La replicazione del DNA

Replicazione del DNA

Ora cominceremo i processi inerenti alla biologia molecolare: replicazione, traduzione, trascrizione. Durante lo studio dei processi molecolari, metteremo sempre a confronto i meccanismi molecolari nella cellula procariotica, con quelli della cellula eucariotica. Mettendo a confronto, ci renderemo conto di come i meccanismi fondamentali che regolano questi processi biologici rimangano invariati tra eucarioti e procarioti. Ciò che cambia tra le due tipologie cellulari è che negli eucarioti questi processi sono più controllati.

Dogma centrale della biologia cellulare

Quando abbiamo affrontato gli acidi nucleici come macromolecola, abbiamo accennato al dibattito che, dagli inizi del 900 fino alla scoperta della doppia elica di DNA ad opera di Watson e Crick, separava la comunità scientifica. Gli esperimenti di Mendel avevano dimostrato che i caratteri venivano tramandati da una cellula madre alle due cellule figlie. Mendel, che ancora non conosceva l'esistenza del DNA, parlava di caratteri ereditari. Restava da capire cosa fossero (da un punto di vista molecolare) questi caratteri ereditari.

Il dibattito sul materiale genetico (ovvero il materiale che da una cellula madre era in grado di duplicarsi ed essere trasmesso alle due cellule figlie) vedeva due fazioni contrapposte:

• Chi affermava che il materiale genetico era costituito dalle proteine;
• Chi affermava che il materiale genetico era costituito dal DNA.

Andremo ora a ripercorrere i diversi esperimenti che hanno affermato il DNA come materiale genetico della cellula. I primi esperimenti sulla natura chimica del materiale genetico furono condotti da Griffith.

Dogma centrale della biologia: esperimenti di Griffith

L'esperimento di Frederick Griffith del 1928 fu uno dei primi esperimenti a suggerire che i batteri sono in grado trasferire informazioni genetiche attraverso un processo noto come trasformazione. In tal modo, esso aprì la strada alla determinazione di quale fosse la natura del materiale genetico.

L'ufficiale medico inglese F. Griffith in quegli anni studiava un batterio in grado di causare la polmonite: il pneumococco (Streptococcus pneumoniae). Nei suoi esperimenti fece uso di due ceppi batterici:

• Il ceppo S, detto anche liscio dal momento che produce colonie lisce e lucenti (grazie alla presenza di una capsula batterica polisaccaridica che avvolgeva ogni cellula). Questo ceppo è in grado di provocare la polmonite.
• Il ceppo R, detto anche rugoso dal momento che produce colonie dall'aspetto "rugoso" (a causa dell'assenza della capsula batterica). Questo ceppo non è in grado di provocare polmonite.

Esperimento di Griffith: schema dell'esperimento

Quando Griffith iniettò batteri R (ceppo IIR) in un topo, verificò che la cavia non si ammalava e non era possibile isolare questi batteri dai tessuti dell'animale.

• Quando il medico iniettò batteri S (ceppo IIIS) in un topo, verificò che l'animale si ammalava, moriva ed era possibile isolare questi batteri dai tessuti dello stesso.
• Successivamente prese alcuni batteri IIIS e li uccise in seguito a shock termico. Iniettò poi questi batteri morti in un topo e, come c'era d'aspettarsi, il topo non si ammalò e non fu possibile isolare IIIS dai tessuti dell'animale. Da ciò si deduce che, per provocare la malattia, è necessaria la presenza della capsula e i batteri capsulati devono essere ovviamente vivi.
• A questo punto Griffith preparò una miscela in cui erano presenti batteri vivi IIR e batteri morti IIIS (uccisi col calore). Iniettò questa miscela in un topo: quello che ci si aspettava era la NON comparsa di malattia nell'animale (dal momento che non sarebbero dovute sussistere le condizioni appena citate). In realtà il topo si ammalò e morì; nei suoi tessuti si riscontrarono batteri IIIS vivi.

Esperimento di Griffith: conclusioni

Griffith propose l'unica spiegazione plausibile: alcuni batteri IIR, in seguito all'interazione con batteri morti IIIS, si erano trasformati in IIIS. Evidentemente, all'interno dei IIIS morti, doveva essere presente una qualche sostanza in grado di conferire ai batteri IIR che l'acquisivano la capacità di sintetizzare la capsula polisaccaridica. Questa sostanza è il materiale genetico. Griffith chiamò il materiale genetico principio trasformante. Erroneamente, come però la stragrande maggioranza degli scienziati suoi contemporanei, riteneva che questa sostanza dovesse essere di natura proteica.

A partire da questo importantissimo esperimento, Avery, MacLeod e McCarty nel 1943 dimostrarono che il materiale genetico in questione era il DNA (anche se la prova definitiva arrivò solo dagli esperimenti di Hershey e Chase del 1953).

Dogma centrale della biologia: esperimenti di Avery, MacLeod e McCarty

Venti anni dopo gli esperimenti di Griffith, Avery, MacLeod e McCarty nel 1943 dimostrarono che il materiale genetico in questione era il DNA. Questo esperimento fu terribilmente contrastato dalla comunità scientifica di quel periodo.

Nel suo esperimento, Avery cercò di capire quale componente molecolare fosse responsabile della trasformazione dei ceppi IIR (non virulenti, quindi non letali) in ceppi IIIS (virulenti e letali).

Esperimento di Avery: schema dell’esperimento

Avery si procurò una coltura di pneumococchi di tipo S. A questo punto lisò le cellule (cioè ne ruppe la parete e la membrana cellulare) in modo da ottenere una soluzione nella quale era disciolto il materiale contenuto nei batteri, il cosiddetto estratto cellulare o lisato cellulare. Il materiale genetico doveva presumibilmente essere uno dei diversi tipi di macromolecole biologiche presenti nei batteri: (proteine, polisaccaridi, acidi nucleici – ovvero DNA e RNA – e lipidi).

Avery e colleghi riuscirono a separare l'estratto cellulare nelle varie componenti macromolecolari appena citate. Successivamente cercarono di capire quali di queste sostanze erano effettivamente in grado di trasformare batteri R avirulenti in batteri S virulenti. Le cavie sopravvivevano quando trattate con tutte le biomolecole tranne gli acidi nucleici: il materiale genetico doveva essere quindi DNA e/o RNA.

Per capire quale delle due sostanze fosse, divisero l'estratto contenente l'acido nucleico in due aliquote: una venne trattata con l'enzima ribonucleasi (RNasi) che degrada selettivamente l'RNA e non il DNA, l'altra venne invece trattata con deossiribonucleasi (DNasi) che degrada selettivamente il DNA e non l'RNA. Ciò che si osservò era la trasformazione dei batteri R in batteri S solo in seguito all'aggiunta dell'aliquota trattata con RNasi. Il materiale genetico doveva allora essere necessariamente il DNA.

Esperimento di Avery: critiche all’esperimento

Il sopracitato esperimento non convinse tutti gli scienziati dell'epoca. Vi era infatti in quel periodo la convinzione diffusa (tra l'altro insita nello stesso Griffith) che il materiale genetico dovesse essere di natura proteica.

Sia il DNA che le proteine sono dei polimeri. Nel caso delle proteine, i monomeri (le unità base che ripetute danno il polimero) sono i 20 amminoacidi. Nel caso del DNA, i monomeri sono solamente i 4 deossiribonucleotidi. Dal momento che l'informazione genetica doveva essere contenuta in queste macromolecole lineari, e considerata la grande differenza genetica tra le varie specie, pareva più sensato che il materiale genetico fosse di natura proteica: in questo modo, rispetto agli acidi nucleici, sarebbero state possibili molte più combinazioni tra i vari monomeri e di conseguenza l'informazione contenuta dalla macromolecola sarebbe stata maggiore (questo lo avevamo già spiegato nel capitolo degli acidi nucleici).

Sotto la spinta di queste convinzioni, quello che veniva criticato ad Avery era la non completa purezza degli acidi nucleici utilizzati nell'esperimento: all'interno delle soluzioni contenenti DNA e RNA si ipotizzava fossero presenti anche tracce di proteine, le stesse proteine che gli scienziati scettici pensavano costituissero il materiale genetico. In questo senso, pur non tralasciando l'importanza dell'evidenza sperimentale, non si può dire che l'esperimento di Avery, MacLeod e McCarty fosse la prova definitiva. Solo una decina di anni più tardi (1953) Hershey e Chase dimostrarono che il materiale genetico è costituito da DNA.

Dogma centrale della biologia: esperimento di Hershey e Chase

L'esperimento di Alfred D. Hershey e Martha Chase provò definitivamente nel 1953 che il materiale genetico è costituito da DNA e non da proteine. In seguito a questi risultati incontrovertibili, anche gli scienziati che avevano criticato l'esperimento di Avery, MacLeod e McCarty si convinsero dell'importantissimo ruolo biologico del DNA.

Esperimento di Hershey e Chase: schema dell’esperimento

Hershey e Chase svolgevano studi su un fago, ovvero un virus in grado di infettare i batteri; in particolare, il fago di loro interesse era noto come "T2". Questo virus è in grado di attaccare Escherichia coli (un batterio utilizzato spesso come modello in questo genere di studi). All'epoca era noto che T2 era formato esclusivamente da DNA protetto da un involucro proteico.

I due scienziati prepararono in parallelo due colture di E. coli:

• Nel terreno di coltura della prima introdussero fosforo marcato radioattivamente (l'isotopo ³²P).
• Nel terreno di coltura della seconda introdussero zolfo marcato radioattivamente (l'isotopo ³⁵S).

I batteri delle due colture metabolizzarono da una parte il fosforo marcato e dall'altra lo zolfo marcato, introducendo questi atomi radioattivi nelle biomolecole presenti all'interno delle cellule. In particolare:

• Il fosforo marcato si troverà nei nucleotidi e di conseguenza anche negli acidi nucleici; non sarà presente invece in quantità significative nelle proteine.
• Lo zolfo marcato si troverà nelle proteine (in particolare nell'amminoacido cisteina) e non si troverà nei nucleotidi.

A questo punto, i ricercatori infettarono parallelamente le due colture batteriche con il fago T2. Questo virus utilizza l'apparato biosintetico delle cellule di E. coli per replicare il proprio DNA e per sintetizzare le proteine del rivestimento e quindi per costruire virus completi che causeranno poi la lisi (rottura) della cellula batterica parassitata. Dal momento che i nucleotidi e gli amminoacidi utilizzati nella sintesi del DNA e delle proteine virali sono quelli presenti all'interno della cellula batterica infettata (cresciuta nutrendosi degli isotopi radioattivi), ne risulta che i fagi sviluppati dall'infezione nella prima coltura avranno un DNA marcato radioattivamente, mentre quelli sviluppati dall'infezione della seconda coltura avranno il rivestimento proteico esterno marcato radioattivamente.

Hershey e Chase separarono i fagi neoformati (quelli marcati) dai due terreni di coltura e, separatamente, li utilizzarono per infettare altre due colture di E. coli, in questo caso cresciute su...