Appunti analisi e funzioni geniche (aggiornato)

MECCANISMO DI TRASPOSIZIONE COPIA E INCOLLA DEI RETROTRASPOSONI

I trasposoni sono integrati nel DNA come un

frammento di DNA a doppio filamento, in

giallo vi solo le regioni codificanti e in viola

le LTR.

Per trasporsi il retrotrasposone viene

trascritto ad RNA, questo RNA viene

retrotrascritto a DNA a doppio filamento,

l’integrasi effettua un taglio con estremità

protruding e in quel sito si andrà ad inserire

il DNA retrotrascritto, la DNA polimerasi

quindi colmerà il gap generato dalle

estremità protruding formando così le nuove

sequenze LTR.

Quindi ogni volta che il retrotrasposone

traspone aumenta il suo numero di copie.

Ty elemento trasponibile di lievito

Elemento costituito da LTR a monte e a valle, due geni TyA e TvB che codificano per tutte le attività

enzimatiche necessarie per la trasposizione. Vi possono essere da 35 a 40 copie di Ty nel genoma di

lievito. Gli elementi Ty non sono inseriti a caso nel genoma di lievito ma sono

inseriti in prossimità dei geni del tRNA, questo perché si formano dei

all’interno della cellula tra l’integrasi

complessi specifici proteina-proteina

e determinate proteine legate al DNA che specificano il sito di

integrazione di Ty nel DNA. L’integrasi di Ty si è vista interagire con

repressori trascrizionali situati a monte dei geni del tRNA.

Copia di drosophila è un retrotrasposone con ripetizioni invertite a monte

e a valle e possono essere presenti 60 copie per genoma. È stato

osservato che il 50 % delle mutazioni in drosophila è causato dallo

spostamento di copia.

Gli elementi LINES (Long interdispersed nuclear element)

Contiene anch’esso i geni per la trasposizione ma non contiene le LTR

Questo è importante perché le sequenze LTR sono importanti per

l’integrazione durante la trasposizione e l’assenza di esse indica che

LINES ha sviluppato un altro meccanismo per trasporsi.

Meccanismo:

Il DNA di LINES viene comunque trascritto in RNA (filo viola) ma per

inserirsi nel genoma deve essere presente un NICK, a questo punto

l’RNA si appaia, non vi è alta omologia tra l’RNA e il filamento dove è

presente il nick l’importante è che si appii. L’RNA funge da stampo per

una trascrittasi inversa che genererà un cDNA legato al DNA lì dove

c’era il NICK. Alla fine della retrotrascrizione l’RNA viene degradato e il cDNA viene usato da stampo per il

un secondo NICK sull’altro

secondo filamento ottenendo così una doppia elica, a questo punto si forma

filamento e il cDNA a doppio filamento può quindi integrarsi, le ligasi chiuderanno i gap. Il primo nick è

casuale mentre il secondo è coadiuvato dal sistema di trascrizione in atto.

Come sopravvivono organismi a così tanti elementi trasponibili nel genoma?

Gli elementi trasponibili come SINE e LINE sono presenti negli introni e non negli esoni (1% circa del

genoma) e quindi non causano danni.

l’inserimento di sequenze LINE nel gene del fattore VIII causa l’emofilia A, nell’esone 44 o 48 del gene

Ma

della distrofina causa Distrofia muscolare di Duchenne, nei geni APC e c-myc causano cancro al colon e ai

l’inserimento di sequenze Alu (SINE) causa emofilia B (fattore IX), neurofibromatosi (NF1), cancro

polmoni

al seno (BRCA1e BRCA2), acolinesterasemia (ChE).

Gli elementi trasponibili che hanno avuto più successo sono quelli che sono riusciti a trasporsi nei rifugi

del genoma e che quindi non causavano danno, i rifugi sono:

 All’interno di retrotrasposoni (es in alcuni cereali)

 Nell’eterocromatina centromerica (sia piante che animali)

 Nei geni per RNA ribosomiale (es in artropodi, Drosophila, hanno più di 100 geni per rRNA)

Molti trasposoni però risultano inattivi cioè sono incapaci di spostarsi e di aumentare il numero di copie a

causa di mutazione che inattivano i geni codificanti per le attività necessarie per la loro trasposizione

ovvero per la trasposasi o la trascrittasi inversa.

Gli organismi ospiti degli elementi trasponibili sfruttano meccanismi attivi per la regolazione degli elementi

stessi.

Meccanismi di regolazione degli elementi trasponibili

Gli studi effettuati su C. elegans che hanno permesso di determinare un meccanismo di repressione per il

gene della trasposasi.

Partendo da un mutante di C.elegans avente come fenotipo delle contrazioni visibili al microscopio, questo

era causato dalla mancanza di funzione genica di unc-22 in cui era stato trasposto il trasposone Tc1 che

quindi lo inattivava.

Sono state fatte delle mutazioni random e furono isolati alcuni vermi che continuavano ad avere contrazioni

mentre in altri il vermi si muoveva normalmente. Studiando questi ultimi furono isolati 25 geni in C.elegans

che quando mutati permettevano la trasposizione del trasposone Tc1.

Questi 25 geni erano tutti coinvolti in un processo chiamato interferenza da RNA, un meccanismo utilizzato

dall’organismo per silenziare i propri geni. Ed il principio è quello che se si formano degli RNA a doppio

filamento esso viene riconosciuto come elemento aberrante e viene degradato. 7/11/2014

Parte prof Clerici

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA NEI PROCARIOTI

Nei procarioti distinguiamo due tipi di geni, i geni housekeeping ovvero i geni costitutivamente espressi, e i

geni Regolati ovvero i geni espressi solo quando il prodotto genico è necessario alla crescita.

Dei geni regolati ne distinguiamo di due tipi: i geni inducibili che sono espressi solo in presenza di un

determinato substrato e sono di solito geni che codificano per enzimi coinvolti in determinate vie

cataboliche.

I geni reprimibili sono geni normalmente espressi ma non lo sono + quando il prodotto della loro attività è

già presente o presente in quantità sufficiente.

Nei procarioti esistono diversi livelli di regolazione dell’espressione genica:

A partire dal DNA troviamo la regolazione a livello della trascrizione, poi abbiamo un livello di regolazione

maturazione dell’RNA anche se non complessa quanto quella degli eucarioti.

sulla della stabilità dell’RNA e della traduzione dello stesso e in fine abbiamo un livello

Una regolazione a livello

di regolazione a livello post-traduzionale.

Anche se presenti tutti questi livelli di regolazione, nei procarioti, il livello di regolazione più sfruttato è

quello a livello trascrizionale.

TIPI DI REGOLAZIONE A LIVELLO TRASCRIZIONALE

La peculiarità dei geni regolati è che in 5’ oltre alle sequenze del promotore hanno anche delle sequenze

regolative che sono riconosciute da specifiche proteine, il legame o l’assenza di legame di tali proteine alle

sequenze regolative determina se avviene o meno la trascrizione.

A livello trascrizionale troviamo due tipi di regolazione

1. Il controllo negativo: delle proteine repressore legano delle sequenze regolative specifiche situate

vicino al promotore dette operatore ed impediscono l’accesso dell’RNA polimerasi sul promotore

2. Il controllo positivo: delle proteine attivatrici legano sequenze attivatrici situate nella zona del

promotore e questo promuove il legame dell’RNA polimerasi sul promotore.

Regolazione positiva e negativa della trascrizione in un sistema inducibile

Un gene inducibile è un gene espresso in presenza di determinate sostanze, e può essere regolato in

modo positivo o negativo

In un sistema inducibile negativo interviene un repressore, esso è legato al suo sito di legame ed

impedisce che la trascrizione avvenga. In presenza di un induttore, ovvero la molecola che lega il

repressore, l’induttore stesso interagirà con il repressore, che ha un sito di legame apposito per l’induttore,

con questo legame il repressore cambia conformazione e non sarà più in grado di legare il DNA e quindi

l’RNA polimerasi potrà iniziare la trascrizione

In un sistema inducibile positivo viene costitutivamente prodotto un attivatore, che però è in una

conformazione inattiva e non si può legare al DNA, senza l’attivatore attivo l’RNA polimerasi non si può

presenza di un induttore l’attivatore si lega ad esso e cambia

legare e non può trascrivere. In

conformazione attivandosi e quindi sarà in grado di legare il DNA e di reclutare e far legare l’RNA

polimerasi.

L’operone lac

L’operone lac è un sistema inducibile negativo quindi in assenza di lattosio nel terreno di coltura

l’espressione dei geni dell’operone lac non avviene, ma in presenza di lattosio l’operone viene

espresso.

L’operone però è sottoposto a controllo negativo e positivo contemporaneamente

La regolazione negativa coinvolge un repressore, che viene codificato da lacI, esso lega

l’operatore, che è la sequenza lacO, e tale legame inibisce l’espressione dei geni dell’operone IN

ASSENZA DI LATTOSIO

L’AGGIUNTA DEL LATTOSIO nel terreno fa sì che l’allolattosio (forma modificata del lattosio) si

leghi al repressore permettendone il distacco dall’operatore e facendo che l’operone venga

sì

espresso. Questo meccanismo avviene sia in presenza che in assenza di glucosio.

La regolazione positiva è dipendente dalla presenza o meno del glucosio, se il glucosio non è

presente abbiamo una elevata espressione dei geni dell’operone lac viceversa se il glucosio è

presente le cellule prediligono la via metabolica del glucosio e quindi la via metabolica del lattosio

energetici e quindi i geni dell’operone lac non vengono espressi.

non è molto importante ai fini

Questa viene chiamata repressione da catabolita e dipende dalla presenza della molecola cAMP,

esso viene prodotto in assenza di glucosio ed è in grado di legare una regione adiacente

dell’operatore favorendo la formazione di un’ansa che favorisce il legame della RNA polimerasi.

Regolazione positiva e negativa della trascrizione in un sistema reprimibile

Un gene reprimibile è espresso fintanto che un certo tipo di molecola non è presente, quando tale

molecola è presente allora l’espressione genica di questo gene viene ridotta.

In un sistema reprimibile negativo abbiamo che un repressore viene sintetizzato ma non è in

grado di legare il DNA quindi l’RNA polimerasi riesce a svolgere il suo compito. La molecola che

attiva il repressore e che gli permette di legarsi al DNA prende il nome di co-repressore quindi la

sua aggiunta permette di al repressore di legare il DNA e la RNA polimerasi non riesce più a

svolgere il suo compito e la trascrizione del gene viene inibita.

In un sistema reprimibile positivo abbiamo la sintesi di un attivatore che è in grado di legarsi al

DNA e di promuovere il legam