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Il sistema dei microRNA neuronali

Appunti di Neurobiologia molecolare sul sistema dei microRNA neuronali basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Presutti dell’università degli Studi La Sapienza - Uniroma1, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Neurobiologia molecolare docente Prof. C. Presutti

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È un modello di LTF che sta per Long-Term Facilitation. Però in questo lavoro si parla di

un modello un po’ più complesso che è quello della sensibilizzazione, ossia

l’associazione di due stimoli (e questo ci serve anche per richiamare il lavoro di cui

abbiamo parlato, di Drosophila) in parallelo: in questo caso uno stimolo meccanico sul

sifone e uno stimolo elettrico sulla coda. Per cui si ha la stimolazione del sifone che

porta all’attivazione di un primo neurone sensoriale e quindi del motoneurone che sta

a valle; ma lo stimolo negativo, in questo caso lo stimolo elettrico, porta all’attivazione

di un secondo neurone sensoriale, che percepisce l’informazione a livello della coda,

che attiva un interneurone (questa è una sinapsi eccitatoria sul primo neurone

sensoriale) quindi l’interneurone aumenta proprio la trasmissione a livello della

terminazione assonica del neurone sensoriale numero uno. Alla fine l’effetto è che lo

stimolo tattile sul sifone è amplificato dallo shock elettrico, per cui si ottiene una

contrazione maggiore della branchia.

Questo è il modello, trasferito in coltura cellulare, utilizzato per studiare il ruolo del

miR-124. Come in questo lavoro si arriva al miR-124 ne

abbiamo parlato l’altra volta. In Aplysia, come

nei mammiferi, il miR-124 è il miRNA più

espresso e, in questo lavoro, viene espresso

nei neuroni sensoriali, ma nn nei

motoneuroni. Tutto il lavoro è stato un

sistema di co-coltura, in cui si può ricreare un

meccanismo di plasticità sinaptica dando 5-

HT (5-idrossitirosina), quindi

serotonina, e si può ricreare LTF se si danno dei pulse, dei trattamenti ripetuti di 5-HT. 4

Una sola stimolazione nn porta quei processi di cui abbiamo parlato, che

 implicano quindi sintesi proteica, in condizioni normali (STF).

Per avere un modello di memoria a lungo termine sono necessari 4 pulse di 5-

 HT (LTF.

Il lavoro parte con un clonaggio di miRNA del sistema nervoso di Aplysia, costituito dai

gangli che vengono isolati e da cui poi vengono presi i neuroni sensoriali e

motoneuroni. Questa è l’immagine a contrasto di fase del

motoneurone e dei neuroni sensoriali;

questa è un’ibridazione in situ per studiare

l’espressione del miR-124 e del miR-184:

mentre il miR-124 è presente solamente nei

neuroni sensoriali, sia nel soma che nei

processi dendritici, il miR-184 è presente sia

nei motoneuroni che nei neuroni sensoriali.

La prima informazione, quindi, è che il miR-

124 è presente solamente nei neuroni

sensoriali.

Se queste cellule vengono trattate con 5-HT, nell’ibridazione in situ, rispetto al

controllo nn trattato, in seguito al trattamento si ha down-regolazione dei miR.

Qui è meno evidente rispetto al dato quantitativo che loro riportano nel lavoro, quindi

quantificazioni fatte anche con altri approcci. Cmq, a maggiore ingrandimento, questo

è il soma del neurone sensoriale nn trattato e trattato con 5-HT.

Quindi si ha down-regolazione del miR-124 che porta ad una up-regolazione dei livelli

di CREB. Ma percorriamo i vari step per arrivare a questa conclusione. La down-

regolazione avviene con una cinetica particolare, per cui il trattamento con 5-HT porta

a 2 ore già ad un massimo della down-regolazione, quindi dei livelli del miR maturo

presenti (tramite Northern blot, ma la figura nn me la fa prendere). Questa down-

regolazione permane fino alle 12 ore, quando si torna ad un livello più o meno di

5

partenza. La cosa interessante è che se fanno un’analisi del real time (nn del Northern

blot) dei livelli del precursore del miR-124, questo nn cambia. Questo a dire che la

serotonina agisce probabilmente a questo livello: loro nn vedono un aumento del pre-

miR (probabilmente nn c’è aumento di trascrizione), ma c’è aumento di

processamento. Quindi il livello del pre-miR è costante a diverse ore dal trattamento,

diminuiscono i livelli del miR maturo. Questo per corroborare l’ipotesi di cui avevamo

già parlato, cioè che l’attivazione sinaptica determina una modulazione

dell’espressione dei miRNA attraverso diversi meccanismi e uno di questi è

un’interferenza nel pathway di biosintesi. In questo caso particolare un’attivazione del

taglio di DICER, che è responsabile della liberazione del dsRNA (double strand RNA:

RNA a doppio filamento) dal loop, per permetterne poi l’incorporazione in RISC.

Avevamo accennato agli altri meccanismi. Meccanismi trascrizionali : un aumento

del’espressione dei miR. Nel caso del miR-124, in una situazione di attivazione

sinaptica si ha un’attivazione dei fattori di trascrizione neurospecifici, quindi che si

legano a sequenze regolatrici, se sono presenti, sul promotore del miR e attivano la

trascrizione. L’altro meccanismo era quello dell’attivazione del suo trasporto alle

terminazioni dendritiche. E poi l’altro meccanismo, che abbiamo visto funzionare ad

esempio in Drosophila, è quello di modulare, attraverso modifiche post-traduzionali

delle proteine del complesso RISC, l’attività di RISC stesso.

Quindi la prima conclusione è che il miR-124 viene down-regolato dalla serotonina. La

sua down-regolazione passa attraverso una cinetica particolare, quindi è stabile nel

tempo fino a 10 ore, e dipende probabilmente da DICER.

Questo è importante. Delle basi molecolare della plasticità, in particolare di questi

modelli di plasticità in Aplysia si sa molto. Si sa, ad esempio, che la plasticità mediata

dalla serotonina passa attraverso diverse vie di segnalazione del segnale che

interessano chinasi, come la PKA, la MAPK, la PKC e il proteasoma (abbiamo anche

visto come entra il proteasoma nella plasticità sinaptica per Armitage). In questo caso,

si sa che questi effettori della plasticità sono coinvolti anche nell’LTF di Aplysia.

In un esperimento, gli autori hanno fatto un Northern blot per il miR-124 dopo

induzione con serotonina, per indurre appunto l’LTF, in presenza di diversi inibitori, per

la MAPK, la PKA, la PKC e inibitori della sintesi proteica. Vedono che, rispetto a un

controllo di down-regolazione di miR-124 in presenza di 5-HT, la presenza di inibitori

delle MAPK revertono questo effetto. Questo a dire che questi sono probabilmente

degli effettori che si trovano a monte della regolazione del miR-124. 6

Cioè la serotonina va

ad attivare la cascata

delle MAPK, che è

necessaria per

l’inibizione di DICER.

Però si sa che è

necessaria per la down-

regolazione del miR,

attraverso DICER. In

questo caso nn è

coinvolto il

proteasoma, mentre è

coinvolta la MAPK, che

si sapeva essere

coinvolta nell’LTF in cui

si ha attivazione di

CREB. Quindi, MAPK sta

a monte del controllo

dell’espressione di miR-

Effetti fisiologici dell’over- e down-regolazione di miR-124. Questo lavoro

riesce a percorrere tutti gli aspetti: da quello molecolare a quello fisiologico. In questo

caso, l’effetto fisiologico della modulazione del miR viene valutato dal punto di vista

elettrofisiologico, come registrazione dell’LTF. Come la maggior parte di questi

esperimenti, di solito si esaspera l’effetto: sono modulazioni molto fini quelle dei

miRNA. Per vederne l’effetto fisiologico e esserne certi si tratta il sistema prima con un

inibitore del miR. Questo inibitore spiazza il miR e mima l’effetto della down-

regolazione, che avevamo visto essere indotta dalla serotonina. Questo simula l’effetto

in vivo dell’attivazione sinaptica. In questo caso, invece, si vuole contrastare quello

che avviene in vivo up-regolando il miR: si micro iniettano le cellule con un cosiddetto

mimic, che è un dsRNA che poi viene aperto dalle elicasi e fornisce miR-124 attivo al

sistema.

Per visualizzare l’effetto della microiniezione del mimic rispetto al controllo si ha

aumento del segnale dell’ibridazione in situ. In questo caso nn si ha aumento del

segnale e io vi chiedo perché nn si ha aumento del segnale? Questa è un’ibridazione

che viene fatta con una sonda antisenso rispetto alla sequenza del miR, l’inibitore è un

antisenso rispetto al miR e impedisce il caricamento su RISC, quindi miR è sempre lì,

nn viene degradato, l’unica cosa è che nn è funzionale per cui a livello di ibridazione

nn si vede la differenza.

L’effetto dal punto di vista elettrofisiologico è molto importante. Nel caso dell’inibitore

del miR-124, che simula la down-regolazione indotta da serotonina, si ha un aumento

proprio dell’LTF, quindi dell’attività sinaptica. Invece, la over espressione del miR

determina una diminuzione dell’attività sinaptica.

In questo esperimento si fa un

Questo processo è mediato da CREB. Che fosse mediato da CREB, in particolare da

controllo con un saggio di luciferasi

CREB1, loro lo vedono da un esperimento di nuovo molto in vitro in cui trasfettano le

più o meno classico; si utilizzano vari

cellule con un anti-miR, quindi simulano di nuovo la situazione in vivo (della down-

costrutti di luciferasi. Qui, in

regolazione di miR). Vedono che, rispetto a un controllo nn trattato, c’è un aumento di

particolare, guardiamo questo

7

costrutto con tutta la 3’-UTR (cioè la

target sequence per il miR-124) e

quest’altro costrutto che contiene la

CREB1 e un aumento di tutti questi fattori che sono motori molecolari (chinesine) e

fattori di trascrizione a valle di CREB1. Quindi, sicuramente l’azione del miR agisce sul

pathway di CREB, ma nn agisce su CREB2 oppure su un fattore legato alle MAPK.

Quindi CREB1 è coinvolto con il meccanismo più semplice: il miR-124 si lega alla 3’-

UTR di CREB1 in modo piuttosto forte con 12 nt che fanno base pairing con la 3’-UTR

di CREB1. Andando a testare l’attività della

luciferasi, quindi la traduzione della

luciferasi (è un saggio in cui si valuta

la luminescenza prodotta da questo

enzima), si vede che il costrutto con la

3’-UTR wild type, in presenza di un

miR aspecifico, dà questo tipo di

segnale, mentre in presenza del miR-

124, che lega la 3’-UTR, dà un segnale

molto più basso. Questa situazione è

molto più esasperata in presenza di un

costrutto che fa interference, che è un

po’ un controllo positivo estremo in

induce la degradazione della luciferasi. Questo effetto nn è visibile in seguito a

mutazione del sito di binding del miR sulla 3’-UTR di CREB.

L’ultima osservazione che viene fatta è che in presenza di una down-regolazione del

miR, esasperando quello che è l’effetto fisiologico della serotonina, è sufficiente un

unico pulse di serotonina per avere LTF. Quindi il miR in qualche maniera sensibilizza in

questo caso il neurone sensoriale.

Ho introdotto nuove immagini perché è forse uno dei lavori più completi adesso

presenti in letteratura.

MiR-284

Un accenno veloce a questo lavoro che introduce il miR-284. La cosa importante è che

miR-284 riconosce la 3’-UTR della variante B di un recettore per il glutammato, la

subunità GluR-B. il concetto importante è che la subunità GluR-A

viene debolmente targettata, contiene un unico sito

di riconoscimento, da parte del miR-284, mentre la

sub unità GluR-B contiene due siti di

riconoscimento, tra l’altro 8

posizionati distanti in quella che si pensa essere la distribuzione più funzionale ai fini

della inibizione della sintesi proteica. Vedremo come il controllo da parte dei miRNA di

isoproteine dei recettori contribuisce alla varietà dell’output proteico di cui abbiamo

parlato, che è così importante nel sistema nervoso.

In questo lavoro, gli autori hanno creato dei mutanti di delezione per il miR-284.

Hanno visto che:

nel wild type c’è una certa proporzione tra la variante 2B e la variante 2A,

 mentre facendo una delezione del gene del miR-284 c’è uno sbilanciamento con

 una over produzione della variante B (la sub unità con le due sequenze di target

per il miR).

Questo esperimento introduce una rescue: nel mutante viene riespresso il miR-284 e si

vede che si torna a una situazione di tipo wild type. Questo contributo sta a indicare

che anche i miRNA contribuiscono a questa complessità di cui abbiamo parlato,

particolarmente evidente appunto nei recettori per il glutammato.

Questi più o meno sono gli esperimento che vi ho riportato per descrivere il ruolo dei

miR nel sistema nervoso dell’adulto, nei neuroni post-mitotici.

I microRNA NELLO SVILUPPO

Ora vorrei farvi solo degli esempi, anzi un esempio più importante, del ruolo dei miRNA

nello sviluppo. Questo è un campo immenso dove è possibile trovare esempi, modelli

di tutti i tipi.

I miRNA hanno come ruolo primario il controllo sullo sviluppo. Questo si è capito subito

perché il primo miRNA caratterizzato, isolato, era un regolatore di quello che è stato

descritto come il developmental timing in C. elegans.

The C. elegans Heterochronic Gene lin-4 Encodes Small RNAs with Antisense Complementarity lo

Lin-14. 9

Rosalind C. Lee, Rhonda L. Feinbaum, and Victor Ambros. Cell, Vol. 75, 843-854, December 3, 1993

In questo lavoro del ’93, che ha aspettato quasi 10 anni per essere valorizzato,

attraverso la selezione di mutanti di C. elegans (mutanti proprio di questo

developmental timing) che avevano un controllo temporale alterato nello sviluppo

della larva, sono stati isolati diversi geni che, proprio per questa loro funzione, sono

definiti GENI ETEROCRONICI. Il gene che già si conosceva è LIN-41, una proteina che

controlla la scansione, la successione degli eventi nel tempo che portano al

differenziamento della larva.

Quindi si conosceva già LIN-41 come gene eterocronico e in questo lavoro viene

isolato un miRNA, considerato eterocronico perché la sua mutazione cambia proprio i

tempi di sviluppo della larva. La forza di questo lavoro è stata che il fenotipo del

mutante LIN-4 corrispondeva perfettamente al target di LIN-41 (cosa che abbiamo

visto nn essere sempre vera: molto spesso è un effetto indiretto). Per cui il fenotipo di

LIN-4, che loro sanno essere un gene nn codificante, era legato a LIN-41 e questo ha

portato gli autori a fare questa famosa ricerca delle sequenze omologhe (nn l’ho

riportato qui come figura) tra il messaggero di LIN-41 e la sequenza di LIN-4. Quindi, la

fortuna è stata che era un metodo molto semplice e una relazione diretta proprio in

termini di fenotipo.

A livello di sistema nervoso, per studiare il ruolo dei miRNA nello sviluppo del sistema

nervoso si possono utilizzare due approcci:

1. un approccio che riguarda l’interferenza con la biogenesi dei micro

2. e un approccio che guarda allo studio del ruolo di particolari miRNA, quindi la

loro mutazione oppure la loro over espressione.

Nessuno dei due approcci è perfetto, ciascuno ha dato delle informazioni molto

importanti.

1)Ad esempio, bloccare la biogenesi dei miRNA, interferendo con DICER (quindi la

maturazione del pre-) o con proteine di RISC, ha permesso di capire che i miRNA

funzionano molto presto. Ad esempio, per il topo il mutante knock-out per DICER è

letale, il topo riesce però a portare avanti uno sviluppo più o meno normale fino allo

stadio 7.5 (settimo giorno dello sviluppo dell’embrione). Quindi è un mutante letale

per l’embrione. Questo dà un’idea di quanto sia importante il ruolo dei miRNA.

Mutanti per delezione sono stati fatti per Drosophila (Ago-1), per zebrafish (DICER); in

realtà ogni organismo dà una risposta leggermente diversa soprattutto se si opera su

un effettore del pathway di miRNA diversi. La cosa che più o meno è chiara è che i

miRNA funzionano ad un certo livello dello sviluppo, quando si deve avere una

specificazione nn solo cellulare, ma anche un differenziamento delle aree cerebrali,

quindi più precoce o più tardiva a seconda dell’organismo. Quindi, i miRNA

intervengono nella neurulazione, questo sicuramente per il topo, ma probabilmente

intervengono nella fase di differenziamento delle cellule neuronali e, cosa molto

importante, nel mantenimento dell’identità cellulare. Questo è ben descritto negli

esperimenti che riguardano le cellule staminali.

Quindi, i modelli di KO (knock-out) per DICER o per Ago più di tanto nn riescono a dire

perché sono modelli letali. Però l’informazione è molto importante. 10


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16

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1.73 MB

AUTORE

ludide

PUBBLICATO

5 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in neurobiologia
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher ludide di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Neurobiologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università La Sapienza - Uniroma1 o del prof Presutti Carlo.

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