Lezioni di immunoematologia prof.ssa Santini

ESEMPI

Leucemia Mieloide Acuta

Mutazioni FLT3: recettore sempre funzionante, proliferazione continua delle cellule. Si

osserva ripetizione da 3 a 400 nucleotidi nel dominio FLT3. Se amplifico trovo l’allele

mutato, la sua ripetizione, la seconda banda è variabile. Si può fare diagnosi con la sola

PCR.

Mutazioni NPM1: inserzione di 4 basi nell’esone 12. Nel sequenziatore vedo 2 picchi (invece

di 2 bande, perché faccio elettroforesi capillare).

E’ il caso di fare un pannello con i geni di interesse sono molti.

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Traslocazione (9,22): due geni separati si uniscono e formano proteina di fusione. Si

possono formare 3 tipi di trascritti.

Proteina Bcr/Abl: vantaggio proliferativo alle cellule che hanno l’alterazione. Target

therapy: molecola ha la proprietà di entrare nella tasca si unisce alla proteina Bcr/Abl e la

blocca.

Bisogna capire che trascritto ha il paziente PCR qualitativa una volta capito il tipo si

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quantifica con PCR quantitativa si guarda come questo trascritto varia nel tempo.

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LEZIONE 7 CITOFLUORIMETRO

Le prime strumentazioni risalgono agli anni ’70 macchine grandi e complesse di

raffreddamento ad acqua. Due parametri fisico e di fluorescenza. Si sono evoluti poi in

strumenti da banco con funzione di fare il ciclo cellulare.

Citometria

Evoluzione della microscopia a fluorescenza. Le applicazioni in campo diagnostico sono

evolute in maniera esponenziale.

Citometri a flusso costituita da un sistema fluidico per trasportare il campione, un sistema

di eccitazione (laser), circuito di rilevazione (detector), sistema elettronico.

Sistema fluidico: passaggio del campione in una cella a flusso. Aumentando la velocità del

flusso si può avere uno streaming più allungato. Consente al laser di misurare cellula su

cellula. Si possono misurare circa 10000 cellule, 12 colori in contemporanea. Bisogna

sapere dall’inizio che tipo di cellula devo studiare, a seconda di questa metto una pressione

diversa, devo evitare la sovrapposizione di cellule, una nasconde l’altra.

Sistema di eccitazione: costituita da lampade (spettro più ampio ma sono molto meno

precise) o laser (elevata potenza specifica, grande stabilità, limitata disponibilità di

frequenze). Il citometro è composto da 1 o più laser. Di solito viene impiegato un laser a ioni

di Argon.

Light scattering: scatter lineare attraversala cellula (cono d’ombra che lascia è la

dimensione della cellula), scatter a 90° (presenta di granuli nella cellula illaser devia, più

deviazioni fa più complessa è la cellula).

Fluorescenza.

La combinazione di questi 2 parametri costituirà il citogramma.

Basofili risultano pochi perché degranulano in soluzione fisiologica.

Si vedono tutte le tipologie di linfociti: cellule B le più piccole, linfociti T sono di medie

dimensioni, cellule NK sono grossi linfociti granulati.

Citofluorimetro è un classificatore di elementi. Di aiuto al morfologo per lo studio e la

localizzazione delle cellule. Ci sono molte molecole biologiche che fanno da fluorocromi:

FITC, PE ecc. Il fluorocromo assorbe l’energia e la rilascia emettendo fluorescenza. La

fluorescenza può essere influenzata da: Ph, presenza di specifici ioni, fase acquosa,

lipidica, concentrazione fluorocromi. Due fluorocromi vicini possono interferire l’uno con

l’altro. Bisogna conoscere il tempo di vitalità dei vari fluorocromi. Si possono usare fissativi

per mantenere il campione più a lungo. Esistono delle bande di eccitazione ed emissione.

Se le emissioni sono diverse si possono identificare diverse molecole. Le cellule non

marcate hanno una fluorescenza naturale, si usano per fare un bianco (un negativo). Ormai

le ditte producono prodotti già ottimizzate, segue queste linee guida: brillantezza=…?

Il numero di elementi (y) intensità fluorescenza (x molecole della sostanza collegate al

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fluorocromo). Strumento che utilizza 4 tipologie di marker (fluorocromi), alcuni hanno una

doppia sigla (fluorocromi tandem) quando non bastano i fluorocromi disponibili. A parità di

anticorpo alcuni fluorocromi sono più intensi di altri. Se il recettore nella cellula presenta

basse densità utilizzerò uno fluorocromo più brillante.

Fluorocromi tandem: 1 fluorocromo emette una lungh d’onda eccita un altro fluorocromo

che emette a una frequenza diversa sono costituiti da un donatore e un accettore. La

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lunghezza d’onda finale corrisponde a quella emessa dall’accettore e diversa da quella del

donatore (PE). IN questo modo si possono utilizzare contemporaneamente più colori.

Esistono molti coloranti, intercalanti per misurare il DNA. Intercalandosi al DNA ne

misurano il quantitativo, permeabilizza la cellula (la allarga).

Metodo per vedere se una cellula è morta o viva: si manda un segnale tossico, se la cellula

è viva lo sputa fuori, se è morta invece entra dentro e la colora di blu. Lo stesso fa il 7-AAD,

si fissa al DNA e dà indicazioni sulla vitalità della cellula. Cellule morte assumono dimensioni

inferiori (quindi si vedono molto piccole) e appaiono rosse, le cellule nere sono quelle vive.

Usando altre tipologie di coloranti che entrano nel citoplasma e si legano a strutture

proteiche (quando la cellula si divide, divide in 2 anche il colorante) si può misurare la

proliferazione della cellula (numero di divisioni cellulari).

Sistema ottico attraverso una fibra ottica il segnale passa ai fotomoltiplicatori. Grazie alla

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fibra ottica si riesce a far arrivare il segnale dove vogliamo noi senza perdite. Si possono

usare dei selettori. Il segnale può essere sporcato c’è bisogno di filtri. Malgrado queste

selezioni si ha sempre un sporco in un fluorocromo che entra in un altro. Anche se 2 lungh

d’onda sono lontane rimane sempre una piccola parte di uno che entra nell’altro, si può

agire elettronicamente spostando dei parametri che conosco riportando al loro giusto

posto le varie popolazioni pratica che si fa quando si utilizzano vari colori. Si utilizza con

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l’elettronica digitale off line in modo da aggiustare i parametri in un secondo momento e non

subito altrimenti rischio che mi finisca il campione. Si possono così correggere le

compensazioni. Quando vedo le figure a falce o in diagonale può voler dire che il campione

è scompensato, bisogna diffidare della positività del campione. Leggo i risultati

singolarmente poi si genera una matrice di compensazioni.

Sistema di rilevazione il segnale arriva dal fotomoltiplicatore e viene digitalizzato. I dati

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possono essere rappresentati con istogramma, dot plot, punto plot ecc.

Ogni cellula è un evento. Ogni punto dell’istogramma e misurato e si costruisce una curva.

Intensità di fluorescenza su numero di eventi.

Dot plot: specie di battaglia navale, bisogna valutare due punti per ogni cellula.

Punto plot: cono in cui la densità colorimetrica sta nell’evento più frequente che è il più alto.

Situazione ideale: ho una popolazione completamente positiva e una negativa. Più difficile

quando si ha bassa densità e sovrapposizione. Per avere sicurezza meglio utilizzare un

fluorocromo più potente in modo da staccare le due popolazioni.

Si può selezionare elettronicamente e vedere cosa corrisponde all’interno di un gate. Se

voglio selezionare la popolazione dei linfociti potrei usare un gate (immunologico) usando il

CD45 come parametro. In questo modo di può fare una formula linfocitaria per studiare

solo una delle popolazioni di leucociti.

Vengono utilizzati sistemi di controllo per vedere se c’è stato stabilità di flusso. Se c’è

incertezza di flusso potrebbe esserci stata perdita di segnale (interruzione o decadimento).

L’elettronica digitale permette di avere precisione (prima si misurava l’altezza però a parità

di altezza le tre figure sono diverse, è stata introdotto il parametro dell’area che è più

sensibile nel parametro di area posso vedere dei doppietti mentre nel parametro altezza

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si mescolano; parametro W mi rendo conto dei doppietti cellulari che io devo escludere

perché sono fusioni di cellule attaccate insieme, possono falsificare i risultati; cellula pelosa

con scattering alto, riesco a distinguerle), risoluzione, multiparametricità (fino a 16

parametri), compensazioni off-line ecc.

LEZIONE 8

I parametri che noi misuriamo sono parametri funzionali intrinseci senza sonde (cellule

con autofluorescenza naturale) o con sonde (utilizzando coloranti per vedere se cellule

sono vive o morte, contenuto DNA, immunofenotipo). Parametri funzionali estrinseci con

sonde (integrità di membrana, dosaggio citochine, fenomeni endocitosi e fagocitosi per

misurare capacità di fagocitosi di cellule, neutrofilo antibatterico perché i suoi granuli

contengono sostanze litiche si può studiare potenziale ossidativo di questi, stato di

attivazione cellulare ovvero si può vedere attraverso anticorpi monoclonali se la cellula è

attiva o in stato di quiescenza, stato di maturazione della cellula).

Immunofenotipizzazione: insieme di metodi che quantifica strutture cellulari mediante

reagenti immunologici (anticorpi monoclonali). Gli anticorpi colpiscono strutture cellulari

che possono essere molecole di adesioni, recettori di vario genere, citochine, enzimi,

antigeni nucleari. Furono scoperti nel 1975 da Kohler e Milstein. Anticorpi monoclonali si

identificano con sigla CD# (per ora sono 339). Tecniche di marcatura:

immunofluorescenza indiretta (un po’ in disuso): anticorpo primario contro antigene,

anticorpo secondario con fluorocromo attaccato; immunofluorescenza diretta più

redditizia: si riescono a vedere 2 o più anticorpi; permeabilizzazione: si usano detergenti

specifici per permeabilizzare le cellule.

Fare una buona analisi ci vuole una buona esperienza dell’operatore (operatore-

dipendente). Materiali idonei: liquidi (ottimali) leucaferesi (apparecchi che filtrano il

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sangue e concentrano i GB e le piastrine), sangue, liquor, liquidi cavitari e aspirati

midollari; solidi: bisogna macinare il tessuto e raccogliere singolarmente le cellule.

Corretta analisi: caratteristiche campione da analizzare (sangue periferico o midollare?

Midollare più grasso) ecc.

Quando si chiede l’immunofenotipo: eosinofilia (persistente può nascondere un linfoma),

componente monoclonale, pancitopenia (riduzione tutte componenti delle cellule

ematiche) ecc. Indicativo nelle leucemie acute di diversi tipi e nei disordini

linfoproliferativi cronici di diversi tipi. Non indicato nei linfomi di Hodgkin (diagnosi

istologica), neutrofilia reattiva ecc.

Il blasto è una cellula immatura ch