Laboratorio di Microbiologia generale

Mannitol-Salt-Agar

I primi lavori di Gordon indicavano che la fermentazione di mannitolo potesse essere utilizzata come mezzo per identificare gli Staphylococchi patogeni da quelli non patogeni (inizio del '900). La fermentazione del mannitolo non è stata però usata abitualmente sebbene il suo lavoro sia stato ampliato da vari ricercatori. Wislow e collaboratori preferivano eseguire una serie di test più quantitativi sulla differenziazione degli Staphylococchi e conclusero che alcuni zuccheri, incluso il mannitolo, fossero infettati dagli Staphylococchi così raramente da non avere un serio valore diagnostico. Oltre alle difficoltà delle diagnosi, anche gli isolamenti degli Staphylococchi sono risultati problematici. I terreni solidi usati all'epoca non solo supportavano la crescita di Staphylococchi patogeni e non patogeni ma anche di altri microrganismi contaminanti. Pertanto i metodi di isolamento utilizzati di Staphylococchi patogeni da...

Campioni sospetti clinici hanno compartato una serie di test, di passaggi di isolamento tra cui: la determinazione di emolisi, test di coagulazione, produzione di pigmenti e test di agglutinazione.

G. Chupman e i suoi collaboratori hanno sviluppato una serie di terreni per l'isolamento di possibili ceppi di Staphylococchi patogeni tra gli anni '30-'40, questi mezzi includevano l'agar viola cristallino e l'agar lattosio blu di bromotimolo.

Durante questo periodo il laboratorio di Chupman iniziò ad esaminare la fermentazione del mannitolo e confermò il primissimo lavoro di Gordon. Il loro lavoro ha mostrato che una combinazione di agar-lattosio blu e mannitolo-rosso fenolo era molto affidabile per l'isolamento e la differenziazione di possibili Staphylococchi patogeni.

Alla fine nel 1942 Cock scoprì che la presenza di cloruro di sodio al 7,5% nel mezzo inibiva la crescita della maggior parte degli organismi tranne gli Staphylococchi.

Chupman ha utilizzato queste informazioni per modificare la formula del mannitolo-rosso fenolo in agar-sale-mannitolo utilizzato attualmente. Gli Staphylococchi possono resistere alla pressione osmotica creata dal cloruro di sodio al 7.5% mentre questa concentrazione inibisce la crescita della maggior parte degli altri batteri Gram-positivi e Gram-negativi. Inoltre il mannitolo-salt-agar contiene mannitolo e utilizza il rosso fenolo come indicatore di pH nel mezzo. A livelli di pH inferiori a 6.9 il mezzo è di colore giallo, quindi il terreno risulta giallo, negli intervalli di pH da 6.9 a 8.4 il colore è rosso, mentre sopra l'8.4 il colore del rosso fenolo è rosa. Quando il mannitolo viene fermentato da un batterio viene prodotto acido, che abbassa il pH e provoca la formazione di una zona gialla che circonda una colonia isolata su questo terreno. Un batterio non fermentante che resiste ad un'alta concentrazione di sale, mostra un'area da rosso a rosa.causa dell'utilizzo di peptone. Nei campioni clinici gli isolati positivi al mannitolo-salt-agar sono indicativi di Staphylococcus aureus e devono quindi essere testati ulteriormente. Qual è la formulazione di questo terreno? Estratto di carne, peptone (digerito proteico), sodio cloruro, mannitolo, rosso fenolo, agar e acqua distillata. Il terreno ha un pH aggiustato a 7.4 e poi viene autoclavato e distribuito nelle piastre Petri. Piastra di TSA (triptic soy agar) in cui nella zona A è piastrato uno S. aureus, nella zona B un S. epidermidis, e in zona C un E. coli. Si dimostra che tutti e tre su questo terreno possono crescere. Il TSA infatti è un mezzo generico sul quale crescono la totalità quasi dei microrganismi. Figura 2 terreno di mannitol-salt-agar con S. aureus, S. epidermidis e sempre E. coli. La colonia che fermenta mannitolo provoca la produzione di alone giallo (S. aureus), mentre la colonia non fermentante il mannitolo è rosa.

La crescita di E. coli viene inibita dalla presenza del sale.

Hektoen Enteric Agar. Terreno utilizzato in microbiologia clinica per mettere in evidenza la crescita di alcuni enterobatteri patogeni.

Durante il XIX secolo fu stabilita la connessione tra processi patogeni e batteri, da quel momento i microbiologi hanno cercato mezzi che consentono il rapido isolamento di microrganismi patogeni da campioni clinici nonché la differenziazione tra agenti patogeni e non patogeni.

All'inizio del XX i microbiologi si riferivano a tutti i bacilli, non formanti spore, come organismi enterici, a causa della loro prevalenza nel tratto intestinale, tuttavia hanno riconosciuto che alcune specie di questi microrganismi enterici erano più patogene per l'uomo rispetto ad altre.

I microbiologi hanno anche capito che questi microrganismi avevano modelli diversi di utilizzo dei carboidrati e che quelli enterici che non potevano utilizzare il lattosio erano molto probabilmente patogeni per l'uomo.

Hanno iniziato a sviluppare mezzi che portano appunto alla differenziazione della fermentazione e della non fermentazione del lattosio. Il primo mezzo di isolamento introdotto per il recupero di microrganismi enterici era l'agar- infusione di fucsian (solfato fucsinico), sviluppato da Endo nel 1903. Questo terreno ha permesso l'isolamento di microrganismi patogeni, ma non permette di inibire i normali microrganismi enterici non patogeni, presenti nelle feci. La discriminazione tra i microrganismi enterici che fermentano il lattosio e i microrganismi patogeni che di solito non fermentano il lattosio è difficile perché il colore rosso formato dalla fermentazione del lattosio che si verificava appunto sui terreni e non nelle colonie. Quando i microrganismi erano vicini tra loro sulla piastra di agar era difficile dire quali fermentavano lattosio e quali no. Nel 1905 l'agar-McConkey fu introdotto da A. McConkey e questo utilizzò il lavoro di Fermi sugli effetti di.varie sostanze chimiche sull'inibizione della crescita dei batteri. Ha aggiunto la bile sotto forma di tetracolato di sodio ai suoi terreni, la bile ha inibito infatti i microrganismi enterici non patogeni Gram positivi, permettendo la crescita di bastoncelli solo gram negativi. L'aggiunta di lattosio e del colorante rosso neutro ha permesso la differenziazione per colore per i microrganismi fermentanti il lattosio (non patogeni) e quelli che non fermentavano il lattosio, di solito patogeni. L'agar-eosina blu di metilene segue nel 1916 e fu introdotto da Arris e Tig e il mezzo EMB (eosina e blu di metilene) ha permesso la distinzione tra i vari bacillus coli (E.coli) e altri batteri enterici non patogeni e i bastoncelli enterici gram negativi come Salmonellae Shigella. Questi terreni hanno permesso il recupero e la distinzione di microrganismi sospetti appartenenti al genere Salmonella e Shigella spesso patogeni. I vantaggi nell'utilizzo del McConkey e

Nell'eosina-blu di metilene sull'agar-endo erano che il cambiamento di colore prodotto dalla fermentazione del lattosio appariva nella colonia stessa e non nel mezzo di coltura rendendo i patogeni facilmente distinguibili dai normali microrganismi enterici presenti nel campione. Il colore era presente nelle colonie piuttosto che nel terreno. I terreni McConkey e i terreni EMB sono solo limitatamente inibitori e la maggior parte dei bastoncelli gram-negativi enterici crescono su entrambi a volte oscurando i microrganismi patogeni. Pertanto occorrevano mezzi più selettivi per la visualizzazione dei generi Salmonella e Shigella dai campioni contaminati e quindi i microbiologi cercavano agenti inibitori che inibissero la crescita di microrganismi enterici non patogeni. Nel 1916 Clorman e Tig determinarono che il colorante verde brillante inibiva la maggior parte dei bastoncelli gram negativi enterici non patogeni migliorando il recupero delle Salmonelle da pazienti con febbre tifoide.

Leissondescrisse i terreni desossicolati nel 1935 in cui veniva utilizzato l'acido desossicolato e i suoi Sali come agenti inibitori. Nel 1941 Katrin Meifield e Gobert svilupparono Salmonella-Shigella agar, sfortunatamente questo terreno era eccessivamente selettivo, in quanto alcuni ceppi di Shigella non crescevano su questo. Recentemente Hectoen nel 1968 con HectoekEnteric agar è stato introdotto come terreno selettivo per la ricerca di Samonella e Shigella in campioni clinici. Il blu dibromo-fenolo e la fucsina acida presentano una tossicità inferiore rispetto ad altri coloranti pertanto si è riuscito a migliorare il recupero di questi patogeni. L'Hectoek Enteric Agar è attualmente utilizzato come mezzo di ricerca indiretta e diretta in campioni fecali di Shigella e Salmonella rispetto alla flora fecale presente. Sono tuttavia incorso modifiche per perfezionare questo terreno. L'Hectoein Enteric agar è appunto quindi utilizzato per

l'isolamento di agenti patogeni enterici come Shigella e Salmonella da campioni come cibo, acqua e campioni fecali. A causa della natura selettiva, questo terreno inibisce la maggior parte dei microrganismi non patogeni e quindi viene utilizzato in microbiologia clinica in coprocoltura (analisi fecali). È un mezzo differenziale che consente ai microbiologi di notare delle differenze visive nella morfologia delle colonie ed eliminare rapidamente i bastoncelli gram negativi non patogeni dai gram negativi di patogeni utilizzando test aggiuntivi. Quindi l'HEA è un terreno selettivo, differenziale per l'isolamento e la differenziazione di agenti enterici patogeni, i peptoni animali e l'estratto di rilievo (lievito) forniscono la base nutritiva, la presenza di Sali biliari e coloranti inibisce la maggior parte di microorganismi gram positivi, permettendo ai soli gram negativi di crescere sull'HEA, l'alta concentrazione di Sali biliari inibisce.

La maggior parte della flora coliforme non patogena del tratto intestinale e poiché Salmonella e Shigella possono tollerare queste condizioni, generalmente crescono più velocemente e con colonie più grandi rispetto ai coliformi. La fermentazione dei carboidrati come lattosio, saccarosio e salicina è una delle caratteristiche per identificare i coliformi, Salmonella e Shigella non sono in grado di utilizzare questi tre carboidrati specifici, mentre la maggior parte dei coliformi non patogeni può usare almeno uno di loro. Quindi i coliformi non patogeni se sono in grado di crescere in presenza di Sali biliari produrranno colonie giallo-arancio a causa della produzione di acido da almeno uno dei carboidrati. Questo acido provoca la variazione dell'indicatore blu di bromotimolo a causa del suo colore verde neutro ad un colore giallo-arancio. I Sali biliari possono precipitare fuori dal terreno e apparire come una zona nebulosa attorno alle colonie.

ciò è dovuto all'acido prodotto dall'utilizzo di lattosio, saccarosio e salicina che interagiscono con i Sali biliari presenti nel mezzo. Se un organismo non fermentante lattosio, saccarosio, utilizza salicina