La manipolazione del DNA

22 ottobre

Manipolazione del DNA esistono diversi tipi di manipolazione, nella manipolazione si



utilizzano molecole, enzimi ecc che esistono già in natura, vengono modificate per

aumentare la specificità

Purificazione del DNA e successivamente manipolazione del DNA per ottenere poi il

DNA ricombinante

La manipolazione del DNA prevede l’utilizzo di enzimi normalmente utilizzati dalle

cellule per assolvere funzioni specifiche in processi essenziali come ad es. replicazione

del DNA, degradazione di DNA estraneo, unione di frammenti…

La nucleasi esistono due tipi di nucleasi



Esonucleasi: elimina due nucleotidi

complementari

Endonucleasi: il sito di taglio è all’ interno

producendo frammenti sempre più piccoli

di DNA, il taglio è su singolo filamento

Endonucleasi di restrizione: più utilizzate,

agisce all’ interno del filamento tagliando

entrambi i filamenti

La ligasi unisce due nucleotidi su un

solo filamento o unisce due molecole

di DNA  Polimerasi polimerizza un nuovo



filamento di DNA utilizzando l’altro

filamento come stampo

polimerasi I: usato dalla cellula per

completare una sequenza “rotta” di DNA

Fosfasi alcalina: si rimuovono gruppi

fosfati e li trasforma in OH

Polinucleotide chinasi: se trova una

molecola che termina con gruppi OH

addiziona (sostituisce) il 5’ OH con 5’

fosfato

Deossinucleotidil traferasi terminale:

aggiunge nucleotidi alla fine di una

molecola (3’ terminale trifosfato) Gli enzimi di restrizione

tagliano solo in siti specifici

perché riconoscono sequenze

particolari, con questo enzima

si linearizza il vettore (ovvero

aprire il vettore), usiamo lo

stesso enzima che ha diversi

siti di riconoscimento e si

otterranno diversi frammenti,

in base al tempo che si dà all’

enzima diverso numero di

frammenti avremo, oppure si

agisce sulla quantità di

enzima, più è l’enzima più è

veloce la reazione di taglio

I frammenti si usano poi per il

clonaggio

Gli enzimi di restrizione sono naturali, derivano dalla restrizione controllata dell’ospite

ovvero una strategia che usano i batteri per proteggersi dai fagi ( )

Gli enzimi non attaccano il DNA del batterio perché il batterio ha metilato la sequenza

di restrizione

In lab si susano i secondi tipi Le sequenze che gli



enzimi di restrizione

utilizzano sono sequenze

target palindromiche

In base al tipo di taglio

prodotto dall’ ER (enzima di

restrizione), le estremità del

DNA digerito (ristretto)

possono essere:

- Coesive: 5’ o 3’

sporgente

- Piatte

Mettendo a contatto il DNA tagliato

sporgente con una parte corrispettiva si

ottiene una unica molecola di DNA

continua creta da due DNA derivanti da

fonti diverse ()

Digestione con enzimi di restrizione, al termine della digestione bisogna bloccare la

reazione aumentando la temperatura o aggiungendo EDTA che chela il calcio

Elettroforesi su gel

Ligasi DNA ligasi unisce le estremità



del frammento che stiamo studiando

creando legami covalenti creando così

DNA ricombinante La

ligasi

unisce

molecole di DNA diverso creando

un’unica molecola

Quando si hanno estremità piatte

l’efficienza della ligasi è bassa, è

preferibile usare un ligazione delle

estremità coesive

Linker molecole piccole di DNA (circa 14 paia di basi) che hanno un sito interno di



BamH1 che digerisce i siti su entrambi i lati del DNA creando un taglio coesivo

Le code oligopolimeriche 

Non si sa quanti nucleotidi vengono aggiunti al

vettore topoisomerasi



La topoisomerasi I utilizzata in questo approccio è

del virus Vaccinia

L’enzima taglia in corrispondenza della sequenza

CCCTT, che deve essere presente in unica copia

nel vettore che si vuole utilizzare per il clonaggio