Appunti analisi e funzioni geniche (aggiornato)

Analisi e funzioni geniche

Modalità d'esame

Prof. Fraschini e Prof. Clerici, 03/10/14

L'esame consiste in 7 appelli scritti da 2 ore e mezza, diviso in 2 parti: 3 domande sulla parte della Fraschini e 3 domande sulla parte della Clerici. Successivamente, ci sarà un orale di chiarimento.

Parte prof. Fraschini

Protagonista del corso sono i geni. Fondamentale: ogni filamento di DNA contenente un gene è costituito da un filamento detto FILAMENTO SENSO (filamento senso) e da un FILAMENTO STAMPO (filamento antisenso). L'RNA prodotto dalla trascrizione è complementare al filamento stampo ed equivalente al filamento senso. L'unità genica è costituita da un promotore, un punto di inizio della trascrizione (ATG) e un terminatore.

Terminologia

• Prossimale: vicino al 5’
• Distale: lontano al 3’
• A monte: più vicino al 5’
• A valle: più vicino al 3’

Per ogni sequenza di DNA data esiste un solo modulo di lettura aperto. Ovvero si legge di 3 basi in 3 basi dal codone di inizio sino al codone stop. Se abbiamo un frame shift, il modulo di lettura cambia e si genereranno diversi codoni stop precedenti a quello standard di quel gene.

La proteina con la sua sequenza amminoacidica definisce la regione codificante del gene. Negli organismi più semplici la trascrizione e la traduzione sono quasi contemporanei, mentre in organismi complessi vi sono diversi passaggi tra la trascrizione e la traduzione, quindi la regolazione è fondamentalmente più complessa in organismi superiori rispetto a microorganismi.

Infatti, gli eucarioti possiedono nel DNA gli introni, sequenze non codificanti, e durante la trascrizione questi vengono trascritti e viene prodotto un pre-RNA, ovvero gli hnRNA. Successivamente questi subiscono un processo detto splicing che elimina dall'RNA gli introni, producendo così il vero e proprio mRNA. Quindi il pre-mRNA identifica la regione del gene mentre la sequenza amminoacidica definisce la regione codificante.

Vi è un'eccezione: questa eccezione consiste in proteine prodotte da mRNA che durante la maturazione hanno subito splicing alternativo, cioè gli esoni sono stati spostati o tolti in modo da formare una specifica proteina diversa da quella che si sarebbe creata con un normale splicing. All’aumentare della complessità dell’organismo aumenta la dimensione del genoma, aumenteranno anche le sequenze ripetute e le sequenze non codificanti.

Il numero minimo di geni necessario ad un organismo per vivere è 500. Il genoma umano è grande circa 30,000 geni ed essi costituiscono solo l’1% del DNA umano. All’aumentare della complessità dell’organismo aumentano i geni ma diminuiscono i geni essenziali perché aumenta la ridondanza funzionale, ovvero più proteine svolgono quasi la stessa funzione in modo che se una non funziona subentra l’altra senza far morire l’organismo.

Lo studio della funzione genica

Lo studio dei geni comporta lo studio del genoma, del trascrittoma e del proteoma. Il genoma è l’insieme dei geni, il trascrittoma è l’insieme dei trascritti (mRNA), e infine il proteoma è l’insieme delle proteine prodotte in un determinato momento.

La genomica

• Genomica strutturale: comprende la costruzione di dati di sequenze genomiche, scoperta di geni, costruzione di mappe genetiche.
• Genomica funzionale: comprende lo studio della funzione di un determinato gene e conseguentemente del suo prodotto, e studia anche come viene regolato.
• Genomica comparativa: permette di confrontare sequenze di geni sia all’interno dello stesso genoma sia tra genomi di diversi tipi.

Lo studio della funzione genica deve essere svolto su tre livelli: a livello biochimico, a livello cellulare e a livello dell'organismo. Oggi possiamo svolgere analisi genetiche globali che si avvalgono di approcci bioinformatici e di studi di laboratorio. Noi nel corso ci soffermeremo sugli studi di laboratorio e non sugli approcci bioinformatici.

Studi di laboratorio

Gli studi di laboratorio li suddividiamo in genetica classica o in Avanti e la genetica inversa.

Genetica classica

Nella genetica classica, partendo da un organismo o una linea cellulare che esprime un certo fenotipo, si identifica il gene che, alterato, produce un prodotto genico alterato che comporta il fenotipo evidenziato. Quindi muto il mio organismo o linea cellulare con mutazioni random per identificare poi il gene che mi porta a un fenotipo. Faccio inizialmente degli screening per isolare i mutanti di interesse.

Faccio poi un test di complementazione, ovvero verifico se la mutazione che ho isolato e che mi genera un determinato fenotipo risiede sullo stesso gene.

Esempio

Identifico 2 drosophile senza ali (fenotipo). La drosophila è diploide, quindi a priori so che quello che osservo è un omozigote recessivo. So che ci sono 2 geni che regolano la presenza di ali o no e chiamo Gene 1 e Gene 2. Ipotizzo che due moscerini sono omozigoti recessivi per Gene 1 o Gene 2, che la mutazione è o in gene 1 o in gene 2. Solo quando Gene 1 e Gene 2 sono espressi allora abbiamo le ali. Incrocio i due moscerini e ottengo un eterozigote che ha un allele mutato del Gene 1 e uno no e un allele mutato del Gene 2 e uno no. Dato che è una mutazione recessiva ed essendo presenti geni dominanti, la progenie avrà le ali perché è stata complementazione.

Se invece ipotizzo che la mutazione è presente solo su Gene 1 e non su Gene 2, quando farò accoppiare le due drosophile otterrò una progenie senza ali perché, essendo la mutazione presente solo su gene 1, sarà per forza omozigote recessivo per Gene 1, quindi non è avvenuta complementazione. Il test ci permette di scremare mutanti sullo stesso gene e quindi con lo stesso fenotipo.

Se sto studiando un determinato pathway, faccio una dissezione di network biologici e tramite analisi di epistasi ci permette di identificare come due geni agiscono sullo stesso pathway. Le analisi di epistasi si effettuano su organismi con fenotipo diverso ma che coinvolge la stessa caratteristica (tipo colore occhi) e si produce il doppio mutante per andare ad analizzare il fenotipo.

Esempio

Dopo queste analisi nella Genetica Classica, devo identificare la sequenza del gene mutato e lo si fa con diverse tecniche. A questo punto, conoscendo la sequenza, posso risalire al tipo di prodotto proteico e studiare biochimicamente come funziona la mutazione.

La genetica inversa

Nella genetica inversa, modifico un gene per ottenere un fenotipo diverso da quello WT. Questo approccio fu sviluppato dopo aver sequenziato il genoma di diversi organismi.

Gli organismi modello sono organismi che sono stati studiati a fondo e vengono ancora utilizzati per studiare aspetti biologici di base e vengono sfruttati per la ricerca di base. Saccharomyces cerevisiae è l’organismo modello degli eucarioti e l’Escherichia coli per i procarioti. Circa il 30% dei geni umani noti per essere coinvolti in una malattia ha una funzione omologa nel lievito.

Limiti dell’utilizzo di colture cellulari: alcuni tipi cellulari non sono facili da mantenere in coltura e non si possono dedurre le possibili interazioni tra diversi tipi cellulari in un organo o in un intero organismo. Ecco perché sono stati prodotti degli animali transgenici come i topi che vengono utilizzati come organismi modello per lo studio più macroscopico delle funzioni geniche o alterazioni geniche.

Organismi modello

Si possono effettuare tanti esperimenti, ma l’unico test definitivo per determinare la funzione di un gene è lo studio in vivo di organismi mutati e del fenotipo che si sviluppa. Nella Genetica inversa, quindi, dopo aver identificato il mio gene, posso modificarlo come desidero e poi lo inserisco in un organismo modello e studio in vivo il fenotipo che si sviluppa. 06/10/14

Studio funzione genica

Come si può inattivare un gene in lievito? Il lievito gemmante è un eucariote e lo si può utilizzare sia in stato aploide che diploide, quindi è ottimo per studiare mutazioni geniche. Un approccio per studiare un gene è quello di inattivare il suddetto gene e studiarne poi il fenotipo (genetica inversa).

Per effettuare la delezione di un gene di interesse, posso sfruttare una sua caratteristica, ovvero posso sfruttare il fatto che possono fare ricombinazione omologa con un’alta efficienza. Quindi se introduco un frammento di DNA lineare con delle estremità omologhe all’interno del lievito, quello che succede è che avviene ricombinazione omologa con conseguente perdita del gene di interesse. Il frammento che vado ad introdurre e che deve fare ricombinazione omologa viene chiamato cassetta e nel nostro caso, che sostituisce ed elimina un gene, prende il nome di cassetta di delezione.

Queste cassette devono essere costruite prima ed appositamente e per farlo sfrutto la PCR. Per costruire tale cassetta devo scegliere gli oligonucleotidi, i primers e il DNA stampato appositi; le cassette sono specifiche, non se ne può fare una universale. Dopo aver fatto la cassetta, trasformo il lievito con la mia cassetta, attendo che i miei trasformanti facciano ricombinazione omologa ed infine analizzo i trasformanti per vedere se hanno davvero integrato la mia cassetta e lo faccio con una PCR (amplifico la cassetta e poi con elettroforesi vedo se è presente).

La cassetta di delezione deve avere sequenze in 5’ e 3’ omologhe a sequenze sul DNA nel punto dove voglio che la sequenza vada a sostituirsi e inoltre la cassetta deve avere un marcatore in modo che io possa identificare facilmente i trasformanti (esempio immunità ad antibiotico o cose così).

Tutto il genoma di lievito è stato mappato ed ogni orf è stata identificata ed agli è stato assegnato un nome sistematico, per esempio per la ORF di TEM1 il nome è: YML064C dove:

• Y = yeast (lievito)
• M = Cromosoma 13 (lettera alfabeto = n° cromosoma, A = cromosoma 1)
• L = left, indica in quale braccio è posizionato il gene, guardando il centromero e posizionando il braccio più corto sulla sinistra.
• 064 = sessantaquattresima ORF partendo dal centromero.
• C = L’ORF è posizionata sull’elica Crick (sull’elica in basso quella che è 3’-5’)

Per fare i primer devo scegliere una sequenza avente 45 nucleotidi posizionati a monte dell’ATG e deve essere uguale alla sequenza codificante e una sequenza di 45 nucleotidi posizionati a valle della sequenza stop ma deve essere uguale alla sequenza stampo (complementare alla sequenza codificante). (Quando scrivo i primer devo sempre scriverli 5’ 3’ e per quanto riguarda il primer a valle leggo a partire dal codone stop per 45 bp e scrivo il complementare a partire dalla 45esima base sino al codone stop, in pratica il codone stop sta in 3’).

Avendo quindi i primer, posso amplificare la mia cassetta (che generalmente è situata in un plasmide) e quindi avvio la PCR avendo cura di aver adeguati polimerasi, desossinucleotidi e ovviamente i primer che ho creato. È importante che il gene all’interno della mia cassetta venga costituitivamente espresso, altrimenti non potrò screenare i trasformanti. Dopo aver fatto al PCR, faccio un controllo qualità facendo una corsa elettroforetica con una frazione per determinare PM e lunghezza dei DNA prodotti.

Infine, trasformo i mo e identifico i trasformanti grazie all’integrazione della cassetta e all’espressione del gene reporter. Però, la mia cassetta si può essere integrata in posizioni diverse da quelle da me desiderate quindi per controllare se si è posizionata nel posto giusto faccio una PCR.

La PCR di controllo si avvale di 4 primer. Nel caso visto in classe abbiamo 2 primer esterni al gene kan (gene reporter inserito all’interno della cassetta vista come esempio in classe) chiamati U (quello a monte dell’ATG) e D (quello a valle del codone stop) e 2 primer interni al gene kan chiamati K1 e K2.

Il primer U è di 18 nucleotidi posizionati a monte del primer che avevamo scelto per fare la PCR della cassetta e sarà uguale alla sequenza codificante, D è uguale alla sequenza stampo ed è situato a valle dei primer scelti. (U e D devono necessariamente essere fuori dalla cassetta perché altrimenti avremmo sempre un riscontro positivo durante la PCR di controllo). K1 e K2 sono 2 primer commerciali interni alla sequenza kan.

Se la cassetta si è integrata nel locus di interesse, k1 può allungarsi sino al complementare di U e formare un amplificato di DNA a doppio filamento, stessa cosa con il primer D che può allungarsi sino al complementare di k2 producendo un amplificato di DNA a doppio filamento e infine avremo un DNA amplificato partendo dal primer D che giunge sino al primer U ottenendo in totale 3 amplificati.

Se la cassetta non si integra nel locus di interesse, noi screeneremo il mo come positivo ma andando ad analizzare la PCR non otterremo alcun amplificato dato che i primer U e D non si appaiano. Il DNA stampo di questa PCR di controllo è ovviamente il genoma dell’organismo trasformato.

Dopo aver fatto la PCR faccio una corsa elettroforetica e mi aspetto in un trasformante diploide 4 bande, 3 sono quelle delle amplificazioni e una sarà l’amplificazione U e D del gene wild type che ha peso 900 bp. Fatto ciò, posso passare alla induzione della formazione delle tetradi in modo da studiare in aploidе tale manipolazione genica con la cassetta di delezione. Isolo le spore seminandole con replica plating su un terreno avente l’antibiotico dove il WT muore mentre il trasformante no. Posso avere il caso dove 2 spore su 4 crescono (me lo aspetto non ho distrutto geni essenziali), il caso dove non crescono spore (ho distrutto gene essenziale), e le spore dove alcune formano colonia e altre no (può essere avvenuto un evento che ha mutato il gene di lievito, quindi questo risultato non è direttamente associato alla mia cassetta).

Approccio alternativo allo studio della funzione genetica per delezione: Utilizzo un promotore inducibile per la promozione dell’espressione del gene di mio interesse in modo tale che io possa modulare l’espressione del prodotto del gene di mio interesse e studiarne la funzione. Per modulare l’espressione aggiungo al terreno di crescita il repressore che reprime il mio promotore.

Il degrone

Sistema per studiare mutanti termosensibili, fu sviluppato in lievito ma può essere usato su tutti gli organismi. Si crea artificialmente una proteina termosensibile che viene degradata a 37°C ma tale proteina non viene prodotta per mutagenesi, ma mediante la creazione di una proteina di fusione tra la proteina di interesse e l’ubiquitina. A monte della proteina che vogliamo degradare fusa in frame abbiamo il DHFR (mouse dihydrofolate reductase), un residuo destabilizzante (arginina) e l’ubiquitina. Una volta prodotta questa proteina, le proteine deubiquinanti tolgono l’ubiquitina in modo molto preciso esponendo il residuo destabilizzante (l’arginina). Questo di per sé non denatura la proteina ma a 37°C la DHFR cambia conformazione ed espone molte lisine e questo genera una massiccia ubiquitinazione che porta la conseguente degradazione della proteina.

Plasmide ad integrazione per studiare degradazione termica

Utilizzo un plasmide ad integrazione (si integra nel genoma con un solo crossing over) contenente due sequenze omologhe per il gene della molecola che voglio studiare in degradazione termica. In questo plasmide ho diversi livelli di controllo come ad esempio P CUP1: promotore indotto dalla presenza di rame, utile perché risponde a diverse concentrazioni di rame; si può anche usare il promotore endogeno ed inoltre ho geni reporter come URA e amp. Quindi con un solo evento di crossing over l’intero plasmide sarà integrato nel genoma. Dato che il locus di inserzione è il gene stesso che voglio studiare, avrò una porzione troncata del gene e una porzione completa dove però in frame ho il DHFR e quindi potrò studiare la degradazione termica. È molto utile la presenza dei primer A1 ed A2 dato che A1 è situato nella porzione genica che codifica DHFR ed A2 è posizionato a valle del gene di interesse, quindi quando vado a fare il controllo con la PCR otterrò un frammento amplificato solo se è integrato il plasmide. 13/10/14

I geni reporter

I geni reporter sono diversi e di diversi tipi, un esempio è il gene LacZ. La cosa importante da ricordare quando si utilizza un gene reporter è che deve essere un gene eterologo, in modo che non vi siano altre copie del gene nel genoma, e che sia facilmente usabile e visualizzabile (un gene il cui prodotto genera, anche indirettamente, colore). LacZ è un gene che codifica per una β-galattosidasi, che scinde il lattosio, ma a livello empirico viene utilizzata una molecola simile al lattosio che è l’X-gal che viene scisso dalla β-galattosidasi in glucosio e un composto di colore blu, quindi sfruttando ciò LacZ diviene un gene reporter perché vediamo immediatamente se il suo prodotto genico è presente o no. Inoltre, la presenza del colore blu è direttamente proporzionale all’espressione genica e può essere misurata la quantità con lo spettrofotometro.

LacZ può essere utilizzato in diverse maniere, ad esempio può essere messo sotto il controllo del promotore per il nostro gene di interesse in modo tale che quando il mio gene di interesse viene espresso, allora anche il gene LacZ ottenendo così un rapporto diretto tra la quantità di blu e la concentrazione del prodotto espresso dal mio gene di interesse, ed inoltre potremmo anche identificare in quale parte del ciclo cellulare avviene l’espressione del mio gene. Dovendo sempre trasformare il mio organismo è necessario...