Appunti analisi e funzioni geniche da registrazioni

Analisi e funzioni Geniche

Prof Fraschini e prof Clerici 03/10/14

d’esame:

Modalità

7 appelli

scritto da 2 ore e mezza diviso in 2 parti 3 domande sulla parte della Fraschini e 3 domande sulla parte

della Clerici e successivamente ci sarà un orale di chiarimento.

Parte prof Fraschini

Protagonista del corso sono i geni.

Fondamentale: ogni filamento di DNA contenente un gene è costituito da un filamento detto FILAMENTO

SENSO(filamento senso) e da un FILAMENTO STAMPO(filamento antisenso)

L’RNA prodotto dalla trascrizione è complementare al filamento stampo ed equivalente al filamento

senso.

L’unità geneica è costituita da un promotore,un punto di inizo della trascrizione (ATG) ed un

terminatore.

Terminologia:

Prossimale= vicino *, o si intende al 5’

Distale= lontano *, o si intende al 3’

*se si parla del sito di inizio = all ATG

A monte= più vicino al 5’

A valle= più vicino al 3’

Per ogni sequenza di DNA data esiste un solo modulo di lettura aperto. Ovvero si legge di 3 basi in 3 basi

dal codone di inizio sino al codone stop , se abbiamo un frame shift il modulo di lettura cambia e si

genereranno diversi codoni stop precedenti a quello standard di quel gene. gene mentre l’RNA

La proteina con la sua sequenza amminoacidica definisce la regione codificante del

definisce la regione del Gene.

Negli organismi più semplici la trascrizione e la traduzione sono quasi contemporanei mentre in organismi

complessi vi sono diversi passaggi tra la trascrizione e la traduzione quindi la regolazione è

fondamentalemente più complessa in organismi superiori rispetto a microorganismi.

Infatti gli eucarioti possiedono nel DNA gli introni , sequenze non codificante , e durante la trascrizione

questi vengono trascriti e viene prodotto un pre RNA ovvero gli hnRNA successivamente questi subicono

che elimina dall’RNA gli introni producendo così il vero e prorpio mRNA.

un processo detto SPLICING

quindi il pre-mRNA identifica la regione del gene mentre la sequenza amminoacidica definisce la regione

codificante. Vi è un eccezione , questa eccezione cosiste in proteine prodotte da mRNA che durante la

maturazione hanno subito SPLICING ALTERNATIVO cioè gli esoni sono stati spostati o tolti in modo da

formare una specifica proteina diversa da quella che si sarebbe creata con un normale splicing.

All’aumentare della complessità dell’organismo aumenta la dimensione del genoma aumenteranno anche

le sequenze ripetute e le sequenze non codificanti

Il numero minimo di geni necessario ad un organismo per vivere sono 500

genoma umano è grande circa 30000 geni ed essi costituiscono solo l’1% del DNA umano.

il

All’aumentare la complessità dell’organismo aumentano i geni ma diminuiscono i geni essenziali perchè

aumenta la ridondanza funzionale ovvero + proteine svolgono quasi la stessa funzione in modo che se una

non funziona subentra l’altra senza far morire l’organismo.

Lo studio della funzione Genica

Lo studio dei geni comporta lo studio del Genoma , del Trascrittoma e del Proteoma, il Genoma è l’insieme

è l’insieme dei trascritti (mRNA) e in fine il Proteoma è l’insieme delle proteine

dei geni , il Trascrittoma

prodotte in un determinato momento.

La genomica la suddividiamo in :

GENOMICA STRUTTURALE= comprende la costruzione di dati di sequenze genomiche, scoperta di geni,

costruzione di mappe genetiche

GENOMICA FUNZIONALE= comprende lo studio della funzione di un determinato Gene e

conseguentemente del suo prodotto , e studia anche come viene regolato. all’interno dello stesso

GENOMICA COMPARATIVA= permette di confrontare sequenze di geni sia

genoma sia tra genomi di deversi tipo.

Lo studio della funzione genica deve essere svolto su tre livelli ovvero : a livello biochimico, a livello

cellulare e a livello dell’organismo. Oggi possiamo svoglere analisi genetiche globali che si avvalgono di

approcci bioinformatici e di studi di laboratorio.

Noi nel corso ci soffermeremo sugli studi di laboratorio e non sugli approcci bioinformatici.

Studi di laboratorio

Gli studi di laboratorio li suddividiamo in Genetica Classica o in Avanti e la Genetica Inversa

Genetica Classica

Nella genetica classica partendo da un organismo o una linea cellulare che esprime un certo fenotipo si

identifica il gene , che alterato , produce un prodotto genico alterato che comporta il fenotipo evidenziato.

Quindi muto il mio organismo o linea cellulare con mutazioni random per identificare poi il gene che mi

porta un fenotipo. Faccio inizialmente degli screening per isolare i mutanti di interesse.

Faccio poi un test di complementazione , ovvero verifico se la mutazione che ho isolato e che mi genera

un determinato fenotipo risiede sullo stesso gene.

esempio:

identifico 2 drosophile senza ali (fenotipo) , la drosophila è diploide quindi a priori so che quello che

osservo è un omozigote recessivo, so che ci sono 2 geni che regolano la presenza di ali o no e chiamo

Gene 1 e Gene 2, ipotizzo che due moscerini sono omozigoti recessivi per Gene 1 o Gene 2 , che la

mutazione è o in gene 1 o in gene 2 , solo quando Gene 1 e Gene 2 sono espressi allora abbiamo le ali.

incrocio i due moscerini e ottengo un eterozigote che ha un alle mutato del Gene 1 e uno no e un alle

mutato del Gene 2 e uno no , dato che è una mutazione recessiva ed essendo presenti geni dominanti la

c’è stata

progenie avrà le ali perchè complementazione.

Se invece ipotizzo che la mutazione è presente solo su Gene 1 e non su Gene 2 quando farò accoppiare le

due drosophile otterrò una progenie senza ali perchè essendo la mutazione presente solo su gene 1 sarà

per forza omozigote recessivo per Gene 1, quindi non è avvenuta complementazione

Il test ci permette di scremare mutanti sullo stesso gene e quindi con lo stesso fenotipo.

Se sto studiando un determinato patway faccio una dissezione di network biologici e tramite analisi di

epistasi ci permette di identificare se due geni agiscono sullo stesso patway . Le analisi di epistasi si

effettuano su organismi con fenotipo diverso e si produce il doppio mutante per andare ad analizzare il

fenotipo.

esempio :

Dopo queste analisi nella Genetica Classica , devo identificare la sequenza del gene mutato e lo si fa con

diverse tecniche. A questo punto conoscendo la sequenza posso risalire al tipo di prodotto proteico e

studiare biochimicamente come funziona la mutazione.

La Genetica Inversa

Nella genetica inversa , modifico un gene per ottenere un fenotipo diverso da quello WT ,questo approccio

fu sviluppato dopo aver sequenziato il genoma di diversi organismi.

Gli organismi modello : essi sono organismi che sono stati studiati affondo e vengono ancora utilizzati per

studiare aspetti biologici di base e vengono sfruttati per la ricerca di base. Saccharomyces cerevisea è

l’organismo modello degli eucarioti e l’escheriachia coli per i procarioti. Circa il 30% dei geni umani noti per

essere coinvolti in una malattia ha una funzione omologa nel lievito.

Limiti dell’utilizzo di colture cellulari: alcuni tipi cellulari non sono facili da mantenere in coltura e non si

possono dedurre le possibili interazioni tra diversi tipi cellulari in un organo o in un intero organismo. ecco

perché sono stati prodotti degli animali transgenici come i topi che vengono utilizzati com organismi

modello per lo studio più macroscopico delle funzioni geniche o alterazioni geniche.

ORGANISMI MODELLO:

effettuare tanti esperimenti ma l’unico test definitivo per determinare la funzione di un gene è lo

Si possono

studio in vivo di organismi mutati e del fenotipo che si sviluppa.

Nella Genetica inversa quindi dopo aver identificato il mio gene posso modificarlo come desidero e poi lo

inserisco in un organismo modello e studio in vivo il fenotipo che si sviluppa. 06/10/14

STUDIO FUNZIONE GENICA

Come si può inattivare un gene in lievito?

Il lievito gemmante è un eucariote e lo si può utilizzare sia in stato aploide che diploide quindi è ottimo per

studiare mutazioni geniche.

Un approccio per studiare un gene è quello di inattivare il suddetto gene e studiarne poi il fenotipo

(genetica inversa)

Per effettuare la delezione di un gene di interesse, posso sfruttare una sua caratteristica, ovvero posso

sfruttare il fatto che possono fare ricombinazione omologa con una alta efficenza. Quindi se introduco un

frammento di DNA lineare con delle estremità omologhe al gene di mio interesse all’interno del lievito

quello che succede è che avviene ricombinazione omologa con conseguente perdita del gene di interesse.

il frammento che vado ad introdurre e che deve fare ricombinazione omologa viene chiamato CASSETTA e

nel nostro caso , che sostituisce ed elimina un gene , prende il nome di CASSETTA DI DELEZIONE.

Queste cassette devono essere costruite prima ed appositamente e per farlo sfrutto la PCR.

Per costruire tale cassetta devo scegliere gli oligonucleotidi, i primers e il DNA stampato appositi, le

cassette sono specifiche non se ne può fare una universale. Dopo aver fatto la cassetta trasformo il lievito

con la mia cassetta, attendo che i miei trasformanti facciano ricombinazione omologa ed in fine analizzo i

trasformanti per vedere se hanno davvero integrato la mia cassetta e lo faccio con una PCR (amplifico la

cassetta e poi con eltrerroforesi vedo se è presente)

La cassetta di delezione deve avere sequenze in 5’ e 3’ omologhe a sequenze sul DNA nel punto dove

voglio che la sequenza vada a sostituirsi e in oltre la cassetta deve avere un marcatore in modo che io

possa identificare facilmente i trasformanti (esempio immunità ad antibiotico o cose così)

Tutto il genoma di lievito è stato mappato ed ogni orf è stata identificata ed gli è stato assegnato un nome

sistematico, per esempio per la ORF di TEM1 il nome è: YML064C dove

Y= yeast (lievito)

M= Cromosoma 13 (lettera alfabeto = n° cromosoma A = cromosoma 1)

L= left, indica in quale braccio è posizionato il gene, guardando il centromero e posizionando il braccio +

corto sulla sinistra.

064= sessantaquattresima ORF partendo dal centromero.

C= L’ORF è posizionata sull’elica Crick sull’elica in basso quella che è 3’-5’)

(sono

sequenza avente 45 nucleotidi posizionati a monte dell’ATG e deve

Per fare i primer devo scegliere una

essere uguale alla sequenza codificante , e una sequenza di 45 nucleotidi posizionati a valle della

sequenza stop ma deve essere uguale alla sequenza stampo (complementare alla sequenza

scrivo i primer devo sempre scriverli 5’ 3’ e per quanto riguarda il primer a valle leggo

codificante).(quando

a partire dal codone stop per 45 bp e scrivo il complementare a partire dalla 45esima base sino al codone

stop , in pratica il codone stop sta in 3’)

Avendo quindi i primer posso amplificare la mia cassetta (che generalmente è situata in un plasmide) e

quindi avvio la PCR avendo cura di aver adeguati polimerasi, desossinucleotidi e ovviamente i primer che

ho creato. è importante che il gene all’interno della mia cassetta venga costituitivamente espresso

altrimenti non potrò screenare i trasformanti. Dopo aver fatto al PCR faccio un controllo qualità facendo una

corsa elettroforetica con una frazione per determinare PM e lunghezza dei DNA prodotti.

fine trasformo i mo e identifico i trasformanti grazie all’integrazione della cassetta e all’espressione del

In

gene reporter.

Però la mia cassetta si può essere integrata in posizioni diverse da quelle da me desiderate quindi per

controllare se si è posizionata nel posto giusto faccio una PCR

La PCR di controllo si avvale di 4 primer , nel caso visto in classe abbiamo 2 primer esterni al gene kan

(gene reporter inserito all’interno della cassetta vista come esempio in classe) chiamati U (quello a monte

e D (quello a valle del codone stop) e 2 primer interni al gene kan chiamati K1 e K2.

dell’ATG)

Il primer U è di 18 nucleotidi posizionati a monte del primer che avevamo scelto per fare la PCR della

cassetta e sarà uguale alla sequenza codificante , D è uguale alla sequenza stampo ed è situato a valle dei

primer scelti. (U e D devono necessariamente essere fuori dalla cassetta perchè altrimenti avremmo

sempre un riscontro positivo durante la PCR di controllo )

K1 e K2 sono 2 primer commerciali interni alla sequenza kan

se la cassetta si è integrata nel locus di interesse k1 può allungarsi sino al complementare di U e formare

un amplificato di DNA a doppio filamento, stessa cosa con il primer D che può allungarsi sino al

complementare di k2 producendo un amplificato di DNA a doppio filemnto e in fine avremo un DNA

amplificato partendo dal primer D che giunge sino al primer U ottenendo in totale 3 amplificati

se la cassatta non si integra nel locus di interesse , noi screeneremo il mo come positivo ma andando ad

analizzare la PCR non otterremo alcun amplificato dato che i primer U e D non si appaiano.

Il DNA stampo di questa PCR di controllo è ovviamente il genoma dell’organismo trasformato.

Dopo aver fatto la PCR faccio una corsa elettroforetica e mi aspetto in un trasformante DIPOLOIDE 4

bande , 3 sono quelle delle amplificazioni e una sarà l’amplificazione U e D del gene WILD TYPE che ha

peso 900 bp.

Fatto ciò posso passare alla induzione della formazione delle tetradi in modo da studiare in APLOIDE tale

manipolazione genica con la cassetta di delezione. Isolo le spore seminandole con replica plating su un

terreno avente l’antibiotico dove il WT muore mentre il trasformante no.Posso avere il caso dove 2 spore su

4 crescono (me lo aspetto non ho distrutto geni essenziali) , il caso dove non crescono spore(ho distrutto

gene essenziale ) ,e le spore dove alcune formano colonia e altre no ( può essere avvenuto un evento che

ha mutato il gene di lievito, quindi questo risultato non è direttamente associato alla mia cassetta)

Approccio alternativo allo studio della funzione genetica per delezione

Utilizzo un promotore replimibile per la promozione dell’espressione del gene di mio interesse in modo tale

che io possa modulare l’espressione del prodotto del gene di mio interesse e studiarne la funzione. Per

modulare l’espressione aggiungo al terreno di crescita il repressore che reprime il mio promotore.

Il degrone

Sistema per studiare mutanti termosensibili, fu sviluppato in lievito ma può essere usato su tutti gli

organismi.

Si crea artificialmente una proteina termosensibili che viene degradata a 37°C ma tale proteina non viene

prodotta per mutagenesi, ma mediatente la creazione di una proteina di fusione tra la proteina di interesse

e l’ubiquitina.

e sostanzialmente 2 altre porzioni il DHFR(mouse dihydrofolate reductase)

A monte della proteina che vogliamo degradare fusa in frame abbiamo il DHFR , un residuo destabilizzante

(arginina) e l’ubiquitina. Una volta prodotta questa proteina le proteine deubiquinanti tolgono l’ubiquitina in

modo molto preciso esponendo il residuo destabilizzante( l’arginina). Questo di per se non denatura la

proteina ma a 37°C la DHFR cambia conformazione ed espone molte lisine e questo genera una massiccia

ubiquitinazione che porta la conseguente degradazione della proteina.

Plasmide ad integrazione per studiare degradazione termica

Utilizzo un plasmide ad integrazione(si integra nel genoma con un crossing over) contenente il gene della

molecola che vuoglio studiare in degradazione termica, in questo plasmide ho diversi livelli di controllo

come ad esempio P CUP1: promotore indotto dalla presenza di rame, utile perchè risponde a diverse

concentrazioni di rame; si può anche

usare il promotore endogeno ed in oltre ho geni reporter come URA e amp .

Quindi con un solo evento di crossing over l’intero plasmide sarà integrato nel genoma. Dato che il locus di

inserzione è il gene stesso che voglio studiare avrò una porzione troncata del gene e una porzione

completa dove però in frame ho il DHFR e quindi potrò studiare la degradazionetermica. è molto utile la

presenza dei primer A1 ed A2 dato che A1 è situato nella porzione genica che codifica DHFR ed A2 è

posizionato a valle del gene di interesse , quindi quando vado a fare il controllo con la PCR otterrò un

frammento amplificato solo se è integrato il plasmide . 13/10/14

I geni reporter

I geni reporter sono diversi e di diversi tipi, un esempio è il gene LacZ, la cosa importante da ricordare

quando si utilizza un gene reporter è che deve essere un gene eterologo, in modo che non vi siano altre

copie del gene nel genoma, e che sia facilmente usabile e visualizzabile ( un gene il cui prodotto genera ,

anche indirettamente , colore )

LacZ

LacZ è un gene che codifica per una β galattosidasi, che scinde il lattosio ma a livello empirico viene

l’X-gal che viene scisso dalla β galattosidasi in glucosio e un

utilizzato una molecola simile al lattosio che è

composto di colore blu, quindi sfruttando ciò LacZ diviene un gene reporter perchè vediamo

immediatamente se il suo prodotto genico è presente o no. In oltre la presenza del colore blu è

proporzionale all’espressione genica e può essere misurata la quantità con lo

direttamente

spettrofotometro.

LacZ può essre utilizzato in diverse maniere , ad esempio può essere messo sotto il controllo del

promotore per il nostro gene di interesse in modo tale che quando il mio gene di intersse viene espresso

allora anche il gene LacZ ottenendo così un rapporto diretto tra la quantità dei blu e la concentrazione del

prodotto espresso dal mio gene di interesse, ed in oltre potremmo anche indentificare in quale parte del

ciclo cellulare avviene l’espressione del mio gene.Dovendo sempre trasformare il mio organismo è

necessario che sia presente anche un marcatore.

Gene tagging

Il gene tagging consiste