strenua, stress, alterazioni emotive, gravidanza (>neutrofili), insolazione (>neutrofili), farmaci (es. cortisone). Possono variare con l'età: alla nascita sono molto aumentati i GB, dopo 24h scendono rapidamente e diminuiscono durante l'infanzia, verso il 10° anno hanno GB paragonabili agli adulti, con la vecchiaia si hanno meno GB. Vi sono anche fattori individuali.