Istologia dei tessuti

Istologia preparazione dei tessuti

Fissazione

Fissazione è un trattamento chimico o fisico che permette di preservare la struttura del tessuto per i successivi trattamenti. Il campione dovrebbe essere immerso nel fissativo immediatamente dopo essere stato rimosso dal corpo. La fissazione ha il ruolo di:

• Bloccare il metabolismo cellulare
• Prevenire la degradazione delle cellule o dei tessuti a opera di enzimi litici presenti nei tessuti stessi (autolisi)
• Uccidere eventuali microrganismi patogeni come batteri, funghi o virus che potrebbero degradare il campione
• Rendere duro il tessuto attraverso il cross-linking o la denaturazione delle proteine

Il fissativo più comune è la formalina, una soluzione acquosa di formaldeide al 37%, che viene impiegata a varie diluizioni e in combinazione con altri agenti chimici e tamponi. La formaldeide preserva la struttura delle cellule e delle componenti extracellulari reagendo con i gruppi amminici delle proteine. Questa modalità non altera significativamente la struttura tridimensionale delle proteine, per cui permette di utilizzare anticorpi per riconoscere se e dove sia presente una proteina in un tessuto. La soluzione standard in commercio contiene formaldeide e tampone fosfato (pH 7), agisce in maniera relativamente lenta ma penetra bene nei tessuti. Siccome non reagisce con i lipidi, non è un buon fissativo delle membrane cellulari.

Inclusione

Inclusione: la preparazione chiede che il campione venga permeato da un medium di inclusione che, una volta indurito, permetta di tagliare sezioni finissime, di spessore compreso tra 5 e 15 μm. Il tessuto fissato è infatti troppo soffice per permettere un taglio netto e preciso; inoltre, la sezione deve poter essere maneggiata per essere trasferita dalla lama al supporto per l’osservazione, che è il vetrino. Il campione fissato viene perciò lavato e disidratato mediante immersione in una serie di soluzioni acquose contenenti concentrazioni crescenti di alcol fino ad arrivare al 100%. Questo processo rimuove l’acqua, in cui la paraffina non è solubile, dai tessuti. Il campione viene chiarificato per immersione in una soluzione di solventi organici (xilolo e toluolo) che prendono il posto degli alcoli e allo stesso tempo sono buoni solventi per la paraffina. Il campione viene immerso in paraffina liquida in un apposito contenitore e questa filtra lentamente il tessuto, riempiendo tutti gli spazi liberi. Si lascia poi raffreddare la paraffina in modo che solidifichi e il "blocchetto" viene montato sul microtomo, uno strumento che permette di tagliare sezioni sottilissime con una lama di acciaio le sezioni del blocchetto vengono via via adagiate su un supporto di vetro a cui aderiscono.

Colorazione

Le sezioni sottili sono trasparenti. Si rende perciò necessario colorare il preparato per poterne osservare i particolari al MO. La sezione viene deparaffinata, per immersione in xilolo e reidratata per immersione in una serie di soluzioni acquose contenenti concentrazioni di alcol decrescenti. Il tessuto sul vetrino viene quindi colorato con una soluzione acquosa di ematossilina. Per il contrasto con eosina, solubile in alcol, la sezione viene disidratata di nuovo tramite il passaggio in una serie di soluzione alcoliche a titolo crescente e colorata con eosina in alcol. La sezione viene quindi passata dallo xilolo o dal toluolo a un mezzo di montaggio non acquoso, che ne favorisce la conservazione, e coperta con un vetrino coprioggetto.

Altri fissativi

L’uso di solventi organici e di alcoli, per esempio, rimuove i lipidi neutri dai preparati fissati con formalina. Per preservare tali sostanze, è possibile congelare il tessuto e utilizzare poi coloranti solubili nei grassi. Per le strutture fini delle membrane cellulari bisogna ricorrere a speciali fissativi consententi metalli pesanti che si legano ai fosfolipidi, come il permanganato o l’osmio. Con il tetrossido di osmio le membrane sono molto ben osservabili al ME.

Altre colorazioni

L’EE non è in grado di rivelare alcune strutture dei tessuti quali fibre elastiche, fibre reticolari, membrane basali degli epiteli o depositi di lipidi. Esempi:

• Orceina o resorcina-fuscina (fibre elastiche)
• Colorazione di Azan-Mallory (fibre collagene dei connettivi)
• Impregnazioni argentiche (fibre reticolari e le membrane basali)

Coloranti acidi e basici

Un colorante acido come l’eosina possiede una carica elettrostatica netta negativa [Na colorante]. Un colorante basico possiede invece una carica elettrostatica netta positiva [colorante Cl]. L’ematossilina non è un colorante basico in senso stretto, ma ha proprietà che ricordano quelle di un colorante basico. La natura chimica di un colorante determina l’affinità differenziale per i componenti del tessuto. Il colore non dipende univocamente dal fatto che il colorante sia acido o basico.

Le componenti anioniche di cellule e tessuti comprendono i gruppi fosfato degli acidi nucleici, i gruppi fosfato degli glicosaminoglicani e i gruppi carbossilici delle proteine. La proprietà di reagire con coloranti basici è detta basofilia, per cui il nucleo cellulare è basofilo. La reattività dei gruppi anionici nei tessuti dipende dal pH:

• pH elevato (tutti i gruppi vengono ionizzati e sono disponibili per il colorante basico)
• pH neutro o leggermente acido (saranno ionizzati prevalentemente i gruppi fosfato e solfato)
• pH basso (solo i gruppi solfato saranno ionizzati)

È quindi possibile usare coloranti basici a un determinato pH, per rilevare la presenza di uno specifico tipo di gruppo anionico.

Un mordente è una molecola che fa da ponte tra il tessuto e il colorante. Possiede capacità di legame che rendono simile la colorazione con ematossilina a una colorazione di tipo basico. L’ematossilina è insolubile in soluzioni acquose, perché il complesso tessuto-mordente-ematossilina non è tenuto assieme da semplici interazioni elettrostatiche. Tale proprietà permette perciò di combinare l’ematossilina in sequenza con un colorante sciolto in acqua di tipo acido. Ciò non è invece possibile con coloranti propriamente basici, che verrebbero portati via dai lavaggi tra una colorazione e l’altra.

La reazione di un colorante acido con un gruppo cationico è detta acidofilia. Sebbene il legame di un colorante acido dipenda principalmente da interazioni elettrostatiche, anche altri fattori quali le dimensioni delle molecole del colorante, la capacità di questo di aggregare, la permeabilità e la "compattezza" delle strutture all’interno del tessuto possono influenzare le proprietà del colorante. Questo permette di usare coloranti acidi in combinazione tra loro per rilevare strutture differenti di un tessuto. Per esempio, la colorazione tricromia di Mallory, in cui vengono impiegati 3 coloranti acidi: il blu di anilina, la fuscina acida e l’orange-G, che colorano rispettivamente il collagene blu, il citoplasma delle cellule in rosa e gli eritrociti in giallo-arancio. La fuscina acida colora anche i nuclei di rosso intenso. Anche i coloranti basici possono essere utilizzati in combinazione o in sequenza, come nel caso del verde metile e della pironina nello studio della sintesi e della secrezione di proteine, ma queste colorazioni sono usate raramente.

Solo un numero limitato di sostanze nelle cellule e nella matrice extracellulare è basofilo. Queste sostanze includono:

• L’eterocromatina e i nucleoli nel nucleo, principalmente per la presenza di DNA complessato con le proteine della cromatina
• Componenti citoplasmatici come il RER
• Materiale extracellulare come i carboidrati complessi della matrice della cartilagine, per la presenza di numerosi gruppi solfato

I coloranti acidi sono meno specifici, ma reagiscono con numerose sostanze acidofile nelle cellule e nella matrice extracellulare. Queste sostanze includono:

• Gran parte dei filamenti citoplasmatici, e in particolare quelli delle cellule muscolari
• Gran parte dei componenti membranosi intracellulari e del citoplasma
• Gran parte delle fibre extracellulari

Gruppi aldeidici e reattivo di Schiff

La reazione acido periodico-reattivo di Schiff (PAS) tinge i carboidrati e le macromolecole di carboidrati come le glicoproteine. Gli accumuli di glicogeno nelle cellule, le secrezioni mucose, la membrana basale degli epiteli e le fibre reticolari dei connettivi. La reazione di Feulgen viene usata per rilevare la presenza di DNA.

La reazione PAS rileva la presenza di carboidrati. La sua specificità è basata sul fatto che la struttura dei carboidrati come il glucosio è costituita da un anello a 6 atomi di carbonio, ognuno dei quali possiede un idrossile; l’acido periodico ossida il legame tra atomi di carbonio adiacenti di una molecola di carboidrato, liberando 2 gruppi aldeidici contigui; il reattivo di Schiff, in presenza di anidride solforosa, reagisce con le aldeidi contingue dando una colorazione magenta. La reazione PAS rivela la presenza delle esosamine che costituiscono i glicosaminoglicani (GAG). La colorazione PAS è basata sulla presenza di proteoglicani (carboidrati ramificati associati a un core proteico) all’interno di queste strutture.

La reazione di Feulgen si basa sul distacco delle purine dal deossiribosio che forma lo scheletro del DNA tramite blanda idrolisi acida. L’anello dello zucchero si apre mettendo in evidenza delle aldeidi che reagiscono con il reattivo di Schiff. L’RNA, non consentendo desossiribosio, non viene invece rilevato con questo metodo perché l’idrolisi acida forma un solo gruppo aldeidico.

Tessuto epiteliale

L’epitelio è un tessuto privo di vasi sanguigni, composto da cellule che ricoprono le superfici esterne del corpo e rivestono le cavità interne prive di sbocco all’esterno e i canali che comunicano con l’esterno. Forma anche la porzione secernente (parenchima) delle ghiandole e i loro dotti. Inoltre, alcune cellule epiteliali funzionano come recettori per gli organi di senso (gusto e udito).

Caratteristiche delle cellule:

• Sono strettamente giustapposte e aderiscono l’una all’altra tramite specifiche molecole di adesione intercellulari che costituiscono giunzioni specializzate
• Funzioni differenti sono associate ai 3 distinti domini morfologici della superficie: la superficie libera o dominio apicale, il dominio laterale e il dominio basale (le proprietà di ogni dominio sono determinate da specifici lipidi e proteine integrali di membrana)
• La loro superficie basale è attaccata alla sostanza della membrana basale, uno strato acellulare ricco di proteine e polisaccaridi, evidenziabile al MO mediante metodi istochimici

In alcune sedi le cellule epiteliali sono strettamente accostate, ma mancano di una superficie libera. Sebbene la stretta vicinanza e la presenza di una membrana basale suggeriscano una loro classificazione come epitelio, l’assenza di una superficie libera rende più appropriata la definizione di tessuti epitelioidi. È tipica delle ghiandole endocrine (cellule interstiziali di Leydig del testicolo, le cellule luteiniche dell’ovaio, le isole di Langerhans del pancreas, il parenchima della ghiandola surrenale e il lobo anteriore dell’ipofisi, le cellule epitelio-reticolari del timo). Possono manifestare un arrangiamento epitelioide i macrofagi che si accumulano nel connettivo in risposta a certi tipi di danno o di infezione e molti tumori derivati dall’epitelio.

Le cellule epiteliali di rivestimento, disponendosi in fila, costituiscono una sorta di foglietto che separa il tessuto connettivo sottostante o adiacente dall’ambiente esterno, da cavità interne o da connettivi fluidi quali sangue o linfa. Funziona come una barriera selettiva che facilita o inibisce il passaggio di sostanze tra l’ambiente esterno e il sottostante compartimento connettivale.

Classificazione degli epiteli

Due criteri: il numero degli strati cellulari e la forma delle cellule in superficie.

• Epitelio semplice
• Epitelio stratificato

Le singole cellule:

• Squamose, piatte o pavimentose (la larghezza è maggiore dell’altezza)
• Cubiche (altezza, larghezza e profondità sono le stesse)
• Colonnari o cilindriche (l’altezza supera la larghezza) Cilindriche basse (altezza poco superiore alle altre dimensioni)

In alcune ghiandole esocrine le cellule sono più o meno piramidali, con l’apice rivolto verso il lume. Anche le cellule piramidali sono classificate come cubiche o colonnari a seconda della loro altezza relativa o della loro ampiezza alla base. In un epitelio stratificato, la forma e l’altezza delle cellule variano da uno strato all’altro, ma nella classificazione incide solo la forma delle cellule dello strato superficiale. La specializzazione del dominio apicale cellulare: alcuni epiteli colonnari semplici sono classificati come colonnari semplici ciliati quando il dominio apicale di superficie presenta le ciglia. Le cellule dell’epitelio piatto stratificato possono essere cheratinizzate o meno. L’epidermide è detto cheratinizzato in forza della presenza di cellule cheratinizzate in superficie. L’epitelio si divide in:

• Epitelio pseudostratificato appare stratificato, ma alcune cellule non raggiungono la superficie libera: tutti gli elementi giacciono sulla membrana basale. Si tratta di un epitelio semplice.
• Epitelio di transizione o urotelio riveste il tratto urinario inferiore, a partire dai calici minori del rene fino alla parte prossimale dell’uretra. L’urotelio è un epitelio pluristratificato con caratteristiche morfologiche specifiche che gli consentono di distendersi.

In certe sedi all’epitelio vengono date delle specifiche denominazioni:

• Endotelio: epitelio che riveste i vasi sanguigni e linfatici
• Endocardio: epitelio che tappezza gli atri e i ventricoli del cuore
• Mesotelio: epitelio che riveste e delimita i contenuti delle cavità corporee chiuse (addominale, pericardica e pleurica)

L’endotelio e l’endocardio sono quasi sempre squamosi. Nelle venule postcapillari di certi vasi linfatici è cubico (venule a endotelio alto o VEA). Nella milza le cellule dei seni venosi sono conformate a bastoncello e disposte come le doghe di una botte.

Un dato epitelio può svolgere una o più funzioni:

• Secrezione: epitelio cilindrico dello stomaco e delle ghiandole gastriche
• Assorbimento: epitelio cilindrico dell’intestino e dei tubuli contorti prossimali del rene
• Trasporto: trasporto di materiale o di cellule lungo una superficie da parte di cellule ciliate o nel trasporto di materiale attraverso l’epitelio da e verso il connettivo
• Protezione: epitelio piatto stratificato della cute (epidermide) e nell’epitelio di transizione della vescica urinaria
• Funzione recettoriale: per ricevere e trasmettere stimoli esterni, come nei bottoni gustativi della lingua e nelle cellule capellute dell’orecchio. Può cooperare come sostegno si cellule nervose nell’epitelio olfattorio della mucosa nasale e nella retina dell’occhio.

Gli epiteli coinvolti nella secrezione o nell’assorbimento sono tipicamente semplici o, in pochi casi, pseudostratificati. L’altezza riflette il livello di attività secretoria o assorbente. Gli epiteli squamosi semplici sono compatibili con un elevato tasso di trasporto transepiteliale. La stratificazione dell’epitelio si correla con l’impermeabilità transepiteliale. In alcuni epiteli pseudostratificati le cellule basali sono elementi staminali che danno luogo alle cellule funzionali mature del tessuto, provvedendo così al rinnovamento cellulare.

Polarità cellulare

Presentano un dominio apicale, un dominio laterale e uno basale. Il dominio apicale o libero è sempre diretto verso la superficie esterna o il lume di una cavità circoscritta o di una struttura tubulare. Il dominio laterale comunica con le cellule adiacenti ed è caratterizzato dalla presenza di aree finalizzate all’adesione. Il dominio basale riposa sulla lamina basale, che ancora le cellule al sottostante tessuto connettivo.

Dominio apicale e specializzazioni

Il dominio apicale contiene specifici enzimi (idrolisi), canali ionici e proteine di trasporto (trasportatori di glucosio). Le modificazioni strutturali di superficie comprendono:

• Ciglia citoplasmatici mobili: appaiono come appendici corte e filiformi; hanno processi approssimativamente un diametro di 0.25 μm e una lunghezza che va da 2 a 10 μm e si proiettano all’esterno dalla superficie libera delle cellule. Una sottile banda scura è visibile all’interno delle cellule, alla base delle ciglia. Tale banda rappresenta le strutture denominate corpi basali. La zona centrale è occupata da microtubuli. 9 coppie o doppiette di microtubuli disposte in circolo intorno a una coppia centrale (9+2). Durante l’iniziale sviluppo dell’embrione, delle ciglia che presentano microtubuli in assetto 9+0 stabiliscono l’asimmetria sx-dx nella disposizione degli organi interni. Monociglia che presentano l’assetto 9+0 dei microtubuli funzionano come meccanocettori registrando un flusso di fluidi nei reni in via di sviluppo.
• Microvilli: processi citoplasmatici che si proiettano dalla superficie cellulare verso l’esterno. A volte sono delle propaggini, fitte e uniformi altre volte corte e irregolari. Il numero e la forma dei microvilli correlano con la sua capacità di assorbimento. Negli epiteli che svolgono funzioni di trasporto dei fluidi, per esempio quelli dell’intestino e del tubulo renale, sulla superficie apicale, si trovano una serie di striature verticali che corrisponde ai microvilli stipati. Nelle cellule assorbenti intestinali questa struttura di superficie è stata denominata orletto striato, mentre nelle cellule del tubulo renale viene detta orletto a spazzola. Laddove non esista alcuna modificazione di superficie, i microvilli, se presenti, sono corti, poco numerosi e non facilmente distinguibili.