Appunti analisi e funzioni geniche da registrazioni

TET-OFF

Il più grande vantaggio dei sistemi TET-ON/TET-OFF è che sono reversibili dato che abbiamo

sostanzialmente solo una attivazione o non attivazione di trascrizione modulata dal legame di transattivatori

ad una sequenza specifica. e quindi possiamo sempre tornare alla condizione iniziale sia che aggiungiamo

o che sottraiamo tetraciclina.

Il topo knock out (KO) per un dato gene X non sempre ha un fenotipo perché esiste una grande

RIDONDANZA GENETICA cioè vi sono diversi geni o copie di geni aventi funzioni uguali o simili.

Quindi in tal caso bisogna fare topi doppi KO o anche tripli (dipende da quanti geni esprimono proteine

aventi la stessa funzione) e lo studio si complica dato che dovrò incrociare topi KO per geni diversi e quindi

usare diverse generazioni.

Rewev Bockamp et al.:

In questa rewev si riassumono le tecniche per fare KO genici in animali modello in particolar modo in topo,

vengono poi riassunti a punti le caratteristiche che il topo transgenico dovrebbe avere che sono :

 L'espressione transgene deve essere controllata dall'operatore in modo da poter fare delle buone

analisi

 se si overesprime e stiamo utilizzando un promotore inducibile , la molecola che induce

l'overespressione non deve essere tossica per l'organismo e deve essere molto specifico per

attivare solo il gene che voglio overesprimere come ad esempio la tetraciclina/doxicilina.

 la genetica di induzione deve essere abbastanza veloce e i livelli di espressione devono essere

adeguatamente alti, ed è preferibile una induzione reversibile

Le mutagenesi mirate nel topo possono quindi avere come risultato :

 KNOCK-OUT= ovvero inattivazione di un gene

 KNOCK-IN= inserendo porzioni geniche di interesse , che può essere un gene difettato che si vuole

studiare o una cassetta.

ANIMALI GENETICAMENTE MODIFICATI COME MODELLI DI MALATTIA PER

STUDIARE LA FUNZIONE GENICA

Nei diversi anni si sono prodotti tanti topi modelli di malattie umane , la maggior parte sono stati creati per

gene targeting di un gene specifico nelle cellule embrionali staminali. Grazie a questi modelli si possono

studiare nuove strategie farmacologiche che altrimenti non si potrebbero testare e studiare.

Le malattie umane più facili da ricreare in orgnismi modello come il topo sono quelle causate da difetti in un

solo gene. Le più difficili da ricreare sono quelle date da disordini cromosomici e malattie multifattoriali (con

+ geni)

A seconda del tipo di malattia che si vuole ricreare e da quale difetto genico la prova possiamo utilizza i

seguenti approcci di gene targeting :

 Alleli null , cioè causare la completa delezione del prodotto genico ottenendo topi omozigoti e se in

caso il gene fosse letale allora si fanno mutanti condizionali (spiegato sopra come si fa)

 alleli umanizzati

 KNOCK-IN di mutanti deboli , ovvero il prodotto genico è una proteina con una parziale attività

 alleli dominanti essendo dominante viene inserito a random nel genoma e quindi non si sfrutta il

gene targeting.

Perdita funzione: modello di topo per lo studio della FIBROSI CISTICA

Malattia genetica autosomica recessiva causata dalla mutazione del gene CFTR ,un regolatore

transmembrana, costituito da 27 esoni (è enorme in sostanza)

è una malattia mortale e si muore per infezioni polmonari e da insufficienza pancreatica.

ΔF508 ovvero la delezione di 3 nucleotidi

l'allele + frequente riscontrato in malati di fibrosi cistica è

nell'esone 10 che porta alla perdita di una fenilalanina.

sono stati prodotti modelli murinici che avessero fenotipi simili a quelli della malattia , dopo diversi tentativi

si vide che la completa delezione dell'esone 10 non portava fenotipo (l'esone in cui è frequente la

mutazione ricorrente nei malati di fibrosi cistica) e anche la delezione dell'esone 1 e 2 non portava fenotipo

desiderato. Reincrociando i topi aventi la delezione dell'esone 10 si ottennero i topi che sviluppavano

patologie polmonari. Quella linea di topi è così diventata il modello su cui si studiano terapie contro la

fibrosi cistica.

Acquisizione funzione: modello di topo per lo studio della MALATTIA DI HUNTINGTON

Malattia autosomica dominante , causata dall'espansione della tripletta CAG nell'esone 1 del gene HD

situato sul cromosoma 4. Se tale tripletta supera le 40 ripetizioni da luogo alla produzione di una proteina

che è tossica e che causa la malattia di Huntington.

Inizialmente si pensava che l'espansione CAG causasse una perdita di funzione e quindi si costruì un

doppio KO per ambedue gli alleli ma il topo che si formava era un letale embrionale , mentre i topi

eterozigoti erano normali. Da ciò dedussero che la perdita del 50% della proteina HD non causava la

malattia ma l'espansione della tripletta generava una acquisizione di funzione da parte di HD.

Il modello murino per la malattina di huntington fu creato sfruttando la strategia della microiniezione del

pronucleo maschile che consiste:

nell'ovocita fecondato per un certo periodo di tempo il nucleo maschile e femminile rimangono separati

quindi in vitro è possibile iniettare, con il transgene di interesse, il pronucleo maschile. Il DNA iniettato

andrà quindi ad inserirsi all'interno del nucleo in modo casuale e poi lo zigote si svilupperà normalmente.

La microiniezione della cassetta di interesse nell'ovocita fertilizzato nel pronucleo maschile è una tecnica

che si usa quando vogliamo ottenere una ricombinazione casuale della nostra casetta in una qualsiasi

parte del genoma e non importa che avvenga una inserzione in modo omozigote l'importante è che una

copia ricombini.

Per poter produrre un topo modello della malattia di huntington hanno creato delle cassette con diverse

versioni del gene umano HD ,aventi 150, 94 o 128 ripetizioni della tripletta CAG situato a monte di un

promotore che risponde alla doxicilina.

Aggiungendo quindi doxicilina si induceva l'attivazione nel promotore e l'espressione di HD e si è studiato

in quanto tempo si osservavano i sintomi della malattia.

Modelli murini di tumori umani

I tumori umani possono essere sviluppati da oncogeni o oncosopressori, quindi la perdita di attività di

oncosoppressori provoca l'insorgenza di tumori e l'attivazione di oncogeni provoca l'insorgenza di tumori.

Sono stati creati modelli murini , nel caso degli oncosppressori è una perdita di funzionalità quindi rientra

nella prima condizione affrontata prima (fibrosi cistica) quindi sono stati fatti modelli KO condizionali con

gene targheting.

Mentre per gli oncogeni ,che sono una acquisiszione di funzionalità , il modello murino è stato creato

inserendo in modo casuale l'oncogene che viene attivato o in modo inducibile o sovraespresso.

Topi umanizzati

I topi sono degli ottimi modelli ma non sono esseri umani quindi vi sono diversi problemi nello studio di

alcune malattie o nel creare modelli , di fatto a livello genetico non siamo esattamente uguali e quindi vi

sono diversi problemi ma non solo a livello genetico ma anche a livello metabolico o di longevità del topo.

I topi si possono umanizzare ovvero donargli caratteristiche del sistema umano per esempio :

i topi di per se sono resistenti all'infezione dei rinovirus (virus del raffreddore) perché il virus sfrutta un

recettore per entrare nelle cellule il recettore ICAM-1 che è molto diverso tra uomo e topo.

Quindi si sono prodotti topi aventi il recettore ICAM-1 più simile a quello umano e questi topi si ammalano

di raffreddore.

Topo modello per la SCLEROSI LATERALE AMIOTROFICA

Malattia neuro degenerativa incurabile che comporta la morte progressiva dei neuroni motori sia nel

cervello che nel midollo spinale. Il 10% di malati di SLA ha origine familiare ed il 20% di questi hanno

mutazioni dominanti nel gene SOD1, esso codifica per un enzima antiossidante , nei pazienti è stata isolata

la mutazione G93A nell'esone 4 , quindi si è creato un topo transgenico avente questo gene con tale

mutazione sotto il controllo del suo promotore. I topi sviluppavano sintomi simili alla SLA e studi in parallelo

hanno dimostrato che la mutazione G93A non altera l'attività enzimatica di SOD1 ma causa una proteina

tossica.

Con questo modello di topo si è inoltre osservato che l'uso di creatina promuove l'attività motoria e la

sopravvivenza. in oltre il modello di topo è stato utilizzato per studiare terapie geniche

Un tipo di terapia genica che si è studiata è quella di trasportare ai neuroni il fattore di crescita insulino-

simile IGF-1 sfruttando un adenovirus come vettore , il virus non si può moltiplicare ma contiene al suo

interno il gene per IGF-1 che si inserirà nei neuroni infettati. Con questa terapia si è riscontrato un'aumento

significativo della sopravvivenza dei topi modello per la SLA (si chiamano SOD G93A)

In questa slide vediamo come l’infezione con adenovirus IGF-1 di topi model SOD G93A prima dello

sviluppo dei sintomi della SLA rallenti lo sviluppo iniziale della malattia.

Mentre in questa slide vediamo come l’infezione con adenovirus IGF-1 nei topi modelli SOD G93A che

stanno sviluppando la malattia, rallenti il decorso della malattia stessa e migliori la forza muscolare.

20/10/2014

Aberrazioni e Aneuploidie cromosomiche

I cromosomi sono quelle strutture all’interno del nucleo che permettono la trasmissione fedele e

l’espressione corretta dell’informazione genetica essi sono costituiti da una molecola di DNA e da proteine

che si organizzano, assieme al DNA, in strutture che condensano il DNA stesso e in fine formano il

cromosoma ovvero un condensato di DNA.

I cromosomi in mitosi si condensano in strutture tipiche a bastoncello in preparazione alla divisione

nucleare e cellulare.

Nomenclatura dei cromosomi

Un cromosoma per è costituito da un centromero, la cui posizione può variare, la cui funzione è quella di

reclutare le proteine del cinetocore che hanno la funzione di mediatori nella mitosi/meiosi, per la

segregazione dei cromatidi fratelli nelle due cellule nascenti, essi si interfacciano con i microtuboli del fuso

mitotico. E in fine abbiamo i telomeri presenti alle estremità del cromosoma che hanno la funzione di

preservare il cromosoma stesso.

I cromosomi prendono il nome in base alla posizione del centromero, se situato esattamente al centro del

cromosoma allora avremo un cromosoma metacentrico, poi in base a quanto è distante dal centro

possiamo avere cromosomi submetacentrici arcocentrici o telocentrici.

Il centromero divide il cromosoma in due porzioni dette BRACCIA il braccio corto è detto P mentre il lungo

è detto Q.

L’assetto cromosomico è il numero di cromosomi diversi contenuti in una cellula ed è definito n ,

nell’uomo n=23. Il numero e la forma dei cromo