La manipolazione del DNA

Manipolazione del DNA

Esistono diversi tipi di manipolazione del DNA. Nella manipolazione si utilizzano molecole, enzimi ecc. che esistono già in natura, vengono modificate per aumentare la specificità. Purificazione del DNA e successivamente manipolazione del DNA per ottenere poi il DNA ricombinante. La manipolazione del DNA prevede l’utilizzo di enzimi normalmente utilizzati dalle cellule per assolvere funzioni specifiche in processi essenziali come ad esempio la replicazione del DNA, la degradazione di DNA estraneo, e l'unione di frammenti.

Nucleasi

Esistono due tipi di nucleasi:

• Esonucleasi: Elimina due nucleotidi complementari.
• Endonucleasi: Il sito di taglio è all'interno, producendo frammenti sempre più piccoli di DNA. Il taglio è su singolo filamento.

Endonucleasi di restrizione: Più utilizzate, agiscono all'interno del filamento tagliando entrambi i filamenti. La ligasi unisce due nucleotidi su un solo filamento o unisce due molecole di DNA.

Polimerasi e altri enzimi

Polimerasi: Polimerizza un nuovo filamento di DNA utilizzando l’altro filamento come stampo.

• Polimerasi I: Usato dalla cellula per completare una sequenza “rotta” di DNA.
• Fosfasi alcalina: Rimuove gruppi fosfati e li trasforma in OH.
• Polinucleotide chinasi: Se trova una molecola che termina con gruppi OH, addiziona (sostituisce) il 5’ OH con 5’ fosfato.
• Deossinucleotidil transferasi terminale: Aggiunge nucleotidi alla fine di una molecola (3’ terminale trifosfato).

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione tagliano solo in siti specifici perché riconoscono sequenze particolari. Con questo enzima si linearizza il vettore (ovvero aprire il vettore). Usiamo lo stesso enzima che ha diversi siti di riconoscimento e si otterranno diversi frammenti, in base al tempo che si dà all’enzima diverso numero di frammenti avremo, oppure si agisce sulla quantità di enzima. Più è l’enzima, più è veloce la reazione di taglio. I frammenti si usano poi per il clonaggio.

Gli enzimi di restrizione sono naturali, derivano dalla restrizione controllata dell’ospite ovvero una strategia che usano i batteri per proteggersi dai fagi. Gli enzimi non attaccano il DNA del batterio perché il batterio ha metilato la sequenza di restrizione. In laboratorio si usano i secondi tipi. Le sequenze che gli enzimi di restrizione utilizzano sono sequenze target palindromiche. In base al tipo di taglio prodotto dall'ER (enzima di restrizione), le estremità del DNA digerito (ristretto) possono variare.