Immunologia, prof Granucci

Introduzione

Immunità: resistenza alle malattie infettive di un soggetto.

Immunologia: studio del sistema immunitario che è un insieme di organi che insieme mediano la resistenza alle infezioni.

Risposta immunitaria: reazione coordinata del sistema immunitario nei confronti dell’agente infettivo.

La funzione principale del sistema immunitario è quella di rispondere ed eliminare le infezioni; tuttavia possiede anche altre funzioni secondarie.

Edward Jenner

È considerato il padre dell’immunologia. Nel 1796 ha sviluppato il primo vaccino contro il vaiolo. Il vaccino è stato sviluppato prelevando del materiale biologico da vacche infette ed iniettandolo nel soggetto interessato. Questo processo è noto come “vaiolazione”. L’essicazione del materiale prelevato garantiva l’uccisione del virus patogeno. Nel 1979 si è registrato l’ultimo caso di vaiolo. Nel 1980 avvenne la scoperta degli anticorpi tramite studi sul siero di sangue di alcuni animali.

Antigene

Molecola riconosciuta dall’anticorpo; è un termine estremamente generico. Non tutti gli antigeni sono necessariamente patogeni.

Funzioni del sistema immunitario

• Protezione da organismi patogeni: senza sistema immunitario la vita non è possibile.
• Rimozione del materiale biologico morto: mantenimento dell’omeostasi dei tessuti.
• Riparo delle ferite.
• Protezione dai tumori: riconosce cellule trasformate e/o anormali.
• Argina qualsiasi corpo non-self: rigetto dei tessuti trapiantati, confinamento corpi esterni in cisti.

Il sistema immunitario tende quindi a mantenere costante l’integrità self dell’individuo.

Organizzazione del sistema immunitario

Barriere esterne

Difese fisiche anatomiche come epiteli e mucose grazie alla presenza di tight junctions. A livello della cute lo strato di cheratina costituisce una barriera fisica resistente. Anche la flora intestinale costituisce una barriera esterna. Il sistema immunitario si attiva quando il patogeno supera le barriere esterne che in generale sono: epiteli, mucose (respiratorie, intestinali, uro-genitali), lacrime, saliva, microrganismi commensali.

Barriere interne

Il sistema immunitario può essere considerato la barriera interna anche se non c’è una definizione precisa per questo sistema.

Sistema immunitario innato

Rappresentato da una serie di molecole come quelle facenti parte della cascata del complemento, le proteine della fase acuta che facilitano il riconoscimento dei batteri e i macrofagi (in generale cellule fagocitarie). Il sistema immunitario innato si attiva dopo poche ore dall’infezione ed è quindi la prima forma di immunità. È presente in tutti gli esseri viventi. Senza immunità innata non sarebbe possibile la vita. Gli invertebrati hanno una immunità innata molto sviluppata ma aspecifica.

Immunità adattativa

È antigene-specifica e comparve circa 500 milioni di anni fa con la comparsa dei primi vertebrati. Si divide in immunità umorale (anticorpi) e immunità mediata da cellule. L’immunità adattativa ha una alta capacità di riconoscimento del patogeno presente ed è un tipo di immunità molto specifica.

La memoria immunologica è un grosso vantaggio evolutivo per quegli individui che conducono una vita lunga. Per questo motivo l’immunità adattativa si è coevoluta con i vertebrati. Alcuni antigeni sono immunogenici (attivano il sistema immunitario) mentre altri no (ad esempio una proteina purificata).

Anatomia del sistema immunitario

Organi linfoidi

• Linfoidi I: midollo osseo e timo. Sono il sito di differenziamento delle cellule del sistema immunitario.
• Linfoidi II: linfonodi, appendice, milza, placche del peyer, tonsille e adenoidi. Qui risiedono le cellule del sistema immunitario e si attivano le risposte immunologiche.

I vasi linfatici portano la linfa (liquido interstiziale) ai linfonodi per controllarne la purezza. Nel timo si producono le cellule T mentre gli altri tipi di cellule sono prodotti nel midollo osseo.

Midollo osseo

Tessuto in cui si differenziano sia le cellule del sangue che quelle del sistema immunitario. Le staminali ematopoietiche (pluripotenti) si trovano principalmente nelle cavità delle ossa brevi ma in generale nel midollo osseo. Queste cellule possono automantenersi e quando proliferano lo fanno con divisioni asimmetriche. Dalla staminale ematopoietica deriva sia la linea mieloide che quella linfoide. Il primo differenziamento della linea linfoide porta alla formazione della cellula progenitrice linfoide che produrrà le cellule T, B e NK. Le cellule B e T portando i recettori membranali fanno parte dell’immunità adattativa mentre le cellule NK fanno parte di quella innata. Le cellule B diventeranno plasmacellule che producono gli anticorpi. La linea linfoide è correlata all’evoluzione dei vertebrati. Il primo differenziamento della cellula staminale può anche produrre la cellula progenitrice della linea mieloide da cui si originano: cellule dendritiche e il precursore dei monociti e granulociti. I monociti produrranno poi i macrofagi.

Granulociti (neutrofili, basofili, eosinofili), cellule dendritiche, mastociti e macrofagi fanno parte dell’immunità innata. Il processo di differenziamento è mediato da fattori solubili che si chiamano genericamente “citochine”. Le citochine determinano la sopravvivenza e differenziamento delle cellule del sistema immunitario.

Linea mieloide

Granulociti

• Neutrofili (50-70%): rappresentano quasi il 70% dei globuli bianchi. Sono le cellule che vengono subito richiamate al sito infiammatorio. Limitano l’infezione e garantiscono i processi di riparo. Hanno una vita di al massimo 48h e quindi sono difficili da studiare in coltura. Hanno attività fagocitaria.
• Eosinofili (4%): intervengono nell’immunità di tipo II che ci difende da parassiti pluricellulari.
• Basofili (1%): anche loro coinvolti nell’immunità di tipo II.

Le reazioni allergiche rientrano nell’immunità di tipo II perché la loro funzione fisiologica è di difesa da parassitismo.

Monociti/Macrofagi

Nel sangue sono presenti solo i monociti. I macrofagi sono presenti in altri tessuti. I monociti sono i precursori dei macrofagi. Essi sono riversati nel tessuto infiammatorio dove si trasformano in macrofagi. I macrofagi hanno attività fagocitaria. In condizioni omeostatiche i macrofagi servono ad eliminare le sostanze rilasciate dalle cellule morte. I macrofagi hanno anche effetto trofico verso il sistema nervoso periferico.

Piastrine

Servono per riparare i vasi sanguigni danneggiati.

Linea linfoide

Linfociti

• T: 70% dei linfociti. Hanno proprietà citotossiche e quindi fanno parte dell’immunità cellula-mediata.
• B: consentono l’immunità umorale dato che producono gli anticorpi.

Sistema linfatico

Attraverso i vasi linfatici la linfa è portata ai linfonodi dove viene controllata.

Vasi

Sono capillari che terminano a fondo cieco nei tessuti. In questi vasi penetra il liquido interstiziale composto dai cataboliti prodotti dal normale metabolismo cellulare. Anche il liquido del sangue viene drenato dai vasi linfatici. La linfa è una miscela molto eterogenea ma contiene essenzialmente cellule del sistema immunitario. Nell’uomo la linfa scorre solo verso l’alto (verso i linfonodi) e il suo movimento è dato dal movimento del corpo. La unidirezionalità è data da valvole di non ritorno presenti nei capillari. I vasi linfatici afferenti portano la linfa ai linfonodi.

Linfoedema

Blocco della circolazione linfatica.

Linfonodo

Stazione di controllo della linfa. Se c’è un’infezione, nei linfonodi (presenti in grappolo) si ha attività di lotta contro l’infezione. La linfa che esce dall’ultimo linfonodo del grappolo viene portata al sangue dai capillari efferenti. I linfonodi sono considerabili degli organi. Sono composti da:

• Capsula: tessuto esterno.
• Parenchima: corteccia e midollare.

La linfa è rilasciata subito sotto alla capsula, qua si trovano infatti grandi popolazioni di macrofagi subcapsulari. La regione corticale è la zona delle cellule B, nella zona paracorticale si trovano invece le cellule T. Sono presenti anche cellule dendritiche diffuse. Nella regione midollare si organizzano i vasi linfatici efferenti. Le cellule B e T arrivano al linfonodo attraverso il sangue. Le venule a endotelio alto servono a distribuire i linfociti. Il linfonodo è una struttura dinamica e le cellule B e T non sostano molto all’interno dello stesso linfonodo. In caso di infezione i linfociti vengono bloccati nel linfonodo. La densità cellulare della corteccia è superiore a quella del midollo.

Milza

Punto in cui gli antigeni del sangue arrivano. È un organo che produce e degrada eritrociti. Il parenchima è diviso in polpa rossa (ricca di eritrociti e macrofagi) e polpa bianca (regioni sparse ricche di cellule linfocitiche). La polpa bianca è divisa in zona cellule B e zona cellule T; la regione marginale è invece ricca di macrofagi e avvolge la polpa bianca. I linfociti entrano attraverso le venule ad endotelio alto. La milza è drenata da vasi linfatici ed è considerabile una stazione di controllo della linfa.

Sistema immunitario associato alle mucose

Le mucose interessate sono quelle respiratorie, gastro-enteriche e uro-genitali. Le mucose sono a stretto contatto con gli epiteli. A livello delle placche del peyer le cellule epiteliali sono interdigitate da cellule M che consentono il passaggio regolato di antigeni dal lume intestinale. Le placche sono drenate dai vasi linfatici e la linfa è portata ai linfonodi mesenterici. A questi linfonodi arriva anche la linfa che deriva direttamente dalla mucosa. Le cellule epiteliali costituiscono la prima barriera immunitaria. Anche a livello della mucosa bronchiale sono presenti cellule del sistema immunitario. Associate alla mucosa sono presenti delle zone ricche di cellule B dette “linfonoduli”. Sotto le cellule epiteliali si trovano sempre le cellule del sistema immunitario. Associate al tratto respiratorio ci sono le Adenoidi e le Tonsille; entrambe organizzate come un linfonodo.

Timo

Nel timo maturano le cellule T, è situato retrosternalmente vicino al cuore ed è formato da due lobi. Ogni lobo è costituito da lobuli che si dividono in regione midollare e corticale. Nella zona corticale arrivano i timociti provenienti dal midollo osseo e che matureranno a cellule T. In questa zona ci sono anche delle cellule epiteliali con funzione trofica. Nella regione midollare si trovano le cellule T mature, le cellule epiteliali midollari, macrofagi e cellule dendritiche. Dopo i 20 anni il timo si degrada e restano solo gli abbozzi timici. I corpuscoli di Hassall producono citochine: dei fattori chimici fondamentali per la sopravvivenza delle cellule del timo. Le cellule T escono dal timo attraverso la circolazione sanguigna.

Anticorpi

Elementi espressi o secreti dalle cellule B. Se secreti, fanno parte dell’immunità umorale, se espressi sulla superficie delle cellule B servono a riconoscere l’antigene. Sono anche detti immunoglobuline (Ig). Gli anticorpi sono proteine prodotte dalle cellule B e sono in grado di legarsi in maniera specifica all’antigene.

Le due catene pesanti H sono legate covalentemente da due ponti disolfuro mentre le due catene leggere L sono legate alle catene H da un solo ponte. Alla regione N-terminale delle catene H e L si trova il sito di riconoscimento per l’antigene. I due siti di legame per l’antigene sono altresì identici. Le catene L e H sono formate da una regione variabile (N-t) e una regione costante (C-t). L’insieme delle regioni variabili costituisce il sito di legame per l’antigene. I domini Ig sono 2 nelle catene L e 4 (o 5) nelle catene H. Hanno la caratteristica di essere resistenti agli attacchi proteolitici.

Utilizzo della papaina e pepsina

Utilizzando la papaina gli anticorpi sono tagliati sopra i ponti disolfuro delle catene H e si dividono in 3 frammenti:

• Fc (frammento cristallizzabile): porzione costante della catena H.
• Fab: porzione che lega un antigene (frammento monovalente). Ogni anticorpo porta due frammenti Fab.

La pepsina taglia sotto i ponti disolfuro e si ottengono i frammenti:

• Fc
• F(ab) : regione bivalente perché porta entrambi i siti di riconoscimento.

Regione ipervariabile

Regione che collega i β-foglietti della porzione variabile. In tutto sono 3 per ogni catena. Sono anche dette regioni CDR (Complementary Determining Region 1, 2 e 3). Nella parte variabile ci sono 7/8 β-foglietti. Queste regioni costituiscono il sito di legame dell’antigene. Le regioni CDR sono complementari alla porzione di antigene riconosciuta dall’anticorpo.

Regione framework

Regioni della porzione variabile che si interpongono tra le CDR. Sono 4 su entrambe le catene.

Immunocomplesso

Insieme di anticorpo più antigene. La regione cerniera dell’anticorpo consente il movimento dei due bracci dell’anticorpo.

Un anticorpo riconosce molecole di qualsiasi natura nella loro forma nativa. Possono anche riconoscere piccole molecole dette “apteni”. L’anticorpo lega l’antigene attraverso piccole regioni di interazione, un buon anticorpo è in grado di legare l’antigene in modo pressoché irreversibile seppur i legami siano non-covalenti; questo è dato dall’alta affinità di legame. Nell’insieme, numerosi legami deboli posso portare ad una alta affinità.

Epitopo

Regione dell’antigene riconosciuta dall’anticorpo. Diversi epitopi sono riconosciuti da anticorpi diversi. Uno stesso antigene può portare diversi epitopi. Gli epitopi possono essere di sequenza amminoacidica o di conformazione 3D. Antigeni multivalenti sono molecole con lo stesso epitopo ripetuto più volte, come i batteri g-.

Affinità, avidità e specificità

Affinità: forza di interazione tra anticorpo e antigene.

Avidità: forza complessiva di interazione che rappresenta la soglia di attività. Questa soglia è raggiunta da un solo anticorpo con alta affinità o polimeri di anticorpi a bassa affinità.

Specificità: capacità dell’anticorpo di legare un singolo antigene.

Cross reattività: proprietà di anticorpi che possono riconoscere antigeni diversi. L’affinità per i vari antigeni rimane invariata.

Isotipi

Le classi di anticorpi sono IgG, IgM, IgD, IgA, IgE e sono determinate dalla regione costante della catena H. IgG e IgE sono secrete come monomeri ma le IgE non stanno in circolo bensì si associano ai mastociti. Le IgD sono invece di membrana. Le IgM sono secrete come pentameri mentre le IgA come dimeri; quest’ultime sono importanti nella mucosa intestinale.

Gli isotipi sono importanti perché le cellule del sistema immunitario innato esprimono dei recettori che riconoscono le porzioni Fc degli anticorpi. Essi possono raggiungere quasi le 10 isoforme diverse e quindi è impossibile che ci sia un solo gene che codifica per tutto. La variabilità è dovuta a dei meccanismi di ricombinazione che agiscono sia sulla catena L che su quella H. Nei due loci, per la porzione variabile, sono presenti diversi segmenti detti V e J che riarrangiano originando il segmento VJ che codifica per la porzione variabile della catena L. Per la catena H il riarrangiamento porta alla formazione del segmento VDJ ma la meccanicistica resta la stessa. La catena H è dunque formata dalla porzione variabile VDJ e dalla porzione costante. La ricombinazione somatica del DNA porta a prodotti non ereditabili. I recettori dell’immunità innata sono invece ereditabili; le regioni variabili degli anticorpi invece non lo sono.

Catena L

• λ: 30V, 4J + C λ.
• K: 40V, 5J + C k.

Catena H

• 40V, 25D, 6J + C μ.

Ricombinazione

Avviene nel midollo osseo quando le cellule B vanno incontro a maturazione. Nella catena H prima riarrangia D con J e poi DJ riarrangia con V. Vicino a VDJ ci sono delle sequenze dette “Segnale della ricombinazione” che sono formate da un ettamero conservato vicino alle sequenze codificanti, uno spaziatore variabile di 12 o 23 nucleotidi ed un nonamero conservato. Nel caso delle catene H gli spaziatori 12 sono vicini a D, mentre quelli 23 sono vicini a V e J. Le ricombinazioni avvengono tra segmenti con spaziatore 23 e 12 (Regola 12-23); in questo modo il riarrangiamento è direzionale. Per la catena L vale la stessa regola ma vicino ai segmenti V e J possono esserci entrambi gli spaziatori.

Oltre alla regola 12-23 le sequenze segnale devono andare nella stessa direzione e tutto ciò che è interposto tra di esse viene exciso. Sono coinvolte le proteine Rag 1 e 2 (Ricombination Activating Gene). Le Rag si legano alle sequenze spaziatrici per generare un repertorio casuale di anticorpi. Rag 1 e 2 avvicinano i due segmenti e poi determinano una Double Strand Brake nelle sequenze segnale della ricombinazione. Si hanno due estremità 3’ e 5’ libere che si legano per chiudere il DNA (forcina). Interviene ora un complesso proteico che riapre la forcina sui segmenti V e J riaprendo il DNA con due filamenti estesi (SSB). Ora la TdT-polimerasi aggiunge nucleotidi random al 3’OH libero ed una ligasi infine chiude i buchi.

1. Rag 1 e 2 legano le sequenze segnale.
2. Rag tagliano a doppio filamento i segmenti segnale (estremità blunt).
3. Formazione delle forcine.
4. Il complesso proteico Ku si lega alle forcine e taglia a singolo filamento. Le forcine vengono aperte presentando due filamenti che protrudono. I nucleotidi dei filamenti sporgenti sono detti P; Palindrome è una sequenza di P-nucleotidi. Sequenze di n P-nucleotidi sono formate da n/2.