La Traduzione

Traduzione da DNA a RNA

Catena di RNA e trascrizione

Catena di RNA prodotta dalla trascrizione

Trascritto: segmento trascritto di DNA

Unità di trascrizione

Differenze con la replicazione

- Il filamento di RNA non rimane legato con legami idrogeno al filamento stampo del DNA, ma, appena dietro la regione in cui i ribonucleotidi vengono aggiunti, la catena di RNA è spostata e l’elica di DNA si riforma. Le molecole di RNA vengono così rilasciate come singoli filamenti.

- Le molecole di RNA sono copiate da una regione limitata di DNA e sono dunque più brevi delle molecole di DNA stesse.

- Enzima che si occupa della traduzione: RNA polimerasi, che catalizza la formazione di un legame fosfodiestere tra i nucleotidi di una catena lineare. Questa si muove un passo alla volta lungo il DNA, svolgendo l’elica del DNA davanti al sito attivo di polimerizzazione per esporre una nuova regione del filamento stampo per l’accoppiamento complementare delle basi.

Come si può vedere, la catena di RNA in crescita è estesa di un nucleotide alla volta nella direzione 5’ 3’. I substrati sono nucleosidi trifosfati (ATP, GTP, UTP, CTP): un’idrolisi di legami ad alta energia fornisce l’energia necessaria per spingere in avanti la reazione.

- Molte copie di RNA possono essere prodotte dallo stesso gene in un tempo relativamente breve, in quanto il filamento di RNA dal DNA viene rilasciato quasi immediatamente durante la sua sintesi: la sintesi di altre molecole di RNA inizia prima che il primo RNA sia completato.

- La trascrizione non deve essere così accurata come la replicazione del DNA. RNA polimerasi compiono un errore ogni 10⁴ nucleotidi copiati in RNA, motivo per cui le RNA polimerasi possono iniziare un filamento senza bisogno di un primer. Esiste comunque un meccanismo di correzione: se un ribonucleotide non corretto viene aggiunto alla catena di RNA in crescita, la polimerasi può tornare indietro e il sito attivo dell’enzima può eseguire una reazione di escissione che assomiglia all’inverso della polimerizzazione (si usa acqua invece di pirofosfato).

Differenze tra RNA-polimerasi e DNA-polimerasi

• RNA polimerasi catalizza la reazione di ribonucleotidi e non deossiribonucleotidi.
• Le RNA polimerasi possono dare inizio a una catena di RNA senza un primer.
• Commette un errore ogni 10⁴ basi (invece di uno ogni 10⁷).
• Completa la trascrizione tutta in un colpo, senza dissociarsi.

La maggior parte dei geni nel DNA di una cellula specifica la sequenza di amminoacidi delle proteine: molecole di RNA copiate da questi geni sono chiamate mRNA (RNA messaggero). Il prodotto finale di una minoranza di geni è comunque l’RNA stesso. Questi RNA servono da componenti enzimatici e strutturali per alcuni processi cellulari.

• Piccoli RNA nucleari (snRNA) dirigono lo splicing del pre-mRNA per formare mRNA.
• RNA ribosomiale (rRNA) forma il nucleo dei ribosomi e catalizza la sintesi proteica.
• RNA transfer (tRNA) formano gli adattatori che scelgono gli amminoacidi e li tengono in posizione su un ribosoma per incorporarli sulle proteine.
• MicroRNA (miRNA) e piccoli RNA interferenti (siRNA) servono da regolatori chiave dell’espressione genica degli eucarioti.

Come la RNA polimerasi riconosce dove iniziare a copiare

Nei batteri: L'inizio della trascrizione è un passaggio importante nell'espressione genica perché è il punto principale in cui la cellula regola quali proteine debbano essere prodotte e a che ritmo. RNA polimerasi è formata da un nucleo multisubunità che sintetizza RNA utilizzando uno stampo di DNA. Una subunità che si può staccare, il fattore σ, si associa al nucleo dell'enzima e lo assiste nella lettura dei segnali nel DNA che indicano dove iniziare a trascrivere.

Il processo di inizio della trascrizione è complesso e richiede che la RNA polimerasi oloenzima e il DNA subiscano una serie di cambiamenti di conformazione. Questi possono essere considerati come un restringimento successivo dell'enzima intorno al DNA e all'RNA per assicurare che non si dissoci prima di avere finito di trascrivere un gene.

Quando la polimerasi scivola in una regione del DNA chiamata promotore, una sequenza speciale di nucleotidi che indica il punto di partenza per la sintesi di RNA, σ vi si lega con forza. La polimerasi, usando il suo fattore σ, riconosce questa sequenza di DNA prendendo contatti specifici con le porzioni delle basi che sono esposte all'esterno dell'elica.

Dopo che l'RNA polimerasi si è legata con forza al promotore, apre la doppia elica per esporre un breve tratto di nucleotidi su ciascun filamento. Questa apertura limitata dell'elica non richiede energia di idrolisi dell'ATP, a differenza della DNA elicasi.

Uno dei due filamenti esposti di DNA agisce da stampo per formare coppie di basi complementari con i ribonucleotidi in arrivo, due dei quali sono uniti insieme dalla polimerasi per iniziare una catena di RNA.

Dopo che sono stati sintetizzati i primi 10 nucleotidi circa, il nucleo dell'enzima rompe le sue interazioni con il DNA del promotore, indebolisce le sue interazioni con il fattore σ e inizia a muoversi lungo il DNA, sintetizzando RNA.

La trascrizione è altamente processiva: la polimerasi lascia lo stampo di DNA e rilascia l'RNA appena trascritto solo quando incontra un segnale di termine, terminatore. Per la maggior parte dei geni batterici un segnale di termine consiste in una fila di coppie di nucleotidi A-T preceduta da una sequenza simmetrica di DNA che, quando trascritta in RNA, si ripiega in una struttura "a forcina". La forcina può aiutare a estrarre il trascritto di RNA dal sito attivo.

Dopo che il nucleo della polimerasi è stato rilasciato al terminatore, si riassocia con un fattore σ libero e forma un oloenzima che può cominciare di nuovo il processo di trascrizione.

L'ibrido DNA-RNA nel sito attivo, che a livello dei terminatori è tenuto insieme da coppie di basi U-A, non è sufficientemente forte da tenere in posizione l'RNA e si dissocia provocando il rilascio del DNA dalla polimerasi.

I promotori hanno un alto grado di variabilità; nonostante ciò, contengono tutti delle sequenze correlate. Queste caratteristiche comuni sono spesso riassunte sotto forma di una sequenza consenso. Una sequenza consenso nucleotidica viene ricavata confrontando molte sequenze con la stessa funzione di base e scegliendo il nucleotide più comune presente in ciascuna posizione. Le sequenze del DNA dei singoli promotori differiscono in un modo che ne determina la forza. I promotori per geni che codificano proteine abbondanti sono molto più forti di quelli associati con geni che codificano proteine rare e le loro sequenze nucleotidiche sono responsabili di queste differenze.

Il filamento di DNA che serve da stampo deve essere percorso in una direzione 3’ 5’. La direzione del movimento delle RNA polimerasi determina quale dei due filamenti di DNA deve servire da stampo per la sintesi di RNA (la direzione della polimerasi è determinata dall’orientamento della sequenza del promotore).

Anche i terminatori della trascrizione comprendono una vasta gamma di sequenze, la cui caratteristica comune più importante è quella di avere il potenziale di formare una semplice struttura a forcina di RNA. Dal momento che un numero quasi illimitato di sequenze nucleotidiche ha questo potenziale, le sequenze terminatrici sono ancora più eterogenee dei promotori. Sono tipicamente lunghe sequenze di A e T che si ripiegano a formare un hairpin. Questi hairpin destabilizzano il legame dell’RNA nascente con la polimerasi e ne determinano il distacco.

Negli eucarioti

I nuclei eucaristici hanno tre tipi di RNA polimerasi: RNA polimerasi I, RNA polimerasi II, RNA polimerasi III. Queste sono strutturalmente simili ma trascrivono diversi tipi di geni:

• RNA polimerasi I e III trascrivono RNA transfer, RNA ribosomale e vari piccoli RNA.
• RNA polimerasi II trascrive la grande maggioranza dei geni, tra cui quelli che codificano proteine.

Differenze tra RNA polimerasi batterica e eucariotica (II):

• RNA polimerasi batterica richiede solo una singola proteina addizionale (fattore σ), mentre le RNA polimerasi eucariotiche richiedono molte altre proteine, fattori generali di trascrizione (ma anche fattori specifici di trascrizione e fattori di allungamento).
• L'inizio della trascrizione eucariotica deve tener conto del compattamento del DNA nei nucleosomi e in forme di ordine superiore di cromatina.

RNA polimerasi II: Fattori generali di trascrizione

Necessari per (quasi) tutti i promotori:

• Aiutano il corretto posizionamento dell’RNA polimerasi II sul promotore.
• Favoriscono l’apertura del DNA.
• Consentono il rilascio dell’RNA polimerasi II dal promotore, dando inizio alla trascrizione.

I fattori generali di trascrizione aiutano a posizionare la RNA polimerasi correttamente sul promotore, a separare i due filamenti di DNA per permettere l’inizio della trascrizione e rilasciano l’RNA polimerasi dal promotore nella modalità di allungamento una volta che la trascrizione è cominciata.

Le proteine sono “generali” perché si assemblano su tutti i promotori usati dalla RNA polimerasi II; sono generalmente designati come TFII ed elencati come TFIID, TFIIB, etc.

Il processo di assemblaggio inizia con l’attacco del fattore generale di trascrizione TFIID ad una breve sequenza di DNA a doppia elica (promotore) composta soprattutto da nucleotidi T e A, posta a 25 nucleotidi di distanza dal sito in cui inizia la trascrizione. Per questo motivo la sequenza è nota come TATA box (è la sequenza più importante che segnala l’inizio trascrizione ma non l’unica) e la subunità di TFIID che la riconosce si chiama TBP (TATA-binding protein). Il legame tra TATA box e TFIID rende possibile l’attacco adiacente di TFIIB. Il legame della TBP alla TATA box piega il DNA e contrassegna un promotore attivo. Il resto dei fattori generali di trascrizione si assemblano sul promotore. Il TFIIH usa ATP per aprire la doppia elica di DNA al punto di inizio della trascrizione, esponendo il filamento stampo. TFIIH fosforila RNA polimerasi II cambiandone la conformazione così che la polimerasi viene rilasciata dai fattori generali e può iniziare la fase di allungamento della trascrizione. Il sito di fosforilazione è una lunga coda polipeptidica C-terminale, chiamata dominio C-terminale (CTD) che si estende dalla molecola di polimerasi. Negli esseri umani il CTD consiste di 52 ripetizioni in tandem di una sequenza di sette amminoacidi, che si estendono dalla struttura centrale della polimerasi.

TFIIH è il fattore più complicato: ha nove subunità ed è grande quasi quanto la RNA polimerasi stessa. Permette il passaggio al punto di inizio della trascrizione idrolizzando ATP, dopo che si è formato un complesso di inizio della trascrizione sul DNA del promotore; esso infatti contiene una DNA elicasi come una delle sue subunità.

Inoltre, durante l’inizio della trascrizione la serina posta nella quinta posizione della sequenza ripetuta (Ser5 del CTD) è fosforilata da TFIIH, che contiene una proteina chinasi in un’altra delle sue subunità.

In vivo, sono necessari ulteriori fattori di trascrizione:

• Proteine attivatrici, proteine regolatrici che si legano a sequenze specifiche nel DNA e aiutano ad attrarre la RNA polimerasi II al punto di inizio della trascrizione. Sono i più importanti regolatori dell’espressione genica.
• Proteine di modificazione della cromatina (complessi di rimodellamento della cromatina ed enzimi modificatori degli istoni).
• Proteine mediatrici, complesso proteico noto come mediatore che permette alle proteine attivatrici di comunicare in modo appropriato con la RNA polimerasi II e con i fattori generali di trascrizione.
• Fattori di allungamento, evitano che la RNA polimerasi scivoli via dal DNA. Alcuni fattori di allungamento facilitano la trascrizione attraverso i nucleosomi senza richiedere ulteriore energia (ad esempio spostando dimeri H2A-H2B dal nucleo dei nucleosomi per poi riposizionarli quando la polimerasi si sposta ancora).

L’attivatore si lega all’enhancer (sito di attacco per la proteina attivatrice) e fa partire la trascrizione, aiutando RNA polimerasi II, mediatore e fattori generali ad assemblarsi sul promotore. Inoltre, gli attivatori attraggono complessi di rimodellamento della cromatina dipendenti da ATP e istoni acetilasi. Per iniziare a trascrivere, la RNA polimerasi II deve essere rilasciata da questo grande complesso di proteine e ciò spesso richiede la proteolisi (processo di degradazione) della proteina attivatrice.

Maturazione del pre-mRNA

Procarioti

Nei procarioti la produzione di molecole di mRNA è molto più semplice. L’estremità 5’ di una molecola di mRNA viene prodotta dall’inizio della trascrizione da parte della RNA polimerasi e l’estremità 3’ viene prodotta dal termine della trascrizione. Queste estremità non vengono modificate dalla RNA polimerasi, che inizia e termina la trascrizione in quei punti, poiché le cellule procariotiche sono prive di nucleo, la trascrizione e la traduzione avvengono in un compartimento comune. In effetti, la traduzione di un mRNA batterico spesso inizia prima che la sua sintesi sia completata.

Eucarioti

La trascrizione è soltanto il primo passaggio di una serie di reazioni che comprende la modifica covalente di entrambe le estremità e la rimozione di sequenze introniche che sono scartate dalla parte mediana del trascritto di RNA dal processo di splicing dell’RNA. La molecola di RNA prodotta dalla sola trascrizione (talvolta chiamata trascritto primario) contiene infatti sia sequenze codificanti (esoni) che sequenze non codificanti (introni).

Entrambe le estremità degli mRNA eucaristici sono modificate:

• Aggiunta di un cappuccio all’estremità 5’.
• Poliadenilazione all’estremità 3’.

Queste estremità “speciali” permettono alla cellula di stabilire se sono presenti entrambe le estremità di una molecola di RNA e quindi se il messaggio è intatto, prima di esportare l’RNA dal nucleo per tradurlo in proteina. Una differenza tra mRNA batterici ed eucaristici è il fatto che gli mRNA batterici possono contenere le istruzioni per parecchie proteine diverse, mentre gli mRNA eucaristici quasi sempre contengono l’informazione per una singola proteina.

Funzioni dello splicing

• Unisce le diverse porzioni di una sequenza che codifica una proteina.
• Fornisce la capacità di sintetizzare parecchie proteine diverse dallo stesso gene.

Questi passaggi di modificazione dell’RNA sono accoppiati all’allungamento della trascrizione: il processo di fosforilazione di CTD procede gradualmente man mano che la RNA polimerasi II inizia la trascrizione e si muove lungo il DNA. Oltre a dissociare la RNA polimerasi da alcune proteine (attivatrici, mediatore, fattori generali) permette anche ad una nuova serie di proteine che funzionano nell’allungamento della trascrizione e nella modifica del pre-mRNA di associarsi con la coda della DNA polimerasi. Alcune di queste proteine sembrano “saltare” dalla coda della polimerasi sulla molecola nascente di RNA per iniziare a modificarla mentre emerge dalla DNA polimerasi.

Capping

1. Non appena la RNA polimerasi II ha prodotto circa 25 nucleotidi di RNA, l’estremità 5’ della nuova molecola di RNA è modificata per aggiunta di un “cappuccio” che consiste di un nucleotide guaninico modificato.
2. La reazione di aggiunta del cappuccio è svolta da 3 enzimi che agiscono in successione:
   • Una fosfatasi rimuove un fosfato dall’estremità 5’ dell’RNA nascente.
   • Una guanil trasferasi aggiunge un GMP in legame inverso (5’ a 5’ invece di 5’ a 3’).
   • Una metil trasferasi aggiunge un gruppo metilico alla guanosina.

Tutti e tre gli enzimi si attaccano alla coda fosforilata della RNA polimerasi a livello della Ser5 e sono quindi in posizione per modificare l’estremità 5’ del trascritto nascente appena emerge dalla RNA polimerasi. Questo cappuccio aiuta la cellula a distinguere l’mRNA dagli altri tipi di RNA presenti nelle cellule (ad es. RNA polimerasi I e III producono RNA privi di cappuccio). Nel nucleo il cappuccio si lega ad un complesso proteico chiamato CBC (cap-binding complex) che aiuta l’mRNA ad essere modificato ed esportato correttamente. Il cappuccio 5’-metile ha anche un ruolo importante nella traduzione degli mRNA nel citosol.

Splicing

I geni eucaristici sono composti sia da sequenze codificanti (esoni) che da sequenze non codificanti (introni). Entrambi sono trascritti in RNA. Le sequenze introniche sono rimosse dall’RNA appena sintetizzato dal processo di splicing dell’RNA. Ciascun evento di splicing dell’RNA rimuove un introne, procedendo attraverso due reazioni sequenziali di trasferimento di fosfato note come transesterificazione: queste uniscono due esoni rimuovendo l’introne come un “cappio”.

Il macchinario che catalizza lo splicing è complesso e consiste di 5 molecole addizionali di RNA e più di 200 proteine, e idrolizza molte molecole di ATP per evento di splicing. Questa complessità è necessaria probabilmente per assicurare un’elevata accuratezza del processo. Inoltre, la disposizione introne-esone sembra facilitare la comparsa di nuove proteine utili durante l’evoluzione.