Istologia - sbobinatura

Metodologie di analisi microscopica

Scala dimensionale - Limiti di risoluzione

Un millimetro cubo può contenere da 5 a 10 milioni di cellule. Micron = 1 millesimo di millimetro. La maggior parte delle cellule del nostro organismo ha un diametro da qualche micron a qualche decina di micron. I batteri hanno diametri di decimi di micron. Per molte altre strutture ancora più piccole, bisogna ricorrere ad un'altra unità di misura che è il nanometro. Non fa parte del SI ma è ancora usato l’Å che è un decimo di nanometro.

La capacità di distinguere oggetti molto piccoli si chiama risoluzione e l’efficienza nel distinguere è il potere di risoluzione. La capacità è quella di distinguere una differenza fra due grandezze che sia piccola fino a un certo limite, e questo limite è proprio la misura che noi usiamo per indicare l’efficienza del sistema. A noi interessa la risoluzione laterale, cioè di poter distinguere come due punti diversi non uniti fra loro, due oggetti separati vicini, e quant’è la distanza minima fra due punti per essere ancora visti come separati e non come un puntino solo. Il nostro occhio, in condizioni teoriche ideali, con oggetto a 20 cm dal naso, riesce a risolvere spessori o distanze intorno al decimo di millimetro, lo spessore di un foglio di carta o di un capello sottile (un capello = 0,15 mm). Con il microscopio ottico si riesce a risolvere circa 0,2 micron ovvero 200 nm. Sotto i 200 nm di diametro siamo nel mondo della microscopia elettronica, un tipo di microscopio particolare che utilizza elettroni invece che radiazioni elettromagnetiche per esplorare un preparato e che riesce a arrivare a una risoluzione almeno sui materiali biologici intorno al nm. In teoria dovrebbe arrivare a 2 Å però ci arriva su fogli metallici e altre strutture molto più rigide dei materiali biologici.

Microscopio ottico

Lo stativo tiene uniti tutti i vari pezzi, è pesante perché non deve ballare appena lo si sfiori. Le parti che ci interessano sono tre: la parte centrale è un tavolino per metterci l’oggetto da analizzare, il tavolino porta oggetto, con un foro centrale per farci passare la luce. Ci sono poi un sistema di illuminazione sottostante e il tubo microscopico che ha due lenti, una vicina all’oggetto e perciò chiamata obiettivo, e una vicina all’occhio dell’osservatore e perciò chiamata oculare. Sono lenti complesse, sistemi di lenti. La lunghezza del tubo microscopico è standardizzata perché le lenti sono calibrate in funzione della lunghezza del tubo su cui devono funzionare. L’oggetto è al centro, il tubo microscopico è da una parte, il sistema di illuminazione dall’altra, la risoluzione migliore la si ottiene quando la luce attraversa l’oggetto e non quando viene riflessa.

Per ottenere una buona risoluzione dobbiamo guardare la luce trasmessa attraverso l’oggetto, e allora avremo il sistema di illuminazione dall’altra parte rispetto al tubo microscopico. C’è una lampadina o uno specchio che riflette la luce di una lampada esterna e poi un sistema di lenti detto condensatore che mette a fuoco la luce sul piano del preparato e poi la luce attraversa il preparato e entra nell’obiettivo. C’è poi un sistema di viti di messa a fuoco. Quello che guardiamo è qualcosa di sottile; se provate a guardarvi una mano in controluce a una lampadina intravedete appena un po’ di rosa sul contorno e poi non vedete niente al centro, quindi è chiaro che per vedere qualcosa in maniera che ci passi la luce attraverso deve essere molto fine. Per la microscopia ottica siamo nell’ordine dei micron, delle fette spesse da 2 a 10 micron, ci sono degli apparecchi che ci permettono di fare queste fette. È come la macchina per affettare il prosciutto. I nostri apparecchi si chiamano microtomi (micro = piccolo, tomo = taglio). Il microtomo di base deve avere una lama e un braccio su cui poggia l’oggetto, ci sono alcuni tipi in cui si muove la lama e altri in cui la lama sta ferma e si muove l’oggetto e un sistema micrometrico di avanzamento permette ad ogni passaggio di far avanzare l’oggetto in modo che ogni fetta venga dello spessore voluto, è chiaro che è uno spessore dell’ordine dei micron, è meccanica di precisione.

Anche una fetta così, quando la guardo al microscopio ha sempre un certo spessore. Come per la macchina fotografica, in cui bisogna mettere a fuoco l’oggetto, ogni sistema di lenti mette a fuoco idealmente un piano preciso, e cambiando il piano devo cambiare la mia messa a fuoco, in pratica è un certo spessore di spazio, non è proprio un piano ma c’è una certa profondità di campo focale. Questa profondità è nell’ordine dei decimi di micron, quindi una fetta di 5 micron in realtà è fatta da più di una decina di piani focali che si succedono, come avere un mazzo di carte fatto di vetro. Il sistema di messa a fuoco di un microscopio è fatto di due parti, qui sono disegnate come coassiali ma possono anche essere separate, una vite per la messa a fuoco macrometrica, che fa spostamenti grossolani, per andare a cercare il piano dell’oggetto, e poi una vite micrometrica, che fa piccoli spostamenti, che serve non solo ad adattare il microscopio fra gli occhi di uno e gli occhi dell’altro, ma serve soprattutto a permettere di fare quell’operazione che si chiama sfochettamento (sfochettare), cioè la messa a fuoco di precisione.

Vuol dire che devo continuamente andare avanti e indietro con la vite micrometrica in modo da esplorare tutti i vari campi del preparato, tutti i vari piani focali, e rendermi conto anche di dettagli come quelli che sono visibili solo mentre si cambia da un piano focale all’altro. Nel sistema di lenti c’è la lampadina, un condensatore (si chiama così la lente che concentra i raggi luminosi sull’oggetto), l’oggetto, la lente obiettivo che produce un’immagine dell’oggetto, quella che sarebbe l’immagine reale, cioè se io ci metto un vetro smerigliato, sul vetro si disegna l’immagine che ho raccolto, l’immagine intermedia. L’oculare raccoglie questa immagine intermedia e la fa apparire, giocando con sistemi ottici dell’occhio, sulla mia retina come un’immagine virtuale, cioè mi sembra di vederla da qualche parte dentro il tubo microscopico, ma se ci metto un foglio di carta, non raccolgo nessuna immagine. Al posto dell’occhio, adattando l’oculare, ci posso mettere una macchina fotografica, un sistema di ripresa per documentare l’immagine.

Microscopia a contrasto di fase - Preparati clorati e fluorescenti

Le cellule del nostro organismo si possono separare dai tessuti, spostare in coltura in vitro, alcune cellule già di suo sanno vivere in coltura, in sospensione, le cellule del sangue per esempio. Il sangue è un mezzo fluido dentro il quale queste cellule sono libere. Anche dai tessuti potete separare con certe tecniche le cellule, spostarle dentro dei recipienti, mettendo a disposizione un terreno, una specie di brodino, si parla infatti di brodo di coltura, che usano i microbiologi per i batteri, o di terreno di coltura liquido con dentro amminoacidi, sali, vitamine, fattori che stimolano la crescita delle cellule, che crescono, vivono, si riproducono. Io posso guardarle non colorate, ci sono delle tecniche microscopiche, degli adattamenti del microscopio ottico, il cosiddetto microscopio a contrasto di fase. Questo sfrutta il fatto che le diverse parti del preparato hanno indice di rifrazione diverso. L’indice di rifrazione è un parametro collegato alla velocità di trasmissione della luce dentro a quell’oggetto. Le strutture all’interno della cellula, nucleo, citoplasma e organuli hanno un indice di rifrazione leggermente diverso, cosa di cui non ci si accorge guardando normalmente.

È un sistema che sfruttando il microscopio ottico e dei filtri particolari permette di rendere apprezzabili al nostro occhio queste differenze di velocità, di conduzione della luce nei vari preparati. (IMMAGINE). Questi sono tipi diversi di tecnica di microscopia a contrasto di fase. Si vede un corpiciattolo ben visibile del diametro di qualche micron dai contorni stondati che chiamiamo nucleo, dentro il quale vediamo degli altri corpiciattoli opachi, ovvero lenti a trasmettere la luce, che si chiamano nucleoli, poi vedete dell’altro materiale che sta intorno al nucleo e che chiamiamo citoplasma, intuite che c’è una barriera fisica che delimita queste cellule dall’ambiente intorno, la membrana. La maggior parte delle volte però con questa tecnica si studia male il tessuto, le fette poi si vedono ancora peggio delle cellule isolate. I nostri padri si sono accorti un paio di secoli fa che tingendo, facendo cadere dell’inchiostro sui tessuti biologici qualcosa si tinge e qualcosa no. Hanno provato ad usare i coloranti delle stoffe.

Applicando i coloranti a un tessuto biologico, si sono accorti che diverse parti della cellula si colorano in modo diverso, come certe sostanze presenti nella sostanza intercellulare, ed è venuta piano piano a maturare la tecnica di colorazione dei tessuti che permette di vedere molti dettagli e di capire le differenze fra i vari tipi cellulari. Normalmente la colorazione si fa su cellule non più viventi. Con il microscopio a contrasto di fase si possono anche esaminare cellule vive mentre sono in coltura. Colorare cellule vive è praticamente impossibile con i coloranti attualmente in uso. Bisogna che la materia vivente sia stabilizzata in una forma che si presta bene alla colorazione.

D’altra parte il problema di stabilizzare la materia vivente c’è sempre, pensate a un pezzo di tessuto, una sottile fetta di carne che io voglio studiare al microscopio. C’è bisogno di fare fette di 5 micron, anche se lo mettete nell’apparecchio apposta la consistenza non si presta, si sbriciola e basta, perciò c’è il problema di rendere il tessuto della consistenza adatta, e poi ci vuole del tempo. Se aspetto un giorno, le mosche ci fanno le uova. Se ci metto una moscaiola, la carne va in putrefazione, è la degradazione della materia vivente determinata da batteri, in qualche modo dovuta alla degradazione delle proteine. Mettendo la carne in frigorifero, alla temperatura di 4 gradi centigradi, situazione in cui nessun batterio è in grado di riprodursi (alcuni batteri patogeni si riproducono anche a 6 gradi), la carne però si ammorbidisce.

I caratteri di un oggetto che si percepiscono con i nudi sensi si chiamano caratteri organolettici, odore, colore, sapore. Se del pezzo di carne sono cambiati questi caratteri, quando lo vado a vedere al microscopio lo trovo pesantemente alterato rispetto al tessuto appena prelevato. La prima cosa da fare quando abbiamo davanti un tessuto, o anche delle cellule isolate prelevate dal sangue, è la cosiddetta fissazione. Consiste nella stabilizzazione della materia vivente in condizioni le più simili possibili a quelle dello stato vivente e in modo tale da poter eseguire le tappe successive per l’allestimento di un preparato. Bisogna bloccare quei processi indotti da agenti esterni, ma anche spontanei dei tessuti. Dentro i tessuti ci sono enzimi che catalizzano sintesi e enzimi che catalizzano idrolisi, la degradazione della materia vivente in molecole più semplici introducendo acqua. Quando la vita cessa, i processi di sintesi si arrestano ma gli enzimi idrolizzanti proseguono a rimanere in funzione, e determinano una autodigestione, una autolisi della materia vivente.

La fissazione deve bloccare questi processi di autolisi, e le possibili alterazioni anche ossidative indotte dall’aria per la presenza dell’ossigeno, che è un potente ossidante. La fissazione va fatta subito appena raccolto il campione. Quando noi fissiamo, vedete che già il nucleo assume un aspetto diverso, non solo si vedono i nucleoli, che sono delle macchie a contorni lisci dentro il nucleo, ben colorati, ma si vede anche del materiale colorato che disegna una fine rete, o dei piccoli granuli di dimensione variabile, che formano la cosiddetta cromatina. Alcuni coloranti sono fluorescenti, sono dei fluorocromi. La luminescenza in genere è quel comportamento di alcune molecole per cui se ricevono energia sotto forma di radiazione elettromagnetica di una certa lunghezza d’onda, la assorbono, si eccitano e poi la restituiscono dopo un certo tempo, se poco fluorescenza, se tanto fosforescenza, la restituiscono sotto forma di una radiazione elettromagnetica di energia minore di quella che hanno ricevuto, e quindi di lunghezza d’onda maggiore.

Esistono dei fluorocoloranti che si possono vedere in un microscopio detto a fluorescenza, in questo caso non saranno radiazioni luminose normali ma saranno radiazioni del blu o del violetto, a volte anche del rosso, ci sono dei filtri per selezionare la luce che eccita il preparato, ogni fluorocromo è sensibile solo a una certa lunghezza d’onda, e poi si rileva la radiazione emessa, in questi casi di solito si lavora a luce riflessa e si usa l’obiettivo, attraverso un sistema di deviatori, anche come condensatore per mandare la luce sull’oggetto. La radiazione che noi sfruttiamo per vedere il tessuto è emessa da dentro tessuto e va in tutte le direzioni, è irrilevante la direzione da cui l’ho illuminata, allora anche per motivi pratici è meglio illuminarlo dall’alto così poi non dobbiamo fermare la radiazione eccitante perché non entri nei nostri occhi, lavoriamo in questo caso con quella che si chiama la epi-illuminazione (epi = su), ovvero dall’alto (trans = da sotto).

E poi c’è da fare le fette. Dobbiamo riuscire a capire come è fatto un oggetto tridimensionale guardandone varie sezioni. Per ricostruire tridimensionalmente un oggetto dobbiamo fare più fette e ricombinare le immagini delle varie fette, fare fette secondo vari piani e cercare di ricostruire la struttura tridimensionale. (IMMAGINE) Questo è un preparato che è stato colorato con un marcante di un certo compartimento del citoplasma è stato guardato con un particolare tipo di microscopio che sfrutta una sorgente di illuminazione a raggio laser e una tecnologia sofisticata computerizzata di analisi del segnale che viene dal preparato, permette di avere una raffigurazione sul computer di un singolo piano focale di uno spessore veramente piccolo. Questa è una fetta di 4 micron di spessore che è stata tagliata in quelle che si chiamano sezioni ottiche con questo microscopio. Questo stesso effetto lo avete se voi con il microscopio sfochettando vedete i vari piani focali.

Allestimento di preparati per la microscopia ottica

La fissazione è la prima cosa da fare. Per indurire il tessuto lo infiltriamo di paraffina, che ha la consistenza giusta, si scioglie a caldo, si infiltra nel tessuto, si fa raffreddare e viene fuori un cubetto di cera, di paraffina, con dentro il tessuto, si parla di inclusione perché il tessuto viene anche avvolto dalla paraffina, ma è anche infiltrato, dove in partenza c’era acqua, il 70 - 85% della cellula, ci mettiamo la paraffina. Il tessuto ne prende quindi la consistenza e si lascia sezionare. Ma la paraffina non si mescola con l’acqua, quindi viene rimossa con metodi chimici. La maggior parte dei fissativi sono agenti chimici, formalina, alcol, il più usato è l’aldeide formica che si trova in commercio, essendo un gas, sotto forma di soluzione acquosa di formaldeide, chiamata formalina. La formalina è una soluzione circa al 40% di aldeide in acqua, a sua volta va diluita al 10%, il risultato finale è una soluzione di aldeide circa al 4%, che è un ottimo fissativo, si presta a un sacco di reazioni, ci si può lasciare il tessuto anche per giorni, non cambia troppo.

I fissativi non si sciolgono nell’acqua(?), bisogna togliere l’acqua con alcol o acetone, ma l’alcol e l’acetone non si mescolano con la paraffina, sono ancora troppo idrofile, si deve passare in un intermediario, di solito di usano derivati del benzolo come lo xilolo che rendono il tessuto trasparente, come l’alabastro, ecco perché questa tappa di passaggio dall’intermediario è detta diafanizzazione. È detta così anche quando si usano intermediari diversi che non lo rendono trasparente. Poi abbiamo l’inclusione, la sezione, poi dovremo colorarla, ma i coloranti di solito sono sciolti in acqua, e allora dovremo togliere la paraffina con lo xilolo, lo xilolo con l’alcol, poi cambiare l’alcol con l’acqua. Esistono apparecchi automatici per farlo in serie. Dopo colorato, il tessuto va montato, va messo fra due vetrini, uno più spesso, porta oggetto, e uno più sottile, copri oggetto, viene fuori una specie di sandwich con dentro un sistema di montaggio, una specie di collante che non solo tiene incollati i vetrini ma garantisce che l’indice di rifrazione sia omogeneo, quindi un sistema di montaggio con lo stesso indice di rifrazione del vetro (sennò vengono aloni).

Ma di solito queste resine che si usano per montare non sono solubili in acqua, quindi dopo la colorazione, bisogna disidratare di nuovo. Alla fine questi preparati durano decine di anni. In caso in cui non si possano fare tutte queste tappe per il rischio di portar via qualcosa, grassi per esempio, che si sciolgono nell’alcol e nello xilolo, allora per indurire il tessuto si congela e così assume la consistenza adatta per poterlo poi tagliare e colorare. Ci sono casi in cui il tessuto deve essere sottoposto a delle tecniche per cui non si può fare la fissazione subito perché si sciuperebbero le sostanze che si vogliono colorare e osservare, bisogna congelare subito il tessuto.