Le mutazioni

ERRORI DURANTE LA REPLICAZIONE

Mutazioni per sostituzione di coppie di basi Nella figura è mostrato ciò che può accadere, durante la replicazione, se una delle 4 basi si trova nella sua forma tautomerica. Nell'esempio abbiamo una G che nella sua forma tautomerica si appaia con la T anziché con la C. Nel ciclo di replicazione successivo, le due basi appaiate erroneamente si separeranno perché ogni filamento fungerà da stampo per la sintesi di un nuovo filamento di DNA. Questa volta la G non più nella sua forma rara, si appaierà correttamente con la C ma, sull'altro filamento, la T che era stata precedentemente incorporata impropriamente funziona da stampo e si accoppia con l'A. Questo porta alla formazione di una molecola di DNA mutante che contiene una coppia A-T anziché G-C. Si è quindi generata una mutazione per sostituzione. Mutazioni per inserzione o delezione Durante la replicazione, possono insorgere anchedelezioni o inserzioni di uno o più nucleotidi dovuti ad un ripiegamento anomalo del filamento di DNA stampo o di quello in fase di sintesi. Se il ripiegamento avviene nel filamento del DNA stampo (immagine a sinistra della figura), la DNA polimerasi salterà la base o le basi interessate dalla protrusione dell'elica, generando una delezione sul filamento di DNA sintetizzato. Se questa situazione non viene riparata dai sistemi di riparo del DNA allora, nel successivo ciclo di replicazione, la delezione sarà replicata e entrambi i filamenti della doppia elica la conterranno. Se invece, come nella parte destra della figura, il ripiegamento avviene nel filamento di DNA nuovo, la DNA polimerasi sintetizzerà di nuovo i nucleotidi interessati dalla protrusione generando delle inserzioni sul filamento di DNA neosintetizzato che, se non riparato, permanerà nei successivi cicli di replicazione. Cambiamenti chimici spontanei Per quanto riguarda le mutazioni dovute a cambiamenti chimici spontanei, possono verificarsi diverse situazioni. Ad esempio, una base può subire una modificazione chimica che altera la sua struttura e quindi la sua capacità di appaiarsi correttamente durante la replicazione del DNA. Questo può portare a errori nella sintesi del nuovo filamento di DNA, causando una mutazione. Un altro tipo di cambiamento chimico spontaneo è la depurinazione, che consiste nella perdita di una delle basi puriniche (adenina o guanina) dal filamento di DNA. Questo può causare una rottura nel filamento di DNA durante la replicazione, portando a una delezione o a una sostituzione errata della base mancante. Inoltre, possono verificarsi cambiamenti chimici che causano la formazione di legami covalenti tra basi adiacenti nel filamento di DNA. Questi legami possono interferire con la corretta separazione dei filamenti durante la replicazione, causando errori nella sintesi del nuovo filamento di DNA. Infine, possono verificarsi cambiamenti chimici che alterano la struttura del DNA, come ad esempio la formazione di legami tra basi di filamenti diversi. Questi legami possono causare una distorsione nella struttura del DNA e interferire con la corretta replicazione del DNA. In conclusione, le mutazioni possono essere causate da diversi meccanismi, tra cui delezioni o inserzioni di nucleotidi dovute a ripiegamenti anomali del DNA, e cambiamenti chimici spontanei che alterano la struttura del DNA durante la replicazione.cambiamenti chimici spontanei, abbiamo la depurinazione e la deaminazione. - depurinazione: consiste nella perdita di una base purinica (A o G) dal DNA dovuta alla rottura del legame che connette la purina al desossiribosio, dando luogo ad un sito apurinico. Normalmente una cellula di mammifero perde spontaneamente un numero elevato di purine ad ogni ciclo cellulare ma esistono comunque dei sistemi di riparo efficienti che rimuovono questi siti apurinici. Se questo non accade, questi siti possono essere fonte di mutazione durante la replicazione. Come si vede in figura, in corrispondenza del sito apurinico, può essere inserita una base qualsiasi (es. A) generando così, dopo un altro ciclo di replicazione, una coppia ad esempio di A-T anziché C-G. - deaminazione: comporta la rimozione di un gruppo amminico da una base. Ad esempio la deaminazione della C produce uracile che è una base dell'RNA. In questo caso, durante la replicazione del DNA, nel filamento della nuova sintesiverrà incorporata, nella posizione complementare, una T creando (dopo un altro ciclo di replicazione) una coppia T-A anziché C-G. Analogamente, la deaminazione della 5-metilcitosina (base modificata) porta alla formazione di T che, al ciclo successivo di replicazione, determinerà l'incorporazione di A nel filamento di nuova sintesi. Le mutazioni per deaminazione della 5-metilcitosina sono meno efficientemente riparate rispetto alle altre modifiche e quindi, le regioni ricche di citosina metilata, sono delle hotspot mutazionali cioè con frequenze di mutazioni molto elevate. CAUSE DELLE MUTAZIONI INDOTTE Esistono diversi agenti ambientali come sostanze chimiche e radiazioni che sono in grado di danneggiare il DNA. Si definisce mutageno, qualsiasi agente ambientale che aumenta il tasso di mutazione al di sopra di quello spontaneo in maniera significativa. EFFETTI DEGLI ANALOGHI DELLE BASI Iniziamo con gli analoghi delle basi che sono delle molecole che hanno una

struttura chimica similea quella delle basi del DNA. Le DNA polimerasi non sono in grado di distinguere questi analoghidalle basi normali che,così,vengono inglobati nel DNA. Il 5-bromouracile ad esempio,è un analogodella timina e quando è inserito nel DNA può appaiarsi normalmente con l’adenina. Poiché però vaincontro a cambiamenti tautomerici,nella sua forma rara tautomerica si appaia con la Gdeterminando così una sostituzione nucleotidica in cui la coppia originale T-A è sostituita dallacoppia C-G. (quindi: 5-bromouracile ha una struttura molto simile a quella dellatimina,quindi,l’incorporazione di questa al posto della timina non danneggia il DNA che puòreplicarsi e trascrivere in modo del tutto normale. MA il 5-BU subisce più facilmente unatransizione tautomerica che porta all’appaiamento con la G invece che all’A. in questomodo,avviene una mutazione per sostituzione per transizione

quindi CG al posto di TA).

EFFETTI DELLE SOSTANZE CHIMICHE

Alcuni agenti mutageni possono cambiare la struttura chimica delle basi. L'acido nitroso ad esempio, rimuove i gruppi amminici dalla G, dalla C e dalla A. La deaminazione della guanina produce xantina che però, pur essendo una G modificata, continua ad appaiarsi con la C senza provocare mutazioni. La deaminazione della C porta invece alla formazione di uracile che, appaiandosi con l'A, induce una sostituzione nucleotidica della coppia C-G in T-A. Infine, la deaminazione dell'A porta ipoxantina e questa base modificata si appaia con la C producendo una mutazione per sostituzione da una coppia A-T ad una coppia G-C.

Un'altra sostanza chimica che modifica le basi è la idrossilammina che reagisce con la C aggiungendo un gruppo OH. La C modificata, anziché appaiarsi con la G si appaia con l'A generando una mutazione in cui una coppia C-G viene sostituita da una coppia T-A.

Agenti intercalari

Alcune

sostanze chimiche, come il bromuro di etidio e l'acridina, hanno la proprietà di inserirsi tra due basi adiacenti lungo i filamenti del DNA alterando la struttura tridimensionale della doppia elica. Se durante la replicazione del DNA l'agente intercalante si inserisce nel filamento stampo (come nella figura a sinistra), allora, nel filamento in fase di sintesi verrà inserito di fronte all'agente intercalante un nucleotide a caso (ad esempio la guanina). Al successivo ciclo di replicazione si formerà, quindi, una doppia elica di DNA in cui viene inserita, in quel punto della sequenza, una coppia di basi (nell'esempio una coppia C-G). Se invece l'agente intercalante si inserisce nel filamento di DNA in fase di sintesi (al posto di un nucleotide), allora, al successivo ciclo di replicazione, quando l'agente intercalante verrà allontanato, si avrà una delezione di una coppia di basi (nell'esempio la delezione della coppia T-A).

54EFFETTI

DELLE RADIAZIONI

Per quanto riguarda le radiazioni, è ben noto che sono responsabili dell'insorgenza di mutazioni. Siamo tutti esposti continuamente alle radiazioni di diversa natura (particelle radioattive, raggi x o da altre fonti ambientali..). Per quanto riguarda le radiazioni ionizzanti, quali i raggi x e il radon, queste determinano il rilascio di elettroni e creano quindi radicali liberi che possono rompere i legami covalenti delle molecole. Così sul DNA possono rompere il legame fosfodiesterico o quello tra gli zuccheri e le basi, determinando così mutazioni puntiformi o cromosomiche. Le radiazioni non ionizzanti invece, come i raggi ultravioletti, hanno meno energia di quelle ionizzanti quindi agiscono solo sulle cellule che sono più esposte. Negli organismi pluricellulari, quali l'uomo, queste radiazioni colpiscono fondamentalmente le cellule dell'epidermide e sono quindi responsabili dell'insorgenza dei tumori della pelle.

Agiscono determinando la formazione di legami chimici fra molecole adiacenti di pirimidina sullo stesso filamento di DNA che portano ad una distorsione della doppia elica e possono quindi interferire sia con la replicazione che trascrizione del DNA. Nella figura viene rappresentato il dimero di timina, tra i dimeri pirimidinici più frequenti, indotto dalla luce ultravioletta.

Nella nostra quotidianità siamo circondati da molti agenti chimici, sia di origine naturale che artificiale, con i quali entriamo in contatto sia ingerendo cibo, bevande, sia attraverso il contatto con la pelle o anche con la respirazione. Alcuni di questi agenti chimici sono potenzialmente in grado di indurre mutazioni e quindi sono dannosi. È quindi fondamentale essere in grado di identificare quali sono le sostanze chimiche che inducono mutazioni al fine di evitarne il contatto. Nel 1974, un ricercatore Ames, ha sviluppato un test rapido ed economico per analizzare la mutagenicità delle sostanze chimiche.

Per comprendere a fondo la modalità d'azione di questo test, bisogna tenere a mente quanto abbiamo detto sulle mutazioni inverse (ossia sulla possibilità di revertire una sequenza mutata nella sua forma wild type a seguito di una seconda mutazione). Vedremo inoltre che in questo test, in cui vengono usati dei batteri, si farà uso anche di estratti di fegato di ratto cioè di enzimi epatici. Questo perché alcune sostanze chimiche possono diventare mutagene solo dopo essere state convertite da reazioni enzimatiche tipiche delle cellule eucariotiche che avvengono nel fegato dei mammiferi. Ovviamente questa conversione non ha luogo nei batteri quindi, ad esempio, i nitrati non sono di per sé dei mutageni ma sono convertiti in nitrosammine che invece lo sono. In questo test viene utilizzato un mutante del batterio Salmonella Typhimurium ossia un ceppo batterico che ha una mutazione nella sequenza del gene che codifica per l'amminoacido istidina. Quindi

questo ceppo mutante, a differenza di quello wild type, non è in grado di sintetizzare questo amminoacido. I batteri possono crescere in laboratorio su terreni solidi dove, riproducendosi, formano delle colonie ossia dei piccoli agglomerati di cellule che sono visibili ad occhio nudo. In generale, i batteri wild type sono in grado di sintetizzare da soli tutte le molecole organiche di cui hanno bisogno per crescere e riprodursi (compresi gli amminoacidi). I terreni solidi su cui vengono fatti crescere i batteri wild type sono dei terreni semplici, detti minimi, che contengono solo dei sali inorganici e degli zuccheri. Nel nostro caso il batterio Salmonella, mutante per istidina, non potrà crescere su un terreno minimo in quanto non è in grado di sintetizzare questo amminoacido fondamentale per tutte le proteine a lui necessarie. La logica generale del test di Ames è che il batterio mutante potrà crescere su un terreno minimo e formare colonie, solo se avviene una

nella sua forma wild type. Nella figura si può seguire la modalità di esecuzione.