Laboratorio di Microbiologia generale

Laboratorio di microbiologia generale

Regole generali per la sicurezza in laboratorio

Cominciamo a definire alcune regole generali in laboratorio per la sicurezza:

• Non portare mai nulla alla bocca (matite, pennelli), non mangiare, non bere e fumare in laboratorio.
• Non sedersi sui banconi, non appoggiarsi agli strumenti.
• Indossare sempre il camice, i guanti e gli occhiali protettivi quando si eseguono operazioni pericolose.
• Mantenere camici puliti e in buone condizioni.
• I capelli devono essere raccolti, per evitare contatti con superfici sporche o con la fiamma del bunsen.
• Non lasciare mai senza controllo le reazioni in corso o apparecchi in funzione.
• Non appoggiare recipienti o apparecchi sul bordo del bancone.
• Non portare in tasca forbici, oggetti taglienti e pericolosi.
• Il lavaggio delle mani deve essere effettuato durante e in particolare alla fine delle attività lavorative, dopo la manipolazione di materiale biologico.
• Le apparecchiature di laboratorio devono essere sistemate e ripulite in modo corretto dopo l'uso.
• Il laboratorio deve essere lasciato, al termine del lavoro, riordinato, pulito con la vetreria lavata (quotidianamente, prima sanificata con candeggina oppure in autoclave e poi rilavata, soprattutto se sono stati presenti microrganismi).

Manipolazione e sicurezza dei reagenti

Per quanto riguarda i reagenti, possono essere tossici. Le sostanze sono contrassegnate con un’etichetta di rischio. Se una sostanza è tossica deve essere manipolata sotto cappa con la mascherina, con l'uso di guanti e occorre lavare i recipienti in modo corretto.

Tecniche microbiologiche: tecniche di asetticità

Le tecniche di asetticità mirano a lavorare in condizioni di sterilità, manipolando sostanze e substrati in modo da non creare contaminazione in colture pure di microrganismi che si vanno ad ottenere.

Le finalità di queste tecniche di asetticità sono:

• Ottenere e mantenere pure le colture di microrganismi.
• Svolgere il lavoro in laboratorio di microbiologia con sicurezza.

Non bisogna contaminare il campione né contaminarsi con il campione. Una coltura pura è costituita da una sola specie di microrganismo (batteri o funghi). La contaminazione delle colture è a rischio poiché i microbi si trovano ovunque: sulla pelle, nell’aria, sulle superfici dei piani di lavoro. Pertanto, è fondamentale usare sempre terreni e attrezzi sterili, lavorare vicini alla fiamma del bunsen se non si possiede la cappa a flusso laminare, sollevare i coperchi delle piastre Petri solo parzialmente, mai aprire completamente la piastra (aprire e chiudere la piastra quando necessario), tenere sempre i tappi delle provette in mano, mai appoggiarle sul bancone. Flambare il collo delle superficie esterne delle provette prima e dopo il prelievo, arroventare le anse e gli aghi da inoculo alla fiamma per l’intera lunghezza dell’asta metallica, sia prima che dopo i prelievi.

Uso e manutenzione delle apparecchiature

La fiamma del bunsen in uso deve essere ossidante, blu alta circa 5 cm, quando il bunsen non si usa si deve lasciare la fiamma gialla, in modo da poterla vedere facilmente, sterilizzare la vetreria e il materiale monouso usati, dopo l'uso dentro apposite buste autoclavati o sanificare con la candeggina, disinfettare il bancone di lavoro accuratamente e sistemare tutto il materiale utilizzato in modo corretto e preparare per una successiva analisi.

Incubazione delle colture

È importante riconoscere una capsula Petri contenente un terreno di coltura. È importante che sulla base della piastra ci sia sempre scritto cosa contiene la piastra, il nome del microrganismo, la data in cui è stato fatto e in alcuni casi anche il nome dell’operatore, in modo da essere ricondotta sempre ad uno specifico lavoro. Quando le colture non devono essere più incubate, quindi quando vengono tolte dal termostato, devono essere sigillate con un nastro, con il parafilm che garantisce gli scambi gassosi, ma che previene la fuoriuscita di contaminazione dalla piastra e anche contaminazione verso la piastra stessa. E poi le piastre una volta preparate, vengono inserite dentro un termostato, che viene posizionato nella temperatura ottimale e quindi serve per incubare le piastre alla temperatura corretta il microrganismo che abbiamo in coltura.

Altre apparecchiature di laboratorio

Abbiamo poi la cappa a flusso laminare in funzione, queste sono cappe che servono per lavorare in sterilità. Abbiamo una stufa per sterilizzare a secco, un bagnetto termostatato che serve invece per gli arricchimenti, quindi per le incubazioni in agitazioni. Abbiamo poi una rampa filtrante, che serve per le analisi di acqua e di alcuni substrati. La stufa è un po’ differente da un termostato in quanto va a temperature superiori e non possiede la chiusura del vetro protettivo rispetto all’esterno. Il termostato può anche avere la possibilità di avere la luce per far crescere i cianobatteri. Al suo interno possiamo trovare un agitatore che serve per le colture in liquido. Questo termostato in video è impostato a 28 gradi in quanto è peculiare per l’isolamento dei batteri ambientali. Poi abbiamo frigoriferi tecnici e a norma.

Il microscopio è uno strumento capace di fornire l’immagine ingrandita di un piccolo oggetto osservato attraverso di esso, è composto da una parte meccanica, detto stativo e da una parte ottica. Bisogna accendere la luce, si pone il vetrino sul tavolino traslatore, si sistema il preparato verso l’alto. Si avvicina il tavolino all’obiettivo più piccolo (4x) mediante la vite macrometrica. Si mette a fuoco con la vite micrometrica, si regola l’intensità della luce e si sposta il preparato considerando l’osservazione da fare. Si può aumentare l’ingrandimento, si deve mettere l’olio che serve per la messa a fuoco per l’obiettivo con 100x. Per mettere l’olio si fa scattare il revolver su cui sono posizionati gli obiettivi, si aggiunge la goccia d’olio e si va a portare l’obiettivo a 100x e si aggiusta il fuoco. Non bisogna mai lasciare i vetrini sull’obiettivo, perché l’olio si va a seccare e va a rovinare gli obiettivi. Si deve togliere l’olio dall’obiettivo 100x utilizzando una carta imbevuta di alcol. Non bisogna forzare nessuna manopola e non bisogna far toccare gli obiettivi al vetrino.

Cappa a flusso laminare

La cappa è dotata di filtri HEPA che garantiscono un flusso d'aria sterile all’interno, per cui la cappa consente la protezione dell’operatore e dell’ambiente dal rischio di contaminazione con batteri e permette di lavorare in condizioni di sterilità. Il flusso continuo di aria sterile, all’interno della cabina, impedisce la fuoriuscita verso l’esterno, di microbi. La sterilizzazione viene realizzata facendo passare l’aria attraverso filtri HEPA. È opportuno accendere la cappa circa 25 minuti prima che si inizi a lavorare per assicurare una completa sterilità all’interno della stessa. Le cappe sono spesso munite di lampade UV che servono per sterilizzare le superfici della cappa stessa, che deve essere mantenuta pulita, igienizzata quotidianamente. Evitare di tenere ogni oggetto all’interno della cappa (fonte di contaminazione). La cappa deve essere chiusa in modo stagno con una paratia prima di azionare le lampade UV, dopo di ché si aziona la cappa, si pone in condizioni di stop (luce rossa), si impostano gli UV e si fanno partire. Il trattamento per la sterilizzazione interna dura circa 30 minuti. Dopo i quali si azionano gli UV all’interno della cappa così che gli operatori siano protetti dalle radiazioni mentre all’interno tutto si sterilizza. Al termine del ciclo si spengono le lampade e la cappa risulta sterile e pronta per il giorno successivo.

I termostati

I termostati sono dispositivi che servono appunto a incubare le piastre alla temperatura corretta, sono simili ma un po’ diversi dalle stufe, in quanto i termostati vanno a temperature inferiori (la temperatura massima a cui arriva un termostato è decisamente inferiore a quella a cui arriva una stufa), circa a 80 gradi (rispetto alle stufe che arrivano fino ai 200 gradi). Internamente ci sono ripiani forati che favoriscono la circolazione dell’aria, le colture batteriche dopo la semina vengono poste ad incubare nei termostati dove la temperatura può essere variabile in funzione al microrganismo da far crescere (i batteri ambientali vengono fatti crescere tra i 28-30 gradi, i patogeni umani o animali vengono incubati a 35-37 gradi e via via). Un altro apparecchio utilizzato è il bagnomaria o bagnetto termostatato, apparecchio che contiene acqua con un sistema di agitazione solitamente ed è in grado di mantenere una temperatura variabile tra i 25-90 gradi, dalla temperatura ambientale alla temperatura massima, non sono dotati di refrigerazione. Il sistema oscillante presente serve per mantenere in oscillazione le colture liquide, e serve quindi per adoperare misure di arricchimento. E quindi si usa per tenere in incubazione test sierologici oppure per far crescere microrganismi che hanno bisogno di umidità.

Altre apparecchiature

Poi abbiamo la bilancia tecnica che ha una sensibilità di 0.01 grammi e serve per pesare e serve alla preparazione di soluzioni, di tamponi o terreni di coltura. La stufa è invece un apparecchio di circolazione d’aria calda utilizzabile sia per asciugare che per sterilizzare la vetreria. La temperatura di esercizio è compresa tra i 50 e i 290 gradi circa. Per la sterilizzazione è necessario impostarla per 180 gradi per due ore. Abbiamo poi il pHmetro che invece consente di misurare i valori di pH delle soluzioni e serve quindi per tarare le soluzioni che andiamo a preparare. Solitamente i terreni di coltura sono pre-pHati e quindi se si opera in condizioni ottimali non è necessario analizzare il valore di pH, altri invece necessitano di misurazioni di pH.

Infine abbiamo il frigorifero certificato con un controllo della temperatura con memorizzazione del ciclo. La vetreria comprende i becher di varie dimensioni, i cilindri, le bottiglie (importanti per la sterilizzazione di buffer e terreni di coltura e soluzioni che vengono utilizzate in laboratorio) e poi le pipette per la misurazione dei liquidi (come i cilindri). Le centrifughe infine sono dispositivi importanti perché servono per separare le sospensioni, le soluzioni (e queste possono in alcuni casi centrifugare appendorf), in questo caso si tratta di una centrifuga refrigerata quindi consente di centrifugare anche la temperatura all’interno e di tarare la velocità con cui viene centrifugata la sospensione. Di fianco abbiamo un agitatore magnetico riscaldato che consente di miscelare i composti, poi abbiamo un pHmetro.

Autoclave

In ultimo parliamo dell’autoclave, uno strumento estremamente importante nel laboratorio di microbiologia. Abbiamo un’autoclave grande e meccanica in dotazione ad Alessandria. L’autoclave viene usata per sterilizzare terreni di coltura, soluzioni acquose e colture di rifiuto. Nel processo di sterilizzazione viene usato il vapore ad alta pressione, di solito 121 gradi. I microbi si eliminano meglio con il caldo umido che con quello secco della stufa perché il vapore denatura le proteine e induce la germinazione delle spore, per cui garantisce la sterilità anche di microrganismi sporigeni. Bisogna assicurarsi prima di tutto che ci sia acqua a sufficienza che copra la serpentina di rame in fondo, per non scaldare a secco. Il coperchio deve essere completamente chiuso per procedere con la sterilizzazione e prima di aprirlo occorre che l’autoclave al termine del periodo di sterilizzazione sia completamente raffreddata. Sulle autoclavi manuali possiamo avere alcuni errori. L’apertura precoce del coperchio può provocare ebollizione dei liquidi al suo interno e anche esplosione (come se aprissimo una pentola a pressione gigantesca). Esistono due fattori critici per la riuscita del processo (precauzioni d’uso dell’autoclave): tutta l’aria deve fuoriuscire dall’autoclave in modo tale che il vapore entri a contatto con le superfici di ciò che deve essere sterilizzato. In caso contrario la temperatura resterebbe più bassa. I materiali non devono essere sigillati, tappi e coperchi devono essere appena avvitati. In tal modo l’aria contenuta al loro interno può uscire liberamente. Il tempo deve essere sufficiente per permettere al vapore di penetrare nei contenitori. Quindi è importante tarare le impostazioni dell’autoclave in funzione a ciò che dobbiamo utilizzare. Di solito il ciclo standard è di 121 gradi per 25 minuti, oppure 120 gradi per 20 minuti per la vetreria.

L’autoclave in funzione alla sede di Vercelli è un’autoclave di medie dimensioni, con 3 cestelli che possono essere inseriti all’interno. L’autoclave una volta chiusa immagazzina l’acqua sul fondo, è a completa gestione elettronica con 4 impostazioni: liquid sterilization (con sterilizzazione dei terreni di coltura e dei buffer), la sterilization and keep warm (per sterilizzare e mantenere disciolti i terreni), poi abbiamo il melting and keep warm, per sciogliere i terreni una volta solidificati e mantenerli caldi ed infine la sterilizzazione della strumentazione (121 gradi per 25 minuti ma ad raffreddamento più veloce). Questa autoclave viene aperta solo se la temperatura interna scende a 60 gradi per prevenire quindi l’operatore da ustioni e rischi.

Terreni di coltura

I terreni di coltura possono essere utilizzati per mantenere e propagare i microrganismi in laboratorio. Possono essere liquidi e quindi essere chiamati brodi, oppure solidi e quindi contenere agar (polisaccaride contenente zolfo estratto da un’alga marina agar-agar, è un agente solidificante quindi non è un nutriente per i microrganismi 15g/l). I terreni possono essere classificati anche in terreni sintetici (composizione nota, con una sola fonte di C), mentre i terreni complessi contengono elementi di composizione non nota (idrolizzati proteici, caseina, peptoni, triptoni), come ad esempio il Trypticate Soy Agar e T. Soy Broth che sono considerati i terreni di base di uso generale in quanto favoriscono la crescita della maggior parte dei microrganismi coltivabili e vengono pertanto utilizzati nella maggior parte delle ricerche su microrganismi.

Abbiamo poi i terreni selettivi, addizionati di sostanze che ostacolano la crescita di alcuni gruppi microbici, favorendo quella di altri gruppi. Un esempio è quello di Agar SS (Salmonella-Shigella): in cui i Sali biliari inibiscono la crescita di molti coliformi. Il lattosio (fonte di C) può essere fermentato inducendo un viraggio di colore, formando colonie rosa-rosse o colonie incolore. Un altro terreno è il Mannitol Salt Agar (MSA) che contiene un’elevata concentrazione salina (7.5%) che inibisce la crescita di molti gruppi batterici (tranne gli Staphylococchi che sono alofili). Il mannitolo può essere fermentato inducendo viraggio del terreno da rosa a giallo e questo è il caso che si verifica su questo terreno lo S. aureus. L’agente, l’indicatore di pH in questo caso è il rosso-fenolo, mentre nel terreno del Salmonella-Shigella Agar era il rosso neutro.

Abbiamo poi dei terreni differenziali, in quanto vengono addizionati a sostanze che in crescita batterica consentono una distinzione metabolica del ceppo. E questo è il caso dell’Agar Eosina-Blu di Metilene in cui l’eosina inibisce i gram positivi, il lattosio può essere fermentato più o meno inducendo colonie scure con lucentezza metallica o meno, colonie scure opache, e quindi dando una diversificazione del metabolismo del microrganismo. Un altro terreno differenziale è l’Agar McConkey, terreno anche selettivo per i Gram negativo, molto utilizzato in Microbiologia diagnostica e clinica (selettivo per i gram negativi, viene utilizzato in concomitanza con terreni generici oppure con terreni selettivi per gram positivi per fare diagnosi di tipo clinico su alcuni patogeni). Ed è un terreno dove viene fatto crescere E. coli, questo terreno contiene Sali biliari e il cristal violetto che inibisce la crescita dei batteri gram positivi e di alcuni gram negativi esigenti. Il lattosio può essere fermentato provocando acidificazione del terreno e quindi producendo colonie rosse oppure colonie incolore quando i microrganismi non fermentano il lattosio.

Abbiamo poi terreni arricchiti che vengono addizionati con del siero o agenti che favoriscono la crescita di batteri esigenti (come per esempio l’Agar sangue). In questo terreno l’aggiunta del sangue favorisce al batterio dei fattori di crescita che sono fondamentali per lo sviluppo di batteri esigenti. Il microrganismo interagisce con le mazze presenti all’interno del sangue producendo un alone di emolisi. Questa emolisi può essere di tipo alfa, quando si ha un’emolisi di tipo parziale in cui si presenta un alone verdastro-marrone intorno alla colonia, un secondo tipo di emolisi è la beta-emolisi, un’emolisi completa intorno alla colonia e mostra la demolizione completa delle mazze presenti nel terreno, infine abbiamo la gamma emolisi in cui non abbiamo nessuna emolisi, nessun alone intorno alla colonia (caso di Streptococcus agalactiae).

Abbiamo poi dei terreni caratteristici che consentono di saggiare attività metaboliche di alcuni batteri, questo è il caso per esempio del Brodo all’urea per testare la presenza dell’enzima ureasi presenti ad esempio nel patogeno urinario Porteus. La demolizione dell’urea genera ammoniaca che causa basificazione del terreno e conseguente viraggio di colore verso il rosa-rosso. Un altro terreno caratteristico è l’Agar citrato che consente di selezionare gli enterobatteri. L’utilizzo del citrato e dell’ammonio diidrogeno fosfato porta al rilascio di ammoniaca che causa alcalinizzazione del mezzo e viraggio di colore verso il blu.

Un ultimo tipo di terreni di coltura sono i terreni cromogeni che consentono di discriminare specie diverse in base alla diversa colorazione della colonia indotta dal viraggio di colore di un mix di agenti cromogeni presenti.