Le basi della Medicina di laboratorio

Medicina di laboratorio L.C. 2017-2018

Introduzione

Le informazioni vengono dagli appunti presi in aula e dagli studenti degli scorsi anni, integrati con le slide. Alcuni valori purtroppo sono riportati diversamente dai vari professori, così come alcune analisi di laboratorio. Le cose evidenziate in rosso sono infatti quelle dubbie o sovrapposte.

• Biochimica clinica – da 3 a 50
• Patologia clinica – da 51 a 81
• Microbiologia – da 82 a 100

Le basi della medicina di laboratorio

La medicina di laboratorio è considerata “la scienza nascosta che salva le vite” e studia parametri chimici, fisici e biologici volti a raccogliere informazioni di tipo fisiopatologico. La possiamo dividere in tre branche: la Biochimica clinica, la Patologia clinica e la Microbiologia clinica.

Biochimica clinica

Nella ricerca di base, la biochimica clinica studia i meccanismi biochimici alla base dei processi fisiopatologici attraverso “l’esame di laboratorio”. Nel processo diagnostico, c'è una fase di determinazione dei singoli analiti e poi la fase di utilizzo dei dati ottenuti ai fini diagnostici. L’“esame di laboratorio” è l'identificazione di un biomarcatore, costituente biochimico, presente in un campione biologico. Può essere svolto con metodi qualitativi o quantitativi. I suoi fini sono: la diagnosi, il monitoraggio, lo screening, il follow-up, la prognosi, la prevenzione, esigenze medico-legali.

Esistono diverse tipologie di laboratorio e di analisi cliniche. Nel laboratorio generale e in quello specialistico esistono tutte le fasi del processo analitico, si utilizzano test quantitativi e apparecchiature automatizzate. Esistono poi i POCT (point of care testing), “laboratori di reparto”, che permettono una notevole riduzione dei tempi saltando alcuni passaggi del processo analitico (manipolazione, trasporto e refertazione del campione). In genere, hanno pochi test semimanuali semplici con un pannello ristretto di analiti. Utili in condizioni acute critiche, come in sala operatoria, e per il monitoraggio a domicilio (es pazienti diabetici).

Programma biochimica clinica

Il programma vedrà prima una parte generale sul processo di produzione dei risultati di laboratorio e sulla definizione dei valori e limiti dei risultati. Poi una parte speciale sui meccanismi biochimici e sull’esame degli analiti.

• Esami di laboratorio: definizione, tipologia, modalità di richiesta.
• Fase preanalitica: variabilità preanalitica.
• Fase analitica: variabilità analitica, caratteristiche generali delle tecniche di misura, errore di laboratorio, controllo di qualità.
• Fase post-analitica: variabilità biologica e valori di riferimento, nomenclatura e refertazione, la logica diagnostica nel laboratorio.
• Il laboratorio negli equilibri: idro-elettrolitico e acido-base.
• Il laboratorio nelle malattie del pancreas.
• Il laboratorio nel metabolismo dei carboidrati.
• Il laboratorio nel metabolismo dei lipidi.
• Il laboratorio nelle malattie cardiovascolari.

Il processo analitico: Fase preanalitica

1) Accettazione richieste di analisi – Si valuta l’appropriatezza della richiesta, ci devono essere fondate ragioni cliniche, visto che spesso sono richieste analisi ridondanti. Ci deve essere un rapporto costo/beneficio favorevole. È importante poi la modalità della richiesta, devono essere presenti i dati del paziente, la motivazione della richiesta, eventuali condizioni particolari (tra cui i tempi di consegna, TAT) e il nome inequivocabile delle analisi. Per ultima c’è la razionalizzazione della richiesta, quindi a seconda della motivazione si eseguono profili finalizzati (es emocromo, elettroliti, urine), esami di screening, esami urgenti, prove di funzionalità dinamiche.

2) Preparazione del paziente e istruzioni sulla raccolta dei materiali biologici – Il risultato deve riflettere il reale profilo biologico e fisiologico del paziente, ma ci sono fattori che influenzano l’allestimento dei campioni. Dieta, ritmi cronobiologici (ormoni), esercizio fisico (enzimi metabolici correlati, CK), altitudine, farmaci (compresi fumo e alcol), sostanze interferenti endogene (es emolisi, che si può verificare anche durante il prelievo o il trasporto).

(Esempio) Prelievo venoso: da eseguire al mattino (8-10h), dopo digiuno di 8 ore e a riposo per almeno 5 min prima del prelievo. Si esegue con sistema vacutainer, prelevando 2-10ml. Nella provetta sono già inseriti gli anticoagulanti, a seconda del tipo di analisi da effettuare (EDTA e citrato sono chelanti del calcio, l’eparina inibisce la trombina). Vanno ricordati anche il prelievo arterioso e quello capillare.

3) Prelievo e raccolta del materiale – Tipo di campione, anticoagulanti, tipo di provetta (siero, plasma).

4) Trasporto – Alcuni campioni necessitano di stabilizzanti o conservanti per analisi particolari. Ad esempio, le crioglobuline vanno trasportate a 37°, per gli ormoni si aggiungono inibitori delle proteasi.

5) Separazione plasma-siero – Plasma o siero vanno separati dalle cellule entro due ore per evitare emolisi. La separazione deve essere rapida, ma non troppo. Per il plasma si centrifuga il campione in presenza di anticoagulanti, mentre per il siero si lascia coagulare il sangue (30 minuti) e poi si centrifuga.

6) Conservazione dei campioni biologici – Se il campione è mantenuto a temperatura ambiente va analizzato entro quattro ore dal prelievo, altrimenti a 4° può essere conservato per 24 ore. Ci sono processi chimico-fisici (solubilità, fotolisi, aggregazione) e biochimico-metabolici (alterazione sistemi energetici, permeabilità cellulare) che possono alterare la conservazione. Il contatto con l’aria altera pO₂, pCO₂ e pH, l’attività cellulare può alterare il glucosio, l’emolisi l’emoglobina, enzimi e ioni.

La variabilità preanalitica si riferisce ad alterazioni qualitative e quantitative che possono interessare il campione prima che si esegua la misurazione, dipende dalla modalità di prelievo e di raccolta, dal tipo di trattamento applicato al materiale. Durante la fase preanalitica va effettuato un controllo di qualità che prevede l’identificazione e rintracciabilità del campione, il controllo sulla modalità di prelievo, trasporto e conservazione.

In genere, nel processo analitico la fase preanalitica è quella più soggetta ad errori con un tasso di errore che arriva al 14%, mentre è solo del 0,2% in quella analitica, essendo questi procedimenti molto automatizzati.

Fase Analitica

Esecuzione del saggio analitico mediante metodi analitici che misurano il valore della grandezza di interesse. È la fase più controllata e standardizzata, quindi meno soggetta a errori.

1) Riconoscimento dell’analita – Vengono aggiunti dei reattivi al campione per riconoscere in modo specifico gli analiti da misurare. Si può sfruttare l’interazione enzima-substrato (analisi enzimatica), la reazione antigene-anticorpo (analisi immunochimica), la reattività chimica, tecniche di separazione (elettroforesi, ultracentrifugazione).

2) Generazione del segnale e sua misura – Si possono usare diverse strumentazioni, ad esempio la spettrofotometria, che misura l’assorbanza della luce da parte del campione e quindi la concentrazione dell’analita. Ci sono poi altre tecniche ottiche come la turbidimetria, la fluorometria. Esistono inoltre tecniche elettrochimiche e misure di radioattività. Il segnale deve essere associato a dei “calibratori”.

3) Calibrazione – Soluzioni di analiti a concentrazione nota e generalmente crescente. Al lato in genere viene riportata una curva di taratura. Il risultato analitico ottenuto è sempre una stima del valore della grandezza, quello più vicino possibile al valore reale. L’attendibilità si riferisce alla qualità della misura effettuata. Questa dipende da alcune variabili: sensibilità, specificità, precisione, esattezza e accuratezza procedurale in fase preanalitica.

Statistica

Precisione (imprecisione) – Questa include la ripetibilità (precisione nella serie) e la riproducibilità (precisione tra serie diverse). Sapendo che i risultati di una misura in genere si distribuiscono come una gaussiana, possiamo sfruttarne la distribuzione per valutare la DS e il CV, visto che in effetti l’imprecisione è la misura di concordanza tra misure ripetute in uno stesso procedimento analitico in condizioni simili.

La deviazione standard è una misura di dispersione dei dati intorno alla media e viene utilizzata per determinare i limiti di accettabilità di un risultato. 1DS include il 68% dei risultati, 2DS il 95,5% e 3DS il 99,7%. In genere il risultato analitico deve essere incluso in 2DS per essere considerato “buono”.

Il coefficiente di variazione è il valore della DS espresso in percentuale rispetto al valore medio. (CV= DSx100/M)

Gli errori casuali sono quelli che si presentano in maniera irregolare e la cui dimensione è incostante. In parte sono inevitabili, dipendono da distrazioni dell’operatore, efficienza del laboratorio.

Esattezza – È il grado di concordanza tra il valore medio trovato in una serie di analisi e il cosiddetto valore vero. Più sono discordanti, maggiore è l’inesattezza.

Accuratezza – È il grado di concordanza tra il risultato di una singola misura e il valore vero. La discordanza tra esattezza e valore vero è dovuta a errori sistematici, questo tendenzialmente dipende dalla metodica utilizzata. Aumenta o diminuisce in maniera consecutiva e il suo incremento o decremento sono di entità costante e proporzionale.

NB. Un metodo può essere molto preciso (ampiezza della curva ridotta), ma comunque inesatto (risultati lontani dal valore vero).

La variabilità biologica è invece legata alla biologia dell’uomo e alla diversità tra i vari individui, può infatti essere intraindividuale o interindividuale. Questo tipo di variabilità è però controllabile visto che conoscendo i fattori si possono standardizzare. (età, sesso, peso, stress, attività fisica, ormoni)

C’è allo stesso tempo una variabilità biologica non controllabile legata alla variabilità della specie. I valori in uno stesso individuo possono oscillare intorno a un punto di equilibrio omeostatico. La stessa diversità la posso trovare tra vari individui. È fondamentale usare un metodo con percentuale di errore minore della variabilità biologica, altrimenti la misura non ha valore. (anche le patologie possono influenzare la variabilità biologica)

Si possono stabilire per ogni analita dei traguardi analitici di precisione ed esattezza, questi saranno misurati dal controllo di qualità interna e dalla verifica esterna di qualità.

Traguardo di precisione analitica – Per capire se la differenza tra due misure nello stesso individuo è significativa mi devo assicurare che l’errore casuale massimo sia inferiore a metà del coefficiente di variabilità biologica intraindividuale. CVa< 0,5CVb(intra).

Traguardo di esattezza analitica – Utile quando si confrontano i dati del paziente con intervalli di riferimento, è necessario stabilire l’errore sistematico massimo accettabile (BIAS).

I traguardi analitici, come abbiamo detto, vengono verificati con il CQI (per l’imprecisione analitica) e VEQ (per l’inaccuratezza analitica).

Controllo di qualità interno

Si inseriscono uno o più campioni a titolo noto nella serie analitica giornaliera e si riportano i valori ottenuti su una carta di controllo (es carta di Levey-Jennings). Dopo almeno venti giorni consecutivi si calcola media e DS costruendo la carta di controllo potendo apprezzare la precisione giornaliera ed eventuali errori. Il metodo si può considerare fuori controllo ad esempio se si verificano 7 valori progressivamente crescenti o se c’è un valore al di fuori del limite di intervento. Si cerca a quel punto la causa dell’errore e la si elimina.

Per la verifica esterna di qualità l’ente di controllo invia i campioni a laboratori di riferimento, questi possono decidere di utilizzare i valori di consenso, ovvero i valori medi ottenuti da tutti i laboratori che partecipano al controllo di qualità. Su di questi costruirà i valori di riferimento. Si ottengono quindi una serie di sieri a concentrazione definita da inviare ai laboratori per il controllo qualità, per questi però il valore è ignoto, le misure che otterranno saranno di nuovo inviate all’ente che effettuerà una valutazione statistica (fondamentalmente permette di fare un confronto tra vari laboratori).

Alcuni test si raccomanda che vengano eseguiti solo in laboratori accreditati e certificati (da un ente terzo).

Caratteristiche diagnostiche e di ausilio decisionale

Sensibilità - probabilità di dare un risultato positivo se il soggetto è malato.

Specificità – probabilità di dare un risultato negativo se il soggetto è sano, quindi la capacità di identificare correttamente gli individui sani.

In una situazione reale, dove malati e sani sono parzialmente sovrapposti, aumentando la sensibilità diminuisce la specificità (es. aumento sensibilità = aumento falsi positivi). Il Cut-off permette di trasformare una variabile quantitativa continua in una dicotomica, malato/sano.

La Curva ROC (receiver operating characteristic) permette di valutare come cambiano sensibilità e specificità al cambiare del cut-off selezionato, a ogni punto della curva corrisponde un diverso cut-off. Ci permette quindi di definire il cut-off migliore che ci permetta di minimizzare gli errori diagnostici.

L’area sotto la curva corrisponde al potere diagnostico del test (AUC=1 è perfetta, se AUC=0,5 il test non è informativo), questo valore ci permette di confrontare diversi test. La pendenza della retta che va dall’origine al cut-off selezionato corrisponde al rapporto di verosimiglianza. Il miglior cut-off è quello in cui la tangente alla curva ha un coefficiente angolare di 1 (=45°).

In genere si preferisce scegliere un test più sensibile quando le conseguenze di una mancata diagnosi sono particolarmente gravi, è utile all’inizio del processo diagnostico per ridurre le possibilità (diagnosi differenziale), è ancora più utile quando il risultato è negativo. Vice versa, un test specifico fa comodo quando la prevalenza della malattia è alta e bisogna ridurre i falsi positivi, è di maggior aiuto quando il risultato è positivo.

Valore predittivo positivo è la probabilità che un individuo positivo al test sia malato.

Valore predittivo negativo è la probabilità che un individuo negativo al test sia sano.

VPP e VPN dipendono strettamente dalla prevalenza (totale malati/popolazione tot %) della malattia. Si utilizza il teorema di Bayes (vedersi formula).

Rapporto di verosimiglianza (Likelihood ratio) – Integra la positività del test e intensità del segnale esprimendo quante volte è più probabile osservare un determinato risultato in presenza di malattia rispetto alla probabilità di osservare lo stesso risultato in assenza di malattia. Il risultato sarà quindi sia quantitativo che qualitativo. Ha il vantaggio di non risentire della prevalenza della malattia, a differenza dei VP, essendo un rapporto tra sensibilità e specificità.

LR₊ va preso in considerazione se >2 ed è utile dal punto di vista clinico se >5. (sarebbe quante volte un test positivo è più probabile in un individuo malato).

Fase post-analitica

Riguarda la validazione dei risultati, l’analisi della loro coerenza e la presentazione dei risultati in maniera facilmente interpretabile.

Il referto – deve includere quattro parti: l’identificazione del campione, il tipo di esame eseguito e il suo risultato, i valori di riferimento e i vari riferimenti tecnici e metodologici. Per intervallo di riferimento (IR) intendiamo l’intervallo nel quale rientra il 95% dei valori di una grandezza biologica, determinato in una popolazione di riferimento con caratteristiche omogenee, questo misura la variabilità biologica di un parametro in presenza e in assenza di malattia. L’unico modo per interpretare i dati e quindi fare una refertazione è conoscere questi valori. (i valori fuori dall’intervallo si associano a una probabilità di presenza di malattia)

L’IR si calcola sui dati provenienti da un gruppo “campione di riferimento” selezionato da una “popolazione di riferimento”, questi mi daranno la “distribuzione di riferimento” sulla quale posso calcolare i limiti. La popolazione viene definita per sesso, età, stile di vita, ma devono essere anche definiti dei criteri di esclusione basati su fattori di rischio, malattie o farmaci assunti. È poi fondamentale che ci sia una grande standardizzazione delle fasi preanalitica e analiti.

Valori decisionali – sono determinati dall’esperienza clinica del medico e spesso grazie al consenso di esperti, servono per identificare una soglia di rischio.