Introduzione ormoni e auxina

Ormoni

Gli ormoni sono sostanze naturali con piccolo peso molecolare (28 - 346 Da), in grado di indurre un specifico processo fisiologico a concentrazioni molto basse (10^-9 - 10^-6 M).

Possono agire su cellule vicine a quelle di sintesi appartenenti allo stesso tessuto (ormoni paracrini) o essere trasportati in altri tessuti distanti dalla sede di sintesi (ormoni endocrini). Possono anche agire sulla stessa cellula produttrice (ormoni autocrini).

Ormoni animali vs. ormoni vegetali

• Composto organico che viene sintetizzato in organi o tessuti specifici. Sebbene possano essere presenti concentrazioni maggiori in certi organi o tessuti vegetali, non è quasi mai possibile identificare il sito (o un singolo sito) di produzione;
• Sostanza che viene trasportata all’organo bersaglio mediante il flusso sanguigno. Non è sempre identificabile univocamente un organo bersaglio, però è vero che un ormone può avere effetti diversi su organi diversi. Il trasporto è diversificato per ormoni diversi e per lo stesso ormone in funzioni diverse;
• Molecola che induce una risposta specifica in maniera concentrazione-dipendente. Nell’ambito di crescita e sviluppo, la risposta non è sempre specifica, ma ogni ormone è polivalente. Le risposte specifiche (es. sintesi amilasi in embrioni di orzo o proliferazione cellulare, in vitro) sono usate per saggi biologici. La specificità di azione di un ormone si esplica su determinati tessuti o organi ed in determinati momenti dello sviluppo. Non è ancora chiaro se l’entità della risposta sia modulata da cambiamenti nella sensibilità all’ormone o da cambiamenti nella sua concentrazione.

Ricorda che ormoni appartenenti a classi diverse agiscono spesso insieme in maniera coordinata.

Gli ormoni vegetali – Funzioni

Gli ormoni vegetali controllano:

• Le attività cellulari (divisione, distensione e differenziazione);
• I processi come la determinazione del sesso, l’organogenesi e le risposte a stress abiotici e biotici.

Modalità di azione ormonale: sintesi, trasporto, percezione, signaling e risposta biologica

Sintesi ormonale

Gli ormoni sono prodotti dalla pianta durante lo sviluppo (ad esempio di un fiore o di un frutto) sotto il controllo del genoma vegetale. In aggiunta, gli ormoni sono prodotti a seguito di stimoli ambientali, come la luce o lo stress idrico, al fine di provocare una risposta adeguata della pianta. Parecchie vie metaboliche contribuiscono all’accumulo dell’ormone attivo. Queste vie sono strettamente regolate. La coniugazione può conservare temporaneamente un ormone in una forma inerte, indirizzarlo verso la degradazione catabolica o, nel caso dell’acido jasmonico, rappresentare il mezzo di produzione dell’ormone attivo.

Gli ormoni vegetali non si trovano allo stato libero all’interno della pianta, ma formano principalmente dei coniugati con zuccheri e gruppi amminici; quindi, la concentrazione di ormone attivo dipende:

• Non soltanto dal tasso di sintesi e di degradazione,
• Ma anche dall’equilibrio tra forma libera e coniugata.

Trasporto e percezione ormonale

Gli ormoni possono essere trasportati attraverso i tessuti conduttori (floema e xilema) della pianta, possono direttamente attraversare le membrane cellulari o con l’aiuto di proteine di trasporto. Alcuni recenti studi sugli ormoni hanno riguardato l’identificazione dei recettori ormonali, che possono essere legati a membrane, o localizzati nel citoplasma o nel nucleo. Il recettore, di solito proteico, interagisce con l’ormone legandolo in modo reversibile.

Trasduzione del segnale

Il legame ormone-recettore causa delle modificazioni biochimiche. Le due più comuni vie di trasduzione del segnale sono la fosforilazione reversibile di proteine e la proteolisi di proteine specifiche.

Risposta biologica

La risposta biologica coinvolge di solito cambiamenti nella trascrizione di geni (induzione o repressione). In alternativa, la risposta biologica può avvenire senza cambiamenti trascrizionali, ad esempio attraverso l’attivazione di canali ionici.

Segnali di trasduzione ormonali

Gradiente morfogenetico

Un morfogeno è una sostanza distribuita in maniera non uniforme, in modo da formare un gradiente, che guida lo sviluppo dei tessuti nel processo di morfogenesi, stabilendo dove si andranno a posizionare determinate cellule specializzate nei tessuti. Il morfogeno può agire da molecola segnale su determinate cellule, che rispondono diversamente in base alla loro posizione.

I morfogeni hanno il cosiddetto effetto a bandiera francese: osservando il grafico, se i morfogeni sono prodotti dalle cellule, in verde, in prossimità di quest’ultime saranno in concentrazione maggiore rispetto a zone più distanti, formando appunto un gradiente. La quantità di morfogeno a cui è esposta una cellula, che dipende quindi dalla sua posizione (dalla distanza delle cellule verdi), determina una risposta cellulare diversa.

• Ad alte concentrazioni si ha una risposta colorata in blu;
• A medie concentrazioni in bianco;
• A basse in rosso.

Infatti, tutte le cellule del grafico potrebbero potenzialmente seguire il destino blu, bianco o rosso, ma la loro posizione è determinante. Questi gradienti si osservano anche nelle cellule animali, rivestendo un ruolo fondamentale nelle prime fasi di sviluppo embrionale.

Per esempio, nell’anfibio Xenopus laevis il morfogeno Chordin è espresso nella regione dorsale, mentre BMP è inizialmente espresso uniformemente. Ma nella regione dorsale Chordin lega BMP, inibendolo, così BMP agisce solo a livello ventrale. Quando il complesso Chordin-BMP diffonde nuovamente verso la parte ventrale, una proteasi scinde il legame e libera BMP, mantenendo una maggiore concentrazione di BMP nella regione ventrale. Un altro importante morfogeno è l’Acido Retinoico.

Esso è fondamentale nei vertebrati durante la prima fase di sviluppo dell’embrione, poiché permette di individuare la posizione dell’asse dell’embrione A-P, fungendo da molecola di segnalazione intercellulare, che guida lo sviluppo nella parte posteriore dell’embrione. L’AR è un morfogeno derivato dalla vitamina A, implicato nella regionalizzazione del romboencefalo. Esso attraversa la membrana cellulare, si lega al recettore citoplasmatico RA, formando un complesso che trasloca nel nucleo, regolando l’espressione genica attraverso il legame a specifiche sequenze localizzate nel promotore del gene target, dette RARE (elemento di risposta dell’AR).

Biosintesi

Mutanti per Raldh2: mediastino più ampio.

Omeostasi e vie di segnalazione

L’AR agisce a livello delle cellule epiteliali, esercitando le sue funzioni legandosi ai RAR:

• Si lega all’inizio alla CRABP (cellular retinoic acid binding proteins).
• Poi l’AR viene trasportato dal citoplasma verso il nucleo cellulare e qui si lega ai RAR.

Vi sono 3 tipi di RAR: RAR-alfa, RAR-beta e RAR-gamma. Una volta che il ligando lega il recettore, il complesso acido retinoico-RAR svolge la sua funzione di tcf. Quindi, il complesso va a legare delle porzioni di DNA, dei geni specifici, inducendone la trascrizione.

Embriogenesi (di Arabidopsis thaliana)

Caratterizzata da:

• Divisione cellulare orientata;
• Espansione cellulare;
• Comunicazione cellula-cellula;
• Specificazione cellulare.

Il che porta alla morfogenesi, cioè alla determinazione di forma e struttura. Sviluppo della pianta: insieme di cambiamenti che avvengono per tutto l’arco della vita della pianta. Durante lo sviluppo tessuti e organi crescono in dimensioni, cambiano forma e specializzano le loro funzioni, quindi lo sviluppo va a pari passo con la crescita.

Zigote: cellula diploide che deriva dalla fusione di pronuclei aploidi maschili e femminili durante la fertilizzazione. Prolifererà in seguito nell’embrione pluricellulare.

Tutte le piante attraversano tre fasi dello sviluppo:

• Embriogenesi (in questa fase si stabiliscono la simmetria e la polarità)
• Sviluppo vegetativo
• Sviluppo riproduttivo.

Sviluppo vegetale e animale a confronto

• Tutte le cellule vegetali mantengono un certo grado di totipotenza anche dopo il differenziamento. I tessuti possono infatti de-differenziarsi (callus) e poi specializzarsi di nuovo in un altro tipo di tessuto (embriogenesi somatica).
• Le cellule animali hanno capacità di movimento, mentre quelle vegetali no, per via della parete. Ciò richiede una sviluppata capacità di adattamento all’ambiente.
• Durante l’embriogenesi della pianta, tessuti e organi adulti non vengono generati direttamente. Nelle angiosperme si forma un corpo elementare, con l’asse embrionale e i due cotiledoni. In particolare si formano due pattern: quello apicale-basale (verticale) e quello radiale.

La fase della crescita vegetativa comincia durante l’embriogenesi e continua per l’arco di tutta la vita, infatti le piante hanno delle regioni del corpo, i meristemi, in cui si trovano le cellule indifferenziate, che si dividono per il resto della vita.

Ciclo vitale di Arabidopsis

1. Nella sacca embrionale avviene la fertilizzazione. Il polline contiene due gameti, che fertilizzano sia l’ovulo che la cellula centrale. Il primo formerà l’embrione e la seconda l’endosperma.
2. Embriogenesi. Si sviluppa prima l’asse apicale-basale: E poi quello radiale: Dopo la fase a cuore c’è la torpedo e infine quella cotiledonare. Nella fase di zigote fino all’ottante si sviluppa l’asse verticale, in quanto esistono solo cellule apicali e basali. Nella fase proembrionale, cioè il dermatogeno, si sviluppa anche l’asse radiale poiché abbiamo epidermide e cellule interne.
3. Nella fase globulare abbiamo l’ipofisi, che forma il CRC (central root cap, cellule precursori) e la cellula a lente che forma il QC. Nella fase a cuore abbiamo già endoderma e cellule corticali.
4. Plantula
5. Pianta vegetativa
6. Pianta in fiore

È lo stabilirsi dell’asse verticale che causa la corretta disposizione dei meristemi, dei cotiledoni e dell’ipocotile. L’auxina agisce nelle prime fasi embrionali controllando il differenziamento cellulare. Il promotore sintetico DR5 agisce come AuxRE, cioè risponde all’auxina, e quando legato ad un gene segnale come GFP mostra il campo d’azione dell’auxina stessa. In questo modo possiamo vedere anche l’azione di PIN7, 1 e 4, anch’essi espressi nelle fasi iniziali.

GNOM codifica per un fattore di scambio GDP/GTP per piccole G-proteine della classe ADP ribosilation factor. Il trasporto polare dell’auxina è pesantemente compromesso nei mutanti gnom. La sua espressione vascolare in fase globulare è importante per la formazione dei meristemi radicali, invece l’espressione epidermica è importante per mantenere il trasporto di auxina nell’epidermide per formare i cotiledoni. Il gene ARF MP e AUX/IAA BDL sono co-espressi nelle prime fasi embrionali. BDL inibisce MP: le mutazioni bdl e mp presentano fenotipo simile, ma la prima acquista una funzione mentre la seconda ne perde una. MP induce l’ipofisi a formare la cellula a lente e in seguito il centro quiescente (QC). Inoltre MP controlla la formazione della radice regolando un fattore di trascrizione mobile, TMO7. La comunicazione cellula-cellula è fondamentale in questa fase.

I bersagli di TMO7 si muovono verso l’ipofisi, e qui TMO7 promuove la corretta definizione del piano di divisione dell’ipofisi. I fattori di trascrizione homeobox wuschel related WOX2, 8 e 9 sono espressi differentemente nella cellula apicale e in quella basale, dopo la divisione dello zigote. (i geni homeobox sono geni che controllano lo sviluppo, agendo all’apice della gerarchia nel processo di regolazione di morfogenesi e differenziamento)

Determinazione polo apicale

È importante per la formazione del meristema apicale (SAM) e dei cotiledoni (due processi indipendenti ma correlati). Inoltre è importante anche per la formazione dell’asse abassiale/adassiale. WUS è un fattore di trascrizione coinvolto nella formazione del SAM. È un gene homeobox che controlla le staminali, infatti è necessario per mantenerle indifferenziate. STM è anch’esso importante per la formazione del SAM. La formazione dei cotiledoni dipende dall’auxina. Alla fine della fase globulare essa è trasportata verso il cotiledone nascente da PIN1. CUC1 e 2 sono geni la cui espressione è inversamente correlata alla via di segnalazione dell’auxina. Sono geni responsabili del posizionamento dei cotiledoni e della loro separazione. All’aumento della concentrazione di auxina i cotiledoni si formano ma non vengono espressi CUC e STM. Il dominio apicale deve formare il meristema apicale e i cotiledoni.

Nella precoce fase a cuore si vede la direzione dell’auxina (frecce) e la suddivisione dell’embrione in cotiledoni (verde) e meristema (rosso): Sezione trasversale di un embrione. In rosso il meristema, in arancione le zone intercotiledonari, in verde scuro il dominio adassiale del cotiledone e in verde chiaro quello abassiale. Il meristema e le zone intercotiledonari hanno bassi livelli di auxina e alti di CUC, mentre è l’opposto nei primordi dei cotiledoni.

Questo accade al mutante cuc: non si formano né il cotiledoni né il meristema perché l’auxina è uniformemente distribuita. Questo invece accade ai mutanti pin1 e pid (l’embrione non ha la PID chinasi responsabile del posizionamento di PIN1 sull’apice della cellula): la carenza di auxina nei primordi dei cotiledoni permette l’accumulo di CUC nel dominio apicale, impedendo la crescita del cotiledone.

Determinazione polo basale

L’asse apicale-basale stabilisce anche la posizione del meristema radicale (RM), correlato al differenziamento del QC. Differenziamento dell’ipofisi: nei futuri endoderma e cortex, l’MP attiva TMO7, che verso le cellule sovrastanti. Inoltre MP promuove il trasporto di auxina PIN1 dipendente sempre verso le cellule sovrastanti, dove contribuisce insieme a TMO7 alla specificazione dell’ipofisi. Differenziamento del QC: richiede i fattori di trascrizione SCR e SHR. Nei mutanti scr e shr l’asse radiale è compromesso e un caratteristico meristema radicale. WOX5 invece regola l’attività del QC, ed è un membro della famiglia WUS. QC184 (anche 25 e 46) è un reporter che ci permette di osservare l’attività del QC. I geni PLT servono per preservare il QC e le staminali. J: radice primaria di un wild type. K: radice primaria di un mutante plt1plt2. Quest’ultimo ha anche l’apparato radicale molto meno sviluppato.

Questi mutanti inoltre non accumulano amido sotto le cellule che esprimono YFP e accumulano SHR-GFP con meno efficienza nei semi. I geni PLT determinano la posizione delle cellule staminali durante l’embriogenesi. Inoltre essi agiscono indipendentemente da SCR e SHR nel mantenimento delle staminali, ma dipendono dall’auxina e da AuxRE. Questi geni sono anche coinvolti nella specificazione della radice embrionale. Una sovraespressione di PLT determina il fenotipo da radice distale ectopica.

La chiave dello sviluppo è quindi sempre l’auxina: Allo stadio di ottante, l’espressione non uniforme di WOX2 e WOX8/9 marca il dominio apicale-basale. WOX8/9 è regolato da WRKY2. Allo stadio di dermatogeno, il corepressore TPL inibisce l’espressione di PLT nella porzione basale. Al contrario, l’espressione di HD-ZIP III (come PHB, REV, PHV, ATHB8) nella porzione apicale è controllata dai membri della famiglia miR165/166. PLT1,2,3 e 4 occupano il dominio complementare a quello di HD-ZIP III e sono espressi nelle cellule basali nella prima fase globulare. Questi due gruppi di geni sono infatti antagonisti: i primi determinano il polo basale e i secondi l’apicale. L’espressione precoce di PLT è causata da MP e ARF7 nel dominio basale; Cellule che esprimono PLT, SCR, SHR diventeranno QC; QC segnala alle cellule circostanti di rimanere indifferenziate.

In dettaglio

Parlando quindi di quello che è lo sviluppo dell’embrione abbiamo detto: abbiamo uno sviluppo abassiale-adiassiale per quanto riguarderà poi la futura formazione dei cotiledoni; uno sviluppo apico-basale; e lo sviluppo del pattern radiale. Andiamo a vedere cosa succede a livello apicale, e quindi dobbiamo guardare cosa succede a livello del meristema apicale vegetativo (Shoot apical meristem SAM), dell’iniziazione dei cotiledoni quindi formazione dei cotiledoni e della generazione dall’asse abassiale-adiassiale.

Parliamo quindi di WUSCHEL (WUS) anche in questo caso si ha un Homeobox Gene; è molto importante, già a livello fenotipico si hanno grossi difetti per la mutazione, infatti WUS è molto importante per andare a definire quelli che sono i confini del pool di staminali. A seconda del dominio di espressione di WUS si ha il dominio di espressione delle staminali, quindi è un fattore che è indispensabile che fa sì che le staminali si mantengano in uno stato indifferenziato. Da diversi esperimenti è stato inoltre visto che andando ad alterare quello che è il dominio di espressione di WUS in realtà si può anche andare ad aumentare e diminuire il pool di staminali. In questo caso, eliminando WUS (quindi per perdita di funzione) diminuisce il pool di staminali, e l’organismo adulto non riesce a sviluppare un vero e proprio meristema apicale.