La replicazione del DNA

SINTESI È DATA DALLA DIREZIONE DELL’ELICASI;

- RICORDA CHE, PER CONVENZIONE, LEGGIAMO I FILAMENTI DÌ DNA

DALL’ESTREMITÀ 5’ ALL’ESTREMITÀ 3 23

Il filamento superiore, antiparallelo alla direzione di replicazione, presenta un filamento di nuova

formazione avente orientamento 5’3’ (leggendo il filamento secondo la direzione di duplicazione,

cioè da sinistra verso destra).

Il filamenti inferiore, parallelo alla direzione di replicazione, presenta un filamento di nuova sintesi

avente orientamento 3’5’ (leggendo il filamento secondo la direzione di duplicazione, cioè da

sinistra verso destra).

Ricorda che la direzione di sintesi è data dalla direzione di aperture dell’ELICASI NELLA

FORCELLA.

Abbiamo più volte detto che la DNA POLIMERASI, ha una direzione di sintesi 5’3’ sul filamento di

nuova formazione; osservando l’orientamento dei nuovi filamenti, possiamo notare che:

- Mentre uno rispetta l’andamento di sintesi della DNA POLIMERASI (neo filamento 5’3’);

- L’altro filamento, invece, non si muove secondo la direzione di sintesi della DNA

POLIMERASI (neo filamento 3’-5’).

Capiamo quindi che la sintesi dei due nuovi filamenti non può essere compiuta allo stesso modo

(in quanto uno concorde alla direzione di sintesi della DNA POLIMERASI, mentre l’altro NO).

Distinguiamo i due filamenti stampo (o filamenti Parentali) in:

- FILAMENTO STAMPO IN ANTICIPO: si tratta del filamento stampo avente orientamento

3’5’ secondo la direzione di sintesi (nell’immagine da noi esaminata è il filamento

superiore). Questo FILAMENTO STAMPO, presenta un filamento si nuova formazione con

direzione 5’3’. Capiamo quindi che il filamento di nuova formazione SEGUE LA

DIREZIONE DÌ SINTESI DELLA DNA POLIMERASI. In questo stampo, la sintesi del nuovo

filamento avviene in maniera CONTINUA.

Questo filamento di DNA, presenta UN SOLO PRIMER, che si lega al DNA al fine di

PERMETTERE alla DNA POLIMERASI di cominciare a lavorare (NON CI SONO ALTRI

PRIMER DOPO QUESTO). 24

- FILAMENTO IN RITARDO: si tratta del filamento stampo avente orientamento 5’3’

secondo la direzione di sintesi (nell’immagine da noi esaminata è il filamento inferiore).

Questo filamento NON PUÒ REPLICARSI IN DIREZIONE DÌ APERTURA DELLA

FORCINA, il quanto il suo filamento di nuova sintesi presenta un orientamento 3’5’.

Questo filamento NON HA SINTESI CONTINUA, ma deve aspettare che vengano esposte

nuove basi azotate sufficienti per effettuare la replicazione.

Quando il DNA viene aperto, esponendo un numero di basi sufficienti per la replicazione,

l’RNA SINTETASI (o PRIMASI), sintetizza un INNESCO (o PRIMER) che va a collocarsi sul

filamento in ritardo, permettendo alla DNA POLIMERASI di sintetizzare in direzione 5’3’.

Diversi PRIMER di vanno ad impiantare sul filamento stampo in ritardo (ogni nuovo

INNESCO viene impiantato quando un sufficiente numero di basi azotate vengono esposte

con l’apertura del’elica) e la DNA SINTETASI polimerizza FRAMMENTI DÌ DNA CHE

VANNO DA UN PRIMER ALL’ALTRO.

Questi brevi frammenti di DNA, prenono il nome di FRAMMENTI DI OKAZAKI. 25

NOTA BENE:

- La professoressa ha identificato un FRAMMENTI DI OKAZAKI come l’unione di

PRIMER + DNA.

Il FILAMENTO IN RITARDO presenta più di un PRIMER, in quanto ad ogni apertura di elica

deve essere impiantato un nuovo innesco al fine di potere sintetizzare un nuovo frammento

di DNA.

ATTENTO A NON SBAGLIARE:

- Se si osserva una forcella, si può parlare di FILAMENTO IN ANTICIPO e

FILAMENTO IN RITARDO;

- Se si osserva l’intero filamento, non si può parlare di FILAMENTO IN ANTICIPO e

FILAMENTO IN RITARDO poiché all’interno della polla di replicazione, ogni

filamento è per metà in ANTICIPO e per metà in RITARDO.

Per questo motivo si dice che la duplicazione è SEMI-DISCONTINUA, in quanto ogni

filamento è per metà a duplicazione continua e per metà a duplicazione discontinua.

5.15 REPLICAZIONE DEL NELLE CELLULE PROCARIOTICHE:

ELIMINAZIONE DEI PRIMER ED UNIONE DEI FRAMMENTI DÌ

OKAZAKI

A questo punto, ci troviamo davanti la seguente condizione:

- Il FILAMENTO CONTINUO PRESENTA UN SOLO PRIMER che deve essere rimosso e

sostituito con una sequenza di DNA che deve essere legata al resto della catena;

- Il FILAMENTO DISCONTINUO presenta più di un PRIMER che devono essere rimossi e

sostituiti con DNA. 26

La domanda quindi è:

come avvengono i processi di sostituzione del PRIMER ? ed in che modo questi nuovi segmenti di

DNA vengono legati al resto del filamento ?

fino ad ora, abbiamo studiato il funzionamento della DNA POLIMERASI III, la cui funzione

principale è quella di DUPLICARE IL CROMOSOMA BATTERICO.

Il processo di RIMOZIONE e SOSTITUZIONE dei PRIMER, è svolto dalla DNA POLIMERASI I.

Le DNA POLIMERASI I, presentano le seguenti caratteristiche:

- Hanno una attività sintetica 5’3’;

- Hanno anche una ATTIVITÀ NUCLEASICA, cioè una attività che porta alla rottura del

legame fosfo-esterico tra i nucleotidi.

In particolare, le attività nucleasi che possono essere di due tipi:

- ATTIVITÀ ESO- NUCLEASICHE : quando la rottura dei legami parte da una estremità;

- ATTIVITÀ ENDO-NUCLEASICHE: quando vengono rotti legami al centro della catena.

La DNA POLIMERASI I ha attività ESO-NUCLEASICA.

Come la DNA POLIMERASI I, anche la DNA POLIMERASI III possiede una attività ESO-

NUCLEASICA in direzione 3’5’.

L’attività ESO-NUCLEASICA 3’5’ viene utilizzata dalla DNA POLIMERASI III come

CORRETTORE DÌ BOZZE, ovvero correggere eventuali errori di appaiamento durante la sintesi.

Questi ERRORI DÌ APPAIAMENTO, vengono identificati dalla DNA POLIMERASI III attraverso il

riconoscimento di una ERRATA FORMAZIONE DÌ PONTI IDROGENO TRA LE BASI AZOTATE,

che rendono la molecola di DNA instabile.

La DNA POLIMERASI I possiede: 27

- ATTIVITÀ DÌ SINTESI IN DIREZIONE 5’3’ ;

- ATTIVITÀ ESO-NUCLEASICA IN DIREZIONE 3’5’, anche questa attività eso-nucleasica

ha la funzione di CORREZIONE DÌ BOZZE;

- ATTIVITÀ ESO-NUCLEASICA IN DIREZIONE 5’3’, ovvero nella stessa direzione di

SINTESI. Questa attività eso-nucleasica, permette alla DNA POLIMERASI I di rimuovere

RIBONUCLEOTIDI (nucleotidi dell’INNESCO) e sostituirli con DEOSSIRIBONUCLEOTIDI

(nucleotidi di DNA).

L’attività di RIMOZIONE DEL PRIMER e di SOSTITUZIONE CON NUCLEOTIDI DÌ DNA, avviene

contemporaneamente.

La DNA POLIMERASI, al fine di svolgere il suo lavoro si rimozione e sostituzione del PRIMER,

necessita (come tutte le DNA POLIMERASI) di un 3’OH libero per potere funzionare.

Questo 3’ OH libero, viene messo a disposizione dell’ultimo nucleotide del frammento di Okazaki,

posto prima del PRIMER.

Quando anche l’ultimo ribonucleotide dell’INNESCO è stato sostituito, è necessario legare l’ultimo

nucleotide che ha sostituito il PRIMER con il nucleotide di DNA SUCCESSIVO (nucleotidi segnati

nell’immagine successiva). 28

LA DNA POLIMERASI NON È CAPACE DÌ LEGARE QUESTI DUE NUCLEOTIDI, in quanto al 5’ è

presente SOLAMENTE UN FOSFATO (mentre ricordiamo che la DNA POLIMERASI ha la

necessità di usare nucleosidi trifosfato per potere creare il legame fosforico).

A questo punto, per potere legare i due nucleotidi, interviene un nuovo enzima: LA LIGASI.

La LIGASI, è un enzima ATP dipendente capace di legare con legame fosfo-esterico.

SI CONCLUDE COSÌ LA REPLICAZIONE DEL DNA NEI PROCARIOTI.

5.16 REPLICAZIONE DEL DNA NEGLI EUCARIOTI 29

Prima di affrontare la replicazione del DNA nella cellula eucariotica, dobbiamo ricordare alcuni

punti chiave:

- LA CELLULA EUCARIOTICA HA Più MOLECOLE DÌ DNA (mentre i procarioti ne avevano

solamente una);

- Nel processo di replicazione del DNA, poiché i cromosomi sono di grandi dimensioni, si

formano PIÙ BOLLE DÌ REPLICAZIONE, al fine di velocizzare il processo di duplicazione

del materiale genetico.

- I cromosomi eucariotici sono ad ESTREMITÀ LIBERE (a differenza del cromosoma

batterico che è di forma circolare).

Come già detto in precedenza, le dinamiche di DUPLICAZIONE, TRASCRIZIONE, TRADUZIONE

si mantengono inalterate nell’arco dell’evoluzione.

Di conseguenza, sono poche le differenze tra la duplicazione del DNA nei procarioti e negli

eucarioti:

1) Negli eucarioti, al fine di velocizzare il processo di replicazione, si osservano molte bolle di

replicazione.

2) Negli eucarioti vi sono MOLTE PIÙ POLIMERASI che nei procarioti; molte di queste polimerasi

hanno funzioni multiple. Distinguiamo:

- DNA POLIMERASI α (alfa);

- DNA POLIMERASI β (beta);

- DNA POLIMERASI γ (gamma);

- DNA POLIMERASI δ (delta).

L’attività di sintesi dei nucleotidi (compiuta nei procarioti dalla DNA POLIMERASI III), è svolta d

adue tipi di polimerasi:

- POLIMERASI δ (delta): la quale opera sul filamento guida funzionando anche come

ELICASI; 30

- POLIMERASI α (alfa): la quale opera sul filamento lento e possiede DUE SUB-UNITÀ con

attività PRIMASICA.

La DNA POLIMERASI γ (gamma) è una polimerasi che agisce a livello mitocondriale (ricorda che i

mitocondri possiedono un DNA in grado di replicarsi).

Oltre queste diversità enzimatiche, negli eucarioti il processo di replicazione è uguale a quello dei

procarioti.

Negli eucarioti, è però presenta qualcosa di diverso, che deriva dalla struttura ad estremità libere

dei cromosomi.

RICORDA:

- PER POTERE FUNZIONARE, LA DNA POLIMERASI HA BISOGNO DÌ UN 3’OH LIBERO.

- QUESTO VALE PER TUTTE LE POLIMERASI.

Nella cellula procariotica, il DNA è circolare, quindi la RIMOZIONE DEL PRIMER è SEMPRE

possibile in quanto il 3’OH è fornito alla DNA POLIMERASI I dal nucleotide di DNA posto prima

dell’ INNESCO.

Negli eucarioti, le estremità sono LIBERE, e questo significa che all’estremità 5’ del nuovo

filamento, è presente un PRIMER che può essere rimosso dalla DNA POLIMERASI, MA NON

PUÒ ESSERE SOSTITUITO in quanto NON è PRESENTE NESSUN nucleotide in gradi di dare un

3’OH. 31

Con le conoscenze che abbiamo possiamo solamente dire che:

LA DNA POLIMERASI PUÒ SOLAMENTE RIMUOVERE IL PRIMER, SENZA AGGIUNGERE

NUCLEOTIDI A CAUSA DELLA MANCANZA DÌ UN 3’OH LIBERO.

Questa conclusione ci porta ad ipotiz