Introduzione alle tecniche di laboratorio

Cromatografia HPLC

(HPLC). La concentrazione di sali è un punto chiave di questa tipologia di cromatografia. Il pH svolge un ruolo meno importante. La selettività, risoluzione e capacità di legame della proteina target dipende dalle condizioni di legame. Molte proteine potrebbero precipitare in soluzioni con concentrazioni di sale molto elevate. Bisogna quindi controllare la finestra di solubilità della proteina! La precipitazione della proteina target causa difficoltà nella sua purificazione e riduce il campo di purificazione.

Reverse-phase (RP) chromatography (HPLC). Si tratta di una cromatografia di affinità che richiede di sottoporre i campioni a pressioni e non a flusso. Si tratta di una cromatografia ad alta pressione, che richiede colonne con forme e materiali specifici e una fase stazionaria altrettanto specifica. Si basa sull'interazione idrofobica, utilizzando matrici con un grado di idrofobicità maggiore rispetto a quelle che vengono utilizzate con proteine integre.

Si utilizzano gruppi ancora più idrofobici rispetto alla precedente cromatografia. Questa è indicata per la purificazione di peptidi, ottenuti dalla proteolisi di una proteina target, o la separazione e il riconoscimento di composti organici, molecole chimiche, che non sono proteine e non hanno il vincolo di mantenere conformazione nativa.

Si utilizzano condizioni molto drastiche per interrompere le interazioni idrofobiche e effettuare l'eluizione, come solventi organici che possono causare denaturazione delle proteine (etanolo, metanolo, acetonitrile).

Reverse-phase in quanto si tratta del contrario della normal phase HPLC, la quale vede gruppi polari che interagiscono con gruppi polari, quindi uno scambio ionico. La reverse phase HPLC prevede interazioni idrofobiche, gruppi idrofobici che interagiscono con gruppi idrofobici sulla fase stazionaria.

Normal phase: La fase mobile non è polare, la fase stazionaria costituita da microsfere di silice è invece polare.

per sè oppure funzionalizzata. Le molecole polari del campione interagiscono con la fase stazionaria e il flusso di unsolvente non polare fa si che le molecole non polari vengano dilavate.

Reverse phase: la fase mobile è polare, la fase stazionaria è idrofobica, non polare. L’analita non polare interagisce con la fase stazionaria più fortemente (silice modificato per essere idrofobico), e le molecole polari vengono eluite dalla fase mobile polare più rapidamente.

RP-HPLC è più semplice da utilizzare e più versatile della normal phase. La fase stazionaria più idrofobica dell’HIC, permette di applicare questa tipologia di cromatografia a un ampio range di molecole (anche organiche).

Le matrici utilizzate per RP-HPLC sono generalmente resine di silice con ligandi alchilici come C18, C8 o C4. C18 e C8 sono utilizzati per peptidi o piccole proteine. C4 per proteine medio-grandi.

Cromatografia di affinità: definizioni e

interagisce con il target

Proteina che interagisce con il target

Anticorpi (immunoaffinità)

Metalli (cromatografia di affinità a ioni di metallo - IMAC)

Vi è sempre un legame che deve essere molto specifico e selettivo!!!

Si ha un legame della proteina target al ligando in modo altamente specifico, che fa si che il gradiente di eluizione non sia necessario. Una volta applicato il campione, la maggior parte degli analiti viene dilavata, si legano solo specifiche molecole alla resina funzionalizzata con lo specifico ligando. Applicando il buffer di eluizione che permette il distacco della proteina otteniamo quindi in un unico passaggio tutto il rilascio della singola specie di proteina di interesse purificata dai contaminanti, senza dover applicare un gradiente, in quanto si è legata solo questa in modo specifico.

Talvolta però, quando si lavora con proteomi complessi è possibile che vi siano interazioni di contaminanti con la resina.

• Aspecifica: si utilizza un elevata concentrazione di sali e pH estremi. Le interazioni aspecifiche con la resina vengono destabilizzate, eliminando i contaminanti aspecifici. Si ha però il rischio di denaturazione della proteina.
• Specifica (competitiva): si utilizza un eccesso molare del ligando stesso (che è mobile e non immobilizzato sulla fase stazionaria) oppure posso utilizzare un eccesso molare di un analogo del ligando. Durante la fase di eluizione aggiungo al tampone un eccesso di un analogo del ligando (per il quale l'affinità del target è leggermente maggiore), sul quale andranno ad interagire le proteine target, che interrompono il legame con quello sulla fase stazionaria legandosi alla fase mobile. Es. Maltose binding protein, un large protein TAG, che lega maltosio. Posso utilizzare il

maltosio come eluente, mentre sulla resina utilizzata per la proteina taggata con maltose binding protein potrebbe essere sostituita con un altro zucchero, per cui ha affinità ma minore rispetto al maltosio che uso durante l'eluizione.

Vantaggi: alta selettività ed efficienza, accoppiando il ligando giusto.

Svantaggio: non è facile trovare il ligando esatto e specifico per ogni proteina.

Per ovviare il problema si può modificare la proteina con la fusione con un affinity tag, facendo si che essa abbia le caratteristiche desiderate. Conoscendo il ligando specifico del tag che è stato aggiunto alla proteina target, posso funzionalizzare la resina con quello specifico ligando. La proteina interagisce in questo modo con la resina e mi permette di individuarla e selezionarla in modo specifico ed efficace durante il processo.

• strategie che prevedono l'utilizzo di small tags

La proteina viene modificata aggiungendo alla sua sequenza

All'estremità N- o C-terminale un affinity tag, un elemento accessorio, il quale può essere molto importante da un punto di vista di affinità. Posso modificare in questo modo la proteina fornendole affinità nei confronti di un certo ligando, che può essere più disponibile ed economico rispetto ad altri.

Una proteina dotata di un tag di affinità è definita tagged protein. Produco una proteina ricombinante che contenga un affinity tag che si possa legare in modo specifico al ligando con cui viene funzionalizzata la matrice. L'eluizione viene effettuata aggiungendo un competitore del ligando nella fase mobile.

Uno small tag è costituito da 2 fino a 8-15 residui e alcuni esempi sono la coda di poliistidine, oppure lo Strep-tag II.

Un esempio è il sistema strepatidivina/biotina, che si basa sul fatto che l'interazione tra i due è una delle più forti interazioni non covalenti osservate in natura.

L'interazione tra proteina e piccolo ligando in una soluzione acquosa porta a un'interazione così forte che la dissoluzione di questa avviene solo tramite la denaturazione della proteina, ha una Kd= 10^-15M. La streptavidina ha una struttura tetramerica e interagisce con 2 biotina. La concentrazione del complesso è talmente elevata che la costante di dissociazione è molto bassa, indicando un legame molto forte. Le resine di affinità sono molto costose e si tende a rigenerarle, questo sistema però non lo permette, a causa dell'altissima affinità del complesso, che per poter interrompere l'interazione richiede una denaturazione della proteina, rendendo inutilizzabile una seconda volta la resina. Si utilizza per questo un sistema modificato che prevede l'interazione tra streptactina, una forma modificata della streptadivina con il quale vengono funzionalizzate le resine, con proteine tagged con una certa sequenza amminoacidica WSHPQFEK.

in cui è importante una molecola di triptofano che mimica la struttura della biotina. La sequenza amminoacidica quindi produce una porzione che mantiene una forte affinità con la streptactina. L'eluizione avviene tramite l'inserzione di una fase mobile contenente un analogo del ligando. Se utilizzassi la biotina come competitore ciò provocherebbe il rilascio del triptofano e quindi della proteina con esso, e il legame della streptactina con biotina. Questo legame sarebbe però talmente forte che non potrei più riutilizzare la resina. Si utilizza quindi la destiobiotina, che possiede una Kd più elevata Kd= 10^-11M, un legame meno forte, che fa si che l'interazione con la resina sia reversibile. In questo modo la proteina viene rilasciata e eluita in un unico blocco, a causa del rilascio del triptofano dovuto alla presenza di un competitore più forte, la destiobiotina, per il legame con la streptactina sulla resina. Un altro esempio

è quello con His-tagged. In questo caso le microsfere della resina sono funzionalizzate con acido nitril-triacetico, che è in grado di chelare ioni Nichel. Gli ioni Nichel sono in grado di interagire con residui di istidina di una coda di poliistidine.

Si ha l’interazione tra un tag di poliistidina associata alla proteina target (2-10 residui) e residui di Nichel-NTA localizzati sulla matrice.

Ogni ione Nichel è in grado di interagire con al massimo 2 residui di istidina per volta, i quali devono essere distanziati in modo opportuno per interagire con gli ioni a livello del loro azoto.

Produrre un tag che contiene un numero maggiore di 2 istidine, aumenta la probabilità che queste interazioni avvengano. Si tratta di un concetto di allovalenza, tutti i residui hanno una funzione analoga e tutti possono interagire allo stesso modo con lo ione Nichel.

L’eluizione avviene tramite:

• abbassamento del pH