Ingegneria genetica - dal genoma alle moderne tecniche di manipolazione

Ingegneria genetica: introduzione alla genetica molecolare

Il genoma

Genoma: insieme delle informazioni necessarie alla sopravvivenza di un organismo e alla sua riproduzione; nelle cellule eucariotiche la maggior parte del DNA è contenuto principalmente in un organello specifico, il nucleo (DNA nucleare), ma mitocondri e cloroplasti contengono un proprio DNA, diverso e distinto da quello presente nel nucleo. Il DNA è organizzato in strutture molecolari definite “cromosomi”.

Cromosomi: complessi ribonucleoproteici costituiti da DNA a cui sono associate diverse proteine, e RNA. Le loro dimensioni molto ridotte garantiscono all’enorme mole di informazione genetica di essere contenuta in uno spazio molto ristretto come quello del nucleo cellulare.

Caratteristiche del cromosoma

• I cromosomi sono “portatori” dell’informazione genetica contenuta in una cellula.
• Il loro stato di compattamento è modulabile e correlato alle diverse fasi del ciclo cellulare (in metafase per esempio lo stato di condensazione è massimo, e i cromosomi sono ben visibili al microscopio ottico).
• Contiene loci, ovvero qualsiasi porzione del cromosoma che posso identificare e mappare; il termine “locus” infatti designa la posizione di una qualsiasi sequenza significativa all’interno di un cromosoma: oltre alle sequenze codificanti (geni), sono loci anche il telomero e il centromero.
• Se questi loci sono geni devono potersi esprimere.
• Deve possedere un locus specifico che garantisca la corretta segregazione cromosomica durante il processo di divisione cellulare: il centromero o costrizione primaria. In corrispondenza del centromero infatti si assembla un complesso multiproteico noto come “cinetocore” che intercetta e aggancia i microtubuli del fuso mitotico.
• I cromosomi “olocentrici” sono cromosomi sprovvisti di un centromero localizzato, in quanto questo è “diffuso” per tutta la lunghezza di ciascun cromatidio (più centromeri) —> i microtubuli si agganciano lungo tutto il cromatidio, ed il trasporto è parallelo.
• In base alla posizione del centromero (che divide i cromatidi in due bracci), si distinguono cromosomi:
  • Metacentrici —> centromero centrale
  • Sub-metacentrici —> centromero in posizione sub-terminale
  • Acrocentrici —> centromero localizzato in prossimità dell’estremità cromosomica
  • Telocentrici —> centromero terminale
• I cromosomi sono garanzia di variabilità genetica a causa di errori durante la replicazione del DNA (mut. puntiformi) e della ricombinazione operata dal crossing-over tra cromatidi di cromosomi omologhi durante la meiosi, evento che favorisce una maggiore varietà nei prodotti della riproduzione sessuata.
• Contiene le “origini della replicazione”, sequenze di DNA specifiche in corrispondenza delle quali ha inizio la replicazione del materiale genetico grazie alla formazione delle cosiddette “bolle di replicazione”.
• Contengono loci atti a proteggere la stabilità dell’informazione genetica dall’attività degradativa di nucleasi ma soprattutto dal meccanismo di replicazione stessa delle estremità: i telomeri.

I telomeri sono sempre presenti all’estremità dei cromosomi lineari ma non in quelli circolari dove sono assenti, appunto, estremità attaccabili.

Struttura del genoma

• Cariotipo: costituzione del patrimonio cromosomico di una specie dal punto di vista morfologico. In genere il cariotipo è rappresentato ordinando i cromosomi in ordine di grandezza decrescente e tenendo i centromeri allineati (cariogramma). Lo studio del cariotipo permette di fornire informazioni circa eventuali anomalie nel numero di cromosomi (aneuploidie).
• Idiogramma: rappresentazione diagrammatica del cariotipo che permette di evidenziare le caratteristiche morfologiche dei cromosomi. Tiene conto del bandeggio cromosomico derivato dalla colorazione.
• Cromosomi politenici: definiti anche cromosomi “giganti”, prendono origine da numerosi cicli di endoduplicazione, ovvero cicli di replicazione del materiale genetico che non terminano però con la formazione di due nuovi nuclei (manca la fase di segregazione cromosomica). Cellule delle ghiandole salivari nello stadio larvale di D. melanogaster, infatti, intraprendono un ciclo cellulare che però manca della fase M (mitosi): come conseguenza di ciò si formano migliaia di cromatidi fratelli (2¹⁰ copie; 1024) che rimangono fusi insieme, non potendo segregare. Sembrerebbe che la produzione di tali cromosomi sia correlata al vantaggio metabolico conferito dalla presenza di numerose copie geniche che garantirebbero un elevato tasso di espressione genica durante lo stadio larvale.
• Caratteristica dei cromosomi politenici è quella di trovarsi perennemente in interfase (in quanto manca la fase M, mitosi) e di essere quindi ben visibili al microscopio essendo di fatto non condensati e molto voluminosi.
• Andando incontro a colorazione, i cromosomi politenici (ne sono visibili 4 anziché 8 poiché gli omologhi sono fortemente appaiati e indistinguibili, tranne nelle regioni in cui gli omologhi si separano per un breve tratto) mostrano un pattern di bandeggio costituito da bande chiare e bande scure (cromomeri): le bande scure generalmente costituiscono aree di cromatina non coinvolte in una significativa attività trascrizionale, che invece è presente nelle bande chiare. In alcuni punti inoltre, si formano dei rigonfiamenti detti “puffs” che corrispondono ad un locale ed importante svolgimento della cromatina a causa di un’intensa attività di trascrizione in quel punto del cromosoma.

Genoma dei ciliati

Ciliati: organismi unicellulari appartenenti al regno dei protisti, del quale rappresentano i più sviluppati e differenziati. Il termine “ciliati” è dovuto al fatto che la loro superficie è completamente o parzialmente ricoperta da ciglia, strutturalmente simili ai flagelli ma più corte e numerose. Sono binucleati con un micro- e un macronucleo:

• Macronucleo —> possiede funzioni vegetative (metaboliche e di sviluppo), costituito da un genoma contenente migliaia di frammenti ognuno dei quali costituisce un gene (poliploide).
• Micronucleo —> serve per la riproduzione ma è assente attività di trascrizione. Diploide, cromosomi classici organizzati in loci.

Quindi il genoma dei due nuclei differisce notevolmente nonostante il macronucleo derivi dal micronucleo.

Come si identificano e contano i mutanti batterici?

• L’identificazione è possibile mediante l’utilizzo di sistemi di selezione che permettono di identificare ed isolare cloni mutanti seguendo alcuni caratteri quali:
  • Biosintesi di aminoacidi
  • Utilizzo degli zuccheri
  • Resistenza agli antibiotici
• Prima di procedere alla trattazione, è necessario fare una distinzione tra batteri auxotrofi (incapaci di sintetizzare molecole essenziali) e prototrofi (ovvero batteri in grado di sintetizzare con il proprio metabolismo tutte le molecole essenziali).
• Selezione per mutanti della biosintesi di un aminoacido (triptofano): si vogliono cercare, a partire da una coltura batterica, i ceppi batterici mutanti, ovvero non in grado di sintetizzare triptofano diversamente dai ceppi wild-type (wt). Questi mutanti saranno perciò definiti trp- e saranno costretti ad importarlo dall’esterno, e potranno crescere solo su terreni colturali arricchiti con triptofano.
• Il ceppo wt, naturalmente in grado di sintetizzare l’aminoacido, viene quindi di conseguenza definito trp+. Questi saranno quindi in grado di crescere tranquillamente sia su terreno minimo (non addizionato con trp), che su terreno di coltura arricchito con l’amminoacido in esame.

Si parte da una coltura batterica costituita da mutanti e wt; per prima cosa viene seminato un campione di coltura su un terreno arricchito con trp; si osserverà lo sviluppo di colonie che saranno costituite da wt ma anche da mutanti. In questo modo non saremo in grado di distinguere le cellule mutanti da quelle wt; a questo scopo viene adoperata una tecnica nota come replica plating che, essenzialmente permette di effettuare una “copia” della piastra madre appoggiando delicatamente su di essa un disco di velluto sterile in modo da farvi aderire qualche cellula per ciascuna colonia. Questo disco viene poi “premuto” su piastre secondarie (sempre sterili) in cui è presente invece un terreno colturale “minimo”, in modo che le cellule vi si depositino: su di esso si osserverà lo sviluppo di colonie batteriche che avranno disposizione identica a quella della master plate. Osservando e confrontando la master plate con le piastre secondarie sarà possibile riconoscere le colonie mutanti da quelle wt: sapendo infatti che il terreno di coltura presente nelle piastre secondarie permette lo sviluppo delle sole cellule wt (manca il triptofano), le colonie non presenti su di essa ma presenti sulla master plate, saranno quelle mutanti.

Genomi dei procarioti

• Indagati mediante genomica comparata (confronto tra sequenze genomiche), mettono in luce:
  • La presenza di genomi multipartiti
  • La presenza di molecole di DNA circolari e lineari
  • Un alto grado di variabilità
• E. coli K12 —> primo ad essere stato completamente sequenziato
• Plasmidi: sono piccole molecole di DNA circolare a doppia elica di origine batterica; contengono pochi geni e non sono essenziali alla vita della cellula, in quanto la loro presenza in genere conferisce proprietà metaboliche uniche come la capacità di resistere ad un determinato antibiotico. Sono distribuiti alle cellule figlie sia per coniugazione (fattore F) sia attraverso la divisione cellulare.

La coniugazione batterica

• La coniugazione batterica è un processo attraverso cui una cellula batterica trasferisce porzioni di materiale genetico (DNA) ad un’altra tramite un contatto cellula-cellula.
• Avviene mediante la sintesi, da parte di una delle due cellule di un “ponte citoplasmatico” (che permette il trasferimento di DNA), e di pili sessuali che permettono alle due cellule di avvicinarsi e di prendere contatto.
• La coniugazione è possibile tra cellule contenenti un plasmide particolare detto plasmide F⁺ (cellule donatrici F⁺) e cellule mancanti dello stesso (cellule riceventi F^-). Solo le cellule donatrici possono sintetizzare i pili sessuali in quanto le informazioni necessarie sono localizzate sul plasmide F. A seguito della condivisione, i pili vengono degradati in quanto di per sé molto instabili.
• Attraverso il ponte citoplasmatico passa un singolo filamento di DNA, derivato dal taglio operato su una delle due eliche del plasmide del donatore: il taglio genera un’estremità 5’ che viene “srotolata” attraverso il ponte arrivando sin nella cellula ricevente; nel donatore si attiva il meccanismo di replicazione a “cerchio rotante” che rimpiazza il filamento di DNA in condivisione usando come stampo il filamento circolare non tagliato. Nello stesso tempo, nella cellula ricevente viene sintetizzato il filamento complementare. Si generano dunque due cellule F⁺, e il trasferimento completo del plasmide può richiedere un tempo variabile e specie-specifico.
• Occasionalmente il plasmide F può integrarsi nel cromosoma batterico mediante ricombinazione sito-specifica, in corrispondenza di regioni di DNA omologhe tra cromosoma batterico e plasmide F (sequenze di inserzione IS). La cellula risultante viene quindi definita Hfr (high frequency of recombination) ovvero “ad alta frequenza di ricombinazione”. La coniugazione è ancora possibile con cellule F^- e in particolare:
  • F⁺ x F^- —> 2 F⁺
  • Hfr x F^- —> la coniugazione coinvolgerà anche loci cromosomici: in questo caso infatti oltre al DNA plasmidico, verrà trasferito parte del DNA cromosomico proprio perché il fattore F si è integrato nel cromosoma batterico. Date le dimensioni del cromosoma principale, il ponte citoplasmatico si rompe prima che venga esso venga completamente replicato, quindi la cellula ricevente (F^-) riceverà solo una parte del plasmide F (quindi rimarrà F^-) e generalmente solo una porzione del cromosoma donatore, in relazione alla durata dell’evento di coniugazione. Nella cellula ricevente, una volta degradato il ponte citoplasmatico e terminata la coniugazione, il frammento di DNA (contenente parte del plasmide F della cellula donatrice e parte dei suoi loci cromosomici) appena introdotto può andare incontro a due eventi di ricombinazione andando ad integrarsi nel cromosoma e generando una cellula ricombinante. La cellula ricevente si troverà quindi in uno stato di diploidia parziale in quanto saranno presenti due copie di determinati loci genici.
  • Il plasmide F può anche escindersi dal cromosoma in cui si è integrato, ed occasionalmente tale escissione può essere “imperfetta” e tale per cui il plasmide F, staccandosi dal cromosoma, porta anche alla delezione di uno o più loci genici. La cellula così originata verrà definita F’ e se andrà incontro a coniugazione con una cellula F⁺, trasferirà in questa un plasmide F che potrà contenere geni già presenti sul cromosoma della ricevente, che presenterà diploidia parziale per quei geni portati dal plasmide.

Mappatura dei geni batterici per coniugazione interrotta

• L’esperimento sfrutta la coniugazione tra una cellula Hfr (che ha il plasmide F integrato nel proprio cromosoma) e una cellula F^-, interrompendo ad intervalli regolari il processo mediante agitazione meccanica che blocca l’ulteriore passaggio di materiale genetico tra le due cellule (rottura ponte citoplasmatico).
• Per poter creare una mappa “oraria” (in cui la distanza tra i locus genici è espressa in unità di tempo, minuti) è necessario però che donatore e ricevente possiedano i medesimi loci (loci omologhi) ma in un differente stato allelico (ad esempio il ricevente possiede tutti alleli dei marcatori genici recessivi), in modo da poter selezionare dopo ogni interruzione della coniugazione le cellule riceventi che, attraverso un doppio evento di coniugazione, hanno integrato nel proprio cromosoma il frammento del DNA del donatore appena replicato. Più tempo dura la coniugazione, più materiale genetico attraversa il ponte citoplasmatico. Inoltre i donatori devono essere sensibili ad un determinato antibiotico in modo da uccidere selettivamente tali cellule e isolare quindi le riceventi da poter selezionare.
• Ad esempio, al tempo t=0 si forma il pilo sessuale, le due cellule si avvicinano e si instaura il ponte citoplasmatico. Dopo 2 minuti interrompo la coniugazione mediante agitazione termica e vado a selezionare le cellule riceventi, osservando se vi è stata ricombinazione del frammento lineare introdotto (e replicato) durante il piccolo intervallo di tempo in cui è durata la coniugazione: se si osserva ad esempio che le cellule riceventi, prima incapaci di sintetizzare un particolare amminoacido (ad esempio la leucina) e di crescere quindi in un terreno mancante di questo aa, ora possono farlo, significa che durante quell’intervallo di tempo (2 min.) il donatore è riuscito a trasferire il gene leu+ che è stato stabilmente integrato nel cromosoma ricevente; in questo modo la cellula ricombinante è in grado di avviare le tappe per la biosintesi dell’amminoacido e di sopravvivere anche in sua assenza su un terreno minimo.
• Il processo si ripete più volte, analizzando di volta quale locus è stato introdotto ed integrato nel genoma del ricevente, fino a quando dopo una mezz’ora il ponte citoplasmatico si rompe naturalmente (i pili sessuali sono molto instabili) e la coniugazione si interrompe. Come faccio a mappare quindi tutto il resto? Sarà necessario utilizzare più ceppi Hfr, in quanto i vari ceppi Hfr hanno il fattore F integrato in siti diversi e secondo diversi orientamenti. Se usassimo sempre lo stesso ceppo ci troveremmo sempre nella solita situazione, e non potremo capire l’ordine degli altri geni che verrebbero trasferiti se il ponte non si disgregasse. IMPORTANTE: l’ordine dei geni sul cromosoma rimane lo stesso tra i vari ceppi Hfr. Quello che cambia è il punto di inserzione e l’orientamento del plasmide F sul cromosoma questo si traduce in un diverso ordine di trasferimento dei geni dal donatore al ricevente. Allineando le sequenze saremo in grado di determinare quale sia la sequenza dei locus genici in termini di unità di tempo sul cromosoma del donatore, ma non avremo indicazioni sulla distanza fisica degli stessi.

La trasformazione batterica

• È un processo che implica sempre la presenza di un donatore e di un ricevente, ma in questo caso:
  • Il donatore non è una cellula viva, bensì un frammento di DNA nudo, libero nell’ambiente extracellulare internalizzato dalla cellula ricevente.
• La trasformazione può avvenire naturalmente in quanto alcune cellule batteriche (es. Bacillus subtilis) sono naturalmente “competenti”, ovvero sono in grado di internalizzare frammenti di DNA dall’ambiente esterno (ad esempio a causa di lisi di una cellula donatrice); altre trasformazioni sono “ingegnerizzate”, e guidate in laboratorio dove cellule batteriche naturalmente incapaci di introdurre frammenti di DNA (non competenti), vengono rese competenti o con metodi chimici (utilizzo di CaCl₂) o metodi fisici.