Istologia: Madeddu

Metodi e mezzi di indagine istologici

Introduzione

Roberto Madeddu
Dipartimento di Scienze Biomediche

Metodi e mezzi di indagine istologici

• Microscopi
• Preparazione dei campioni per l’indagine microscopica
• Fissazione
• Inclusione e sezionamento
• Colorazione
• Colture in vitro
• Immunofluorescenza

Lenti di ingrandimento

Potere di risoluzione - Distanza minima alla quale due oggetti possano essere distinti. Cambia con le condizioni in cui avviene l'osservazione e può essere migliorato con l’ausilio di strumenti ottici (lenti d’ingrandimento, microscopi, cannocchiali).

A 25 cm di distanza, la misura di 75 micron rappresenta il limite inferiore del potere separatore dell’occhio umano. Allora dobbiamo usare la lente d’ingrandimento che permette normalmente ingrandimenti utili fino ad un massimo di 20 volte. Se si vuole superare questo limite bisogna munirsi di strumenti più complessi come il microscopio.

Microscopio luce

• Lampada di illuminazione
• Condensatore
• Tavolino porta-oggetti
• Obiettivo
• Oculare

Elementi di un microscopio

• Lampada di illuminazione
• Condensatore
• Tavolino con manopole per traslare il preparato
• Revolver dotato di 2-3-4 obiettivi intercambiabili
• Manopole per la messa a fuoco per movimenti sia macrometrici che micrometrici
• Oculari che permettono di regolare la distanza interpupillare

Microscopia a fluorescenza

Il microscopio a fluorescenza è uno speciale strumento adatto a rilevare strutture autofluorescenti (fluorescenza primaria) o rese fluorescenti con l’uso di fluorocromi (fluorescenza secondaria). In questo microscopio il preparato viene illuminato con luce ultravioletta, ad una determinata lunghezza d'onda, ed i suoi componenti osservati grazie alla fluorescenza emessa.

Le sostanze fluorescenti sono tali in quanto capaci di assorbire nel campo degli UV e, quindi, di rispondere a tale sollecitazione con l’emissione di luce nella "zona visibile" dello spettro. La sorgente luminosa è costituita da una lampada a vapori di mercurio che emette luce ricca di ultravioletto. Il filtro di eccitazione situato subito dopo la lampada permette il passaggio delle radiazioni ultraviolette utili per l’analisi della fluorescenza e arresta le radiazioni inutili. I campioni utilizzati per queste osservazioni sono dotati di strutture autofluorescenti ovvero di strutture ove la fluorescenza è indotta con l’aggiunta di fluorocromi. Un filtro di sbarramento situato prima dell’occhio ha il compito di bloccare la luce ultravioletta non assorbita dal preparato e di dare via libera alle sole radiazioni visibili.

Fluorescenza naturale

• Vitamina A
• Porfirine
• Clorofille

Fluorescenza indotta

Il fenomeno viene creato artificialmente con l’uso di markers fluorescenti (fluorocromi):

• Fluorescina (verde-gialla)
• Rodamina (rossa)

Microscopio elettronico

Il microscopio elettronico permette di evitare i limiti del microscopio a luce e di spingere la risoluzione fino agli angstrom. Il M.O. ha un potere di risoluzione pari a 0,2 micron ed è di norma utilizzato per l’osservazione di cellule, sezioni di tessuto o frammenti di organo. Il M.E. (potere di risoluzione raggiungibile compreso tra i 0,2-0,3 nanometri) permette uno studio dettagliato dei diversi organuli cellulari fino a giungere, con protocolli specifici, a fornire informazioni sulle principali molecole biologiche (proteine, acidi nucleici).

Allestimento di un preparato istologico

• Fissazione
• Disidratazione (I Serie Ascendente degli alcoli)
• Diafanizzazione
• Incubazione
• Inclusione
• Taglio (Microtomo)
• Deparafinizzazione
• Reidratazione (Serie discendente degli alcoli)
• Colorazione
• Disidratazione (II Serie ascendente degli alcoli)
• Chiarificazione
• Montaggio

Fissazione

La fissazione istologica ha il fine di impedire che i tessuti escissi dall’organismo vadano incontro a processi di autolisi (distruzione dei tessuti operata dagli enzimi cellulari in assenza di ossigeno) e di putrefazione (disfacimento del tessuto provocato dall’intervento di germi). Ha lo scopo di:

• Bloccare l’attività degli enzimi cellulari
• Evitare l’attacco dei germi
• Fissare le cellule in un modo che corrisponde alle condizioni che si avevano al momento dell’intervento del fissatore

I fissativi più usati in M.O. sono:

• Formalin (Formaldeide 10%)
• Alcol etilico
• Acido picrico
• Acido acetico etc.

I fissativi più usati in M.E. sono:

• Glutaraldeide
• Acido Osmico

Miscele di fissativi includono:

• Liquido di Bouin (Ac. Picrico + Formalina + Ac. Acetico)
• Miscela di Carnoy
• Miscela di Susa
• Miscela di Zencker

Colorazione

Le sezioni allestite, prima delle osservazioni al microscopio ottico, devono essere sottoposte a colorazione istologica. I vari metodi sono generalmente fondati sull’uso di due, tre o più coloranti. I meccanismi con i quali i coloranti si legano ai costituenti dei tessuti sono sicuramente molteplici e in gran parte sconosciuti. Tuttavia, alcuni dei più importanti coloranti istologici formano legami elettrostatici, di tipo salino, con radicali ionizzabili delle macromolecole tipo proteine, acidi nucleici etc.

Perciò, i coloranti sono classificati in due categorie:

• Coloranti acidofili (ematossilina, tionina, pironina, azzurro B etc)
• Coloranti basofili (eosina, orange G, verde luce etc)

Ematossilina - Eosina

Il metodo di colorazione più usato e conosciuto è quello dell’ematossilina-eosina. L’ematossilina (colorante basico) colora in blu-violetto la cromatina nucleare e quindi in generale si vedrà il nucleo colorato sull’azzurro. L’eosina (colorante acido) tingerà di rosa il citoplasma (per prevalenza di proteine basiche). È una colorazione dicromica e combinata.

Immunoistochimica

Studia la localizzazione istologica delle sostanze sfruttando le loro caratteristiche antigeniche. Gli anticorpi (Ab) sono speciali globuline sintetizzate nell’organismo a fini di difesa. Gli antigeni (Ag) sono sostanze estranee all’organismo o riconosciute come tali, costituite nella maggior parte dei casi da proteine. Traccianti: Fluorocromo, Perossidasi, Ferritina.

I tessuti

Roberto Madeddu
Dipartimento di Scienze Biomediche

Istologia

Classificazione dei tessuti:

• Tessuto epiteliale:
  • Epiteli di rivestimento
  • Epiteli ghiandolari
• Tessuto connettivo:
  • Tessuti connettivi propriamente detti
  • Tessuti connettivi speciali:
    • Tessuto cartilagineo
    • Tessuto osseo
    • Sangue e Linfa
• Tessuto muscolare
• Tessuto nervoso

Unità di misura

• Millimetro (mm) 1/1000 m
• Micrometro 1/1000 mm
• Nanometro 1/1000 micron
• Angstrom 1/10 nanometro

Tessuto epiteliale

Epiteli di rivestimento: ricoprono le superfici esterne ed interne del corpo (cute, tonache mucose e sierose), dei vasi sanguigni e linfatici (endotelio). Epiteli ghiandolari o secernenti: costituiscono il parenchima delle ghiandole esocrine ed endocrine. Epiteli sensoriali: si riscontrano intercalati tra le cellule degli epiteli di rivestimento ed intervengono nella reazione agli stimoli (cellule gustative – acustiche).

Tonache mucose - sierose

Le mucose ricoprono le superfici delle cavità poste in comunicazione con l’esterno del corpo come: apparato digerente, respiratorio, urinario, genitale. Le sierose ricoprono le superfici delle cavità non comunicanti con l’esterno, come pleura, pericardio e peritoneo.

Organi cavi

Gli organi cavi sono formati da diverse tonache fra loro aggregate a costituire una parete. La parete degli organi cavi si struttura tridimensionalmente originando all’interno dell’organo una cavità, che può avere dimensioni e forma variabili da organo ad organo. Le tonache che costituiscono la parete degli organi hanno anch’esse una precisa funzione, oltre che una denominazione in grado di identificarle. Partendo dalla parete più interna individuiamo la tonaca mucosa, denominata tonaca intima se ci si riferisce a vasi sanguigni e linfatici.

Procedendo verso l’esterno, aderente alla tonaca mucosa, possiamo apprezzare la tonaca muscolare, ancora una volta definita tonaca media con riferimento a vasi sanguigni e linfatici. Infine, come ultimo rivestimento, è presente la tonaca avventizia.

Organi pieni

Gli organi pieni hanno una struttura notevolmente più complessa, presentando come unici elementi costitutivi comuni: il dispositivo capsulare e stromale ed il parenchima. Il dispositivo capsulare è costituito da un foglietto di rivestimento, presente in tutti gli organi pieni, rappresentato in massima parte da tessuto connettivo denso. Tale tessuto penetra nell’organo assumendo spessore via via di minor dimensione, e delimitando in tal modo dei setti nei quali trova alloggiamento il parenchima dell’organo.

Proprio il dispositivo capsulare rappresenta la struttura di sostegno dell’organo che, nel suo insieme profondo, viene definito stroma. Il parenchima, come accennato, trova alloggiamento nelle cavità delimitate dallo stroma. Presenta caratteristiche strutturali e funzionali differenti da organo ad organo, risultando quindi l’elemento in grado di conferire le caratteristiche proprie degli organi pieni.

Classificazione epiteli

• Cellule contigue fittamente stipate tra loro
• Scarsissima sostanza (matrice) extracellulare amorfa che occupa sottili interstizi intercellulari (15-30 nm)

Funzione epiteli

• Protettiva: Principalmente sulla superficie esterna del corpo soggetta a traumi, attrito e perdita di acqua
• Assorbimento: In alcuni organi interni come intestino e rene
• Secrezione: Nelle ghiandole
• Trasporto in superficie: Esempio l’epitelio ciliato nelle vie respiratorie e nelle vie genitali femminili

Caratteristiche strutturali

Polarizzazione: È possibile distinguere una porzione basale che guarda verso la superficie interna e verso gli strati sottostanti ed una porzione apicale rivolta verso la superficie libera della cellula.

Adesione: Le cellule sono strettamente adese tra loro attraverso specifiche specializzazioni di membrana definite strutture di giunzione e verso gli strati sottostanti attraverso una membrana basale.

Vascolarizzazione

Gli epiteli non sono vascolarizzati e ricevono le sostanze nutritizie attraverso diffusione dai sottostanti capillari del tessuto connettivo.

Epiteli di rivestimento

• Pavimentoso
• Cubico
• Cilindrico

Semplice o monostratificato. Composto o pluristratificato (transizione – varietà particolare). Pseudostratificato.

Epitelio pavimentoso semplice

Cellule appiattite disposte in un unico strato. La sua funzione, più che di protezione, è quella di regolare la filtrazione e la diffusione; ha dei margini irregolari.

• Alveoli polmonari
• Mesotelio (Pleura-Peritoneo-Pericardio)
• Endotelio (Vasi sanguigni e linfatici)
• Capsula di Bowman (App. Urinario)
• Membrana Timpano (Orecchio)

Epitelio cubico semplice

Singolo strato di cellule di aspetto cuboide

• Superficie dell’ovaio
• Tiroide
• Condotti escretori di alcune ghiandole

Epitelio cilindrico semplice

Costituito da un unico strato di cellule cilindriche è molto diffuso. Svolge importante funzione di protezione ed è particolarmente adatto per funzioni di assorbimento e di secrezione. Le cellule possono essere fornite di microvilli o di ciglia vibrattili.

• Tubo digerente
• Piccoli bronchi
• Tube uterine
• Dotti escretori di molte ghiandole

Epitelio pseudostratificato

Varietà dell’epitelio cilindrico semplice. Le cellule hanno forma prismatica e sono disposte su un unico strato con altezza variabile che poggiano tutte sulla membrana basale. Non tutte le cellule raggiungono la superficie libera dell’epitelio.

• Vie respiratorie (Laringe-Trachea-Bronchi)
• Vie genitali maschili (Uretra-Epididimo)
• Orecchio (Tromba di Eustachio)

Epitelio pavimentoso pluristratificato

Molto diffuso nell’organismo. Esistono due varietà: Epitelio Pav. Pl. Non cheratinizzato e Epitelio Pav. Pl. Cheratinizzato.

• Epitelio Pav. Pl. Non cheratinizzato
  • App Digerente (Bocca-Faringe-Esofago)
  • Vagina
  • Uretra
  • Occhio (Cornea-Congiuntiva)
• Epitelio Pav. Pl. Cheratinizzato
  • Epidermide

Epidermide

Cute o pelle:

• Epidermide (t. epiteliale)
• Membrana basale
• Derma (t. connettivo)
• Annessi cutanei (Peli-Unghie- Gh. Sebacee e sudoripare)

È composta da:

• Strato basale o germinativo
• Strato spinoso o del Malpighi
• Strato granuloso
• Strato lucido (Solo nel palmo della mano e nella pianta del piede)
• Strato corneo

A: Strato basale. D: Strato lucido. B: Strato spinoso. E: Strato corneo. C: Strato granuloso. Dr: Derma (t. connettivo).

Cellule dell’epidermide

• Cheratinociti (cheratine)
• Melanociti (melanina)
• Cellule di Langerhans

Strutture di giunzione

• Zonula Occludens (Fascia occludente – Tight junction)
• Zonula Adhaerens (Fascia aderente)
• Macula adharens (Desmosomi)
• Gap Junction (Nexus – Giunzioni serrate)

Epitelio cubico pluristratificato

Costituito da due o più strati di cellule. Solo le più superficiali sono cubiche, le restanti appaiono poliedriche. È molto raro.

• Dotti escretori di alcune ghiandole

Epitelio cilindrico pluristratificato

Cellule superficiali cilindriche. Molto raro. Alcuni autori non fanno differenza tra questi due ultimi epiteli considerandoli solo aspetti diversi dello stesso epitelio.

• Grossi dotti escretori di alcune ghiandole
• Faringe
• Laringe
• Fornice congiuntivale

Epitelio di transizione o polimorfo

Riveste le vie urinarie. Soggetto a modificazioni legate al cambiamento di volume degli organi cavi che tappezza (vescica-ureteri- parte sup. uretra). Tre strati di cellule disposte in 5-10 ordini:

• Strato basale: cellule cubico-cilindriche
• Strato intermedio: cellule clavate o piriformi
• Strato superficiale: cupoliformi o a ombrello

Epiteli ghiandolari

Organi specializzati ad elaborare ed a riversare all’esterno sostanze come enzimi, mucopolisaccaridi, lipidi ed ormoni. Nelle ghiandole l’attività secernente è svolta dall’epitelio ghiandolare (parenchima) mentre il tessuto connettivo funzione meccanica di sostegno (stroma) dove decorrono vasi e nervi.

Classificazione degli epiteli ghiandolari

Ghiandole a secrezione esterna o esocrine: riversano il loro prodotto o sulla superficie esterna del corpo o in cavità che comunicano con l’esterno.

Ghiandole a secrezione interna o endocrine: sprovviste di dotti escretori e riversano il loro prodotto, gli ormoni, direttamente nei capillari sanguigni.

Sviluppo delle ghiandole

Entrambi i tipi di ghiandole hanno origine dall’epitelio di rivestimento con un'invaginazione che invade il tessuto connettivo sottostante.

Classificazione ghiandole esocrine

• Ghiandole unicellulari: cellule mucipare calciformi
• Ghiandole pluricellulari:
  • Intraparietali
  • Intraepitali
  • Esoepitali
  • Coriali
  • Sottomucose
• Extraparietali
• Semplici
  • Tubulari semplici
  • Tubulari glomerulari
  • Tubulari ramificate semplici
  • Acinose o alveolari semplici
  • Acinose o alveolari ramificate semplici
• Composte
  • Tubulari composte
  • Acinose o alveolari composte
  • Tubulo-acinose o tubulo-alveolari composte
• Olocrine
• Apocrine
• Merocrine
• Sierose
• Mucose
• Miste

Classificazione ghiandole pluricellulari

Ghiandole extraparietali:

• Pancreas
• Fegato

Ghiandole intraparietali:

• Ghiandole intraepiteliali
• Ghiandole esoepiteliali
• Ghiandole coriali (tonaca propria)
• Ghiandole sottomucose (tonaca sottomucosa)

Le ghiandole pluricellulari

Sono formate da una porzione secernente chiamata parenchima e da una rete di sostegno chiamata stroma. Il parenchima è di natura epiteliale, lo stroma è di natura connettivale. Il parenchima è formato da unità secernenti chiamate adenomeri e da dotti escretori. Gli adenomeri possono avere:

• Forma allungata e lume evidente (ghiandole tubulari)
• Forma sferica o a fiasco e lume molto piccolo (ghiandole acinose)
• Forma sferica e lume molto ampio (ghiandole alveolari)

Classificazione in base alla morfologia dei dotti escretori

Classificazione in base alle ramificazioni dei dotti escretori

• Semplici
  • Tubulari semplici
  • Tubulari a gomito