La diagnosi in microbiologia

Al fine di una corretta diagnosi la raccolta del campione deve avvenire in maniera adeguata

(appropriatezza), in particolare esso dovrebbe essere raccolto:

- Quando? nel momento giusto: solitamente nella fase acuta della malattia, quando la carica

microbica è maggiore ed inoltre prima dell’inizio di una terapia antimicrobica. Infatti, gli antibiotici

interferiscono con la crescita microbica e influiscono dunque sull’esito dei test di laboratorio.

- Dove? in uno specifico distretto corporeo rappresentativo della patologia: facciamo l’esempio

della febbre tifoide causata da Salmonella typhi, ha un decorso bimodale caratterizzato da una

fase precoce (prime due settimane) con febbre elevata, emocoltura positiva e coprocoltura

negativa; una seconda fase (terza e quarta settimana) con diarrea, emocoltura negativa e

coprocoltura positiva. Risulta chiaro che andremo a ricercare il patogeno nel sangue durante la

fase precoce, nelle feci durante la seconda fase.

- Quanto? in quantità sufficienti per poter effettuare i test diagnostici.

- Come? evitando qualsiasi contaminazione: ad esempio la ricerca di Streptococcus pyogenes va

effettuata a mezzo di un tampone nelle fosse peritonsillari, evitando il contatto con l’orofaringe.

4. identificazione del campione: il contenitore deve essere opportunatamente

contrassegnato e confezionato prima del suo trasporto, in particolare questi devono

presentare il codice a barre identificativo ed il foglio di richiesta indicante i dati del

paziente, quelli del Clinico, la provenienza del campione, data ed ora del prelievo ed

una diagnosi clinica presuntiva.

5. trasporto del campione: bisogna considerare l’adeguatezza dei contenitori, dei terreni

di trasporto e della temperatura.

In questa fase il clinico ha diverse responsabilità: raccogliere il campione in maniera corretta,

conservarlo in maniera appropriata ed inviarlo al più presto al laboratorio di analisi.

Fase analitica

In termini generali possiamo distinguere due tipologie differenti di diagnosi:

• diretta: prevede la ricerca degli ANTIGENI del patogeno, quindi è la ricerca diretta del patogeno

o di parti di esso. Si effettua tramite il prelievo di campioni biologici (sangue, feci, urine et alia) e

può presentare due diversi approcci:

- diagnosi rapida: tramite metodi immunologici per la ricerca degli antigeni del patogeno o tramite

metodi molecolari per la ricerca delle sequenze genomiche;

- esame colturale

• indiretta: prevede la ricerca degli ANTICORPI dell’ospite nei confronti di quel patogeno.

Si effettua prelevando il siero del paziente e sottoponendolo ad esami immunologici quali test

immunoenzimatici (EIA, RIA, IFA). DIAGNOSI DIRETTA

Volta a stabilire la presenza del patogeno ricercandolo direttamente (ricercando quindi i suoi

ANTIGENI) mediante:

esame microscopico (batterioscopico)

A) esame colturale (isolamento colturale)

B) Identificazione

C)

A) ESAME MICROSCOPICO (BATTERIOSCOPICO)

A FRESCO

si usa per microrganismi difficilmente colorabili (Per tutte le spirochete, in particolare Treponema

Pallidum) mediante osservazione in campo scuro

PREVIA COLORAZIONE

prevede l’utilizzo di colorazioni semplici (un solo colorante) come cristal violetto o blu di metilene o

colorazioni differenziali (più di un colorante) come colorazione di Gram o di Ziehl-Neelsen.

La parete batterica permette di distinguere i batteri Gram+ e Gram-

- Gram+ : strato unico continuo di peptidoglicano formato da una parte glicanica e una parte

peptidica. La parte GLICANICA è formsts da N-acetilgalattosammina e N-acetil-muramico legati

da legame beta-1,4-glicosidico. La parte PEPTIDICA è formata dal tetrapeptide AGLA (L-

alanina, acido-D-glutamico, L-lisina e D-alanina)

- Gram- : caratterizzata da due strati: uno interno (immediatamente esterno al plasmalemma)

formato da peptidoglicano e uno più esterno, separato dal peptidoglicano mediante il

periplasma, formato dalla membrana esterna. tale struttura è asimmetrica e lo strato rivolto

verso l’interno è costituito da fosfolipidi mentre quello esterno è formato dal LPS. Il LPS

presenta una parte LIPIDICA formata dal lipide-A e una parte POLISACCARIDICA formata dal

polisaccaride-O

Colorazione di GRAM: fissaggio chimico

non è vero che i micobatteri non si colorano con questa, tuttavia per distinguerli uso la loro

specifica colorazione che è quella di Ziehl-Neelsen.

Si mette il cristal violetto, si usa lo iodio per fissarlo al batterio, si decolora con alcol (se è Gram+ il

colorante rimane adeso), si mette il secondo colorante di contrasto (fucsina).

I Gram+ appaiono blu mentre i Gram- appaiono rossi.

Colorazione di Ziehl-Neelsen: fissaggio a caldo

Utilizza la fucsina mediante colorazione a caldo su fiamma che permette la penetrazione del colore

nei micobatteri la cui parete alcol-resistente non ne permetterebbe altrimenti l’ingresso. Si usa

anche qua un colorante di contrasto per distinguere dai micobatteri tutti gli altri batteri presenti nel

campione: il blu di toluene.

Quindi la colorazione permette di fissare il campione (chimicamente o a caldo), fornisce indicazioni

riguardo l’idoneita del campione (presenza di cellule in espettorato = campione non idoneo), sul

numero di leucociti e sulla presenza quindi di batteri o altri microrganismi. Mediante poi la

colorazione di Gram valuto forma, disposizione e quantità dei batteri e mediante altre colorazioni

più specifiche (Ziehl-Neelsen per i micobatteri, verde di malachite per le spore…) valuto altri batteri

eventualmente presenti.

L’OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO È UTILE SOLO SE IL CAMPIONE ERA STERILE E IL

BATTERIO PATOGENO NON HA CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE SIMILI AI

COMMENSALI.

B) ESAME COLTURALE

Si effettua mediante semina del campione su vari terreni, ossia mezzi di mantenimento o di

trasporto, in modo da isolarne una specifica colonia (ossia un clone), soprattutto nel caso in cui il

batterio in questione sia poco nel campione.

TERRENI:

- elettivi: cresce prima una specie delle altre

- selettivi: crescono solo certe specie (presenza di sostanze batteriostatiche)

- differenziali: mettono in evidenza una determinata reazione

- liquido (brodo): acqua distillata + carboidrato (destrosio) + fonte di C inorganico (digerito

peptico)

- semisolido: brodo + 0,5% di agar

- solido: brodo + 2% di agar

- Agar Sangue: base di agar + 5-10% di sangue di montone

- Agar Cioccolato: agar con sangue cotto a 80°C in agitazione

- Agar Thayler-Martin: agar cioccolato + AA + Trimetoprim (Neisserie)

- Mannitol-Salt Agar: agar + NaCl 7,5% che inibisce i Gram- (Stafilococchi)

- Sabouraud Agar: pH acido 5,6 (Lieviti, Muffe, Funghi)

- Enterococcosel Agar: agar + ferro + esculina (Enterococchi, che idrolizzano l’esculina e Fe

precipita)

- McConkey Agar: differenziale, per Enterobatteri, formato da lattosio (PSSY/EKE) + cristal

violetto (inibisce i Gram+) + bile (inibisce altri Gram-)

- Terreni a base di ac.oleico e uovo (Lowestein-Jensen): Micobatteri

- Agar Sangue-Patata-Glicerolo: Bordetella Pertussis

- BCYE: ferro + carbone + AA (Legionella)

- Testicolo di coniglio: Treponema Pallidum

C) IDENTIFICAZIONE

- BIOCHIMICA

Si basa su:

- metabolismo di zuccheri aerobio (ossidativo) o anaerobio (fermentativo)

- enzimi specifici posseduti dal batterio

- cataboliti prodotti dal batterio

Metodiche manuali

Una volta che ho la coltura, ne inoculo una certa quantità in pozzetti e mediante il kit API-System

(ma ce ne sono anche altri) osservo la colorazione assunta dal pannello. Il software legge il tutto

(prima si usavano degli elenchi “telefonici” e fornisce un codice che identifica il microrganismo.

Metodiche automatizzate

Funziona in modo simile ma è automatizzato e quindi la probabilità di errore è inferiore.

Antibiogramma

Una volta individuato il batterio, si fa l’antibiogramma (= valutazione di sensibilità e resistenza del

patogeno agli antibiotici).

Si vuole trovare la:

- MIC (Minima Concentrazione Inibente): quantità minima per inibire la crescita

- MIB (Minima Concentrazione Battericida): quantità minima per uccidere il 100% dei batteri

mediante

- Metodo della diluizione:

- E-Test: striscia, un farmaco a varie concentrazioni

- Kirby-Bauer Test: cerchietti, vari farmaci alla stessa concentrazione (NB: il fatto che un

alone sia più grande di un altro non significa che quell’antibiotico sia più efficace)

Maldi-Tof: sottopone la coltura a raggio laser che disintegra il campione, concentra gli elettroni in

un tubo e tramite questi ne identifica il peptidogramma.

- IMMUNOLOGICA (SIEROLOGICA)

- MOLECOLARE DIAGNOSI INDIRETTA

Volta a stabilire la presenza del patogeno ricercandone la risposta immunitaria (ricercando quindi

gli ANTICORPI diretti contro di esso).

Si usa quando non abbiamo i terreni di coltura idonei (es: Treponema Pallidum).

È indiretta perché vado a saggiare la presenza del patogeno mediante una reazione Ag-Ig.

È più tardiva di quella diretta perché serve il tempo necessario a generare gli anticorpi.

Si usa per Treponema, Tifo, Brucellosi, Malattia Reumatica, Glomerulonefrite e Virus.

Il problema è quando il pz. sviluppa poche difese immunitarie.

Punto della situazione:

Possiamo distinguere la diagnosi parassitologica in:

• Diagnosi Clinica

• Approcci diretti tradizionali:

- Macroscopica

- Microscopica

• Approcci diretti o indiretti innovativi (ricerca Ag, Ig o

DNA)

- Immunologica, ricerca Ag in pz mediante Ig artificiali

- Sierologica, ricerca Ig in siero pz

- Molecolare (PCR, RT-PCR, RFLP), ricerca ac.nucleici

DIAGNOSI IMMUNOLOGICA

Non si saggia la presenza dell’Ag ma si valuta la risposta anticorpale nei confronti dell’Ag stesso.

Si valuta presenza di IgM (infezione recente o in atto, fase acuta), IgG (infezione passata, latente) e avidità

delle IgG (che cresce nel tempo).

Due sono i parametri fondamentali:

- Specificità: capacità di evitare falsi positivi (più è specifico meno ho probabilità che si vada a legare in

qualcosa di aspecifico)

- Sensibilità: capacità di evitare falsi negativi (più è sensibile meno probabilità ho che non si vada a legare a

qualcosa a cui invece dovrebbe legarsi facendomi credere che quella cosa non c’è quando invece c’è

eccome)

TEST DI AGGLUTINAZIONE AL LATTICE

Usa particelle di lattice rivestite da antigene noto o da anticorpi monoclonali. Nel primo caso valuto se nel

siero del pz. ho anticorpi diretti contro quell’antigene noto mentre nel secondo caso valuto quali antigeni di

quale microrganismo ho nel siero del pz. (che si vanno a legare alle Ig-monoclonali).

Se c’è legame c’è agglutinazione e il test è positivo