Il sistema dei microRNA neuronali

Un accenno veloce a questo lavoro che introduce il miR-284. La cosa importante è che

miR-284 riconosce la 3’-UTR della variante B di un recettore per il glutammato, la

subunità GluR-B. il concetto importante è che la subunità GluR-A

viene debolmente targettata, contiene un unico sito

di riconoscimento, da parte del miR-284, mentre la

sub unità GluR-B contiene due siti di

riconoscimento, tra l’altro 8

posizionati distanti in quella che si pensa essere la distribuzione più funzionale ai fini

della inibizione della sintesi proteica. Vedremo come il controllo da parte dei miRNA di

isoproteine dei recettori contribuisce alla varietà dell’output proteico di cui abbiamo

parlato, che è così importante nel sistema nervoso.

In questo lavoro, gli autori hanno creato dei mutanti di delezione per il miR-284.

Hanno visto che:

nel wild type c’è una certa proporzione tra la variante 2B e la variante 2A,

 mentre facendo una delezione del gene del miR-284 c’è uno sbilanciamento con

 una over produzione della variante B (la sub unità con le due sequenze di target

per il miR).

Questo esperimento introduce una rescue: nel mutante viene riespresso il miR-284 e si

vede che si torna a una situazione di tipo wild type. Questo contributo sta a indicare

che anche i miRNA contribuiscono a questa complessità di cui abbiamo parlato,

particolarmente evidente appunto nei recettori per il glutammato.

Questi più o meno sono gli esperimento che vi ho riportato per descrivere il ruolo dei

miR nel sistema nervoso dell’adulto, nei neuroni post-mitotici.

I microRNA NELLO SVILUPPO

Ora vorrei farvi solo degli esempi, anzi un esempio più importante, del ruolo dei miRNA

nello sviluppo. Questo è un campo immenso dove è possibile trovare esempi, modelli

di tutti i tipi.

I miRNA hanno come ruolo primario il controllo sullo sviluppo. Questo si è capito subito

perché il primo miRNA caratterizzato, isolato, era un regolatore di quello che è stato

descritto come il developmental timing in C. elegans.

The C. elegans Heterochronic Gene lin-4 Encodes Small RNAs with Antisense Complementarity lo

Lin-14. 9

Rosalind C. Lee, Rhonda L. Feinbaum, and Victor Ambros. Cell, Vol. 75, 843-854, December 3, 1993

In questo lavoro del ’93, che ha aspettato quasi 10 anni per essere valorizzato,

attraverso la selezione di mutanti di C. elegans (mutanti proprio di questo

developmental timing) che avevano un controllo temporale alterato nello sviluppo

della larva, sono stati isolati diversi geni che, proprio per questa loro funzione, sono

definiti GENI ETEROCRONICI. Il gene che già si conosceva è LIN-41, una proteina che

controlla la scansione, la successione degli eventi nel tempo che portano al

differenziamento della larva.

Quindi si conosceva già LIN-41 come gene eterocronico e in questo lavoro viene

isolato un miRNA, considerato eterocronico perché la sua mutazione cambia proprio i

tempi di sviluppo della larva. La forza di questo lavoro è stata che il fenotipo del

mutante LIN-4 corrispondeva perfettamente al target di LIN-41 (cosa che abbiamo

visto nn essere sempre vera: molto spesso è un effetto indiretto). Per cui il fenotipo di

LIN-4, che loro sanno essere un gene nn codificante, era legato a LIN-41 e questo ha

portato gli autori a fare questa famosa ricerca delle sequenze omologhe (nn l’ho

riportato qui come figura) tra il messaggero di LIN-41 e la sequenza di LIN-4. Quindi, la

fortuna è stata che era un metodo molto semplice e una relazione diretta proprio in

termini di fenotipo.

A livello di sistema nervoso, per studiare il ruolo dei miRNA nello sviluppo del sistema

nervoso si possono utilizzare due approcci:

1. un approccio che riguarda l’interferenza con la biogenesi dei micro

2. e un approccio che guarda allo studio del ruolo di particolari miRNA, quindi la

loro mutazione oppure la loro over espressione.

Nessuno dei due approcci è perfetto, ciascuno ha dato delle informazioni molto

importanti.

1)Ad esempio, bloccare la biogenesi dei miRNA, interferendo con DICER (quindi la

maturazione del pre-) o con proteine di RISC, ha permesso di capire che i miRNA

funzionano molto presto. Ad esempio, per il topo il mutante knock-out per DICER è

letale, il topo riesce però a portare avanti uno sviluppo più o meno normale fino allo

stadio 7.5 (settimo giorno dello sviluppo dell’embrione). Quindi è un mutante letale

per l’embrione. Questo dà un’idea di quanto sia importante il ruolo dei miRNA.

Mutanti per delezione sono stati fatti per Drosophila (Ago-1), per zebrafish (DICER); in

realtà ogni organismo dà una risposta leggermente diversa soprattutto se si opera su

un effettore del pathway di miRNA diversi. La cosa che più o meno è chiara è che i

miRNA funzionano ad un certo livello dello sviluppo, quando si deve avere una

specificazione nn solo cellulare, ma anche un differenziamento delle aree cerebrali,

quindi più precoce o più tardiva a seconda dell’organismo. Quindi, i miRNA

intervengono nella neurulazione, questo sicuramente per il topo, ma probabilmente

intervengono nella fase di differenziamento delle cellule neuronali e, cosa molto

importante, nel mantenimento dell’identità cellulare. Questo è ben descritto negli

esperimenti che riguardano le cellule staminali.

Quindi, i modelli di KO (knock-out) per DICER o per Ago più di tanto nn riescono a dire

perché sono modelli letali. Però l’informazione è molto importante. 10

2)L’altro approccio di cui vi parlavo per capire il ruolo dei miRNA sempre nello

sviluppo, ma nn solo, è andarli a studiare singolarmente. In generale, quando si vuole

conoscere il ruolo, la funzione di un gene, il primo approccio è quello descrittivo:

vedere dove è espresso. Per i miRNA nn è così semplice per i problemi di cui vi ho

detto, bisogna utilizzare degli stratagemmi, delle sonde particolari.

In questo lavoro è stato sviluppato un sistema, che è quello del SENSORE, che

permette di vedere in un’immagine visibile al microscopio dove è espresso il miRNA. È

sempre un’evoluzione del saggio del reporter: viene creato un transgene in cui il gene

per lacZ (che può essere evidenziato in un saggio per il prodotto β-gal) è espresso in

tutto l’individuo (è un knock-in). Se nn c’è niente che interferisce con la sua

espressione dà un topo blu. Questo reporter contiene delle sequenze della 3’-UTR che

sono pensate per legare con una complementarietà perfetta ad esempio dei miRNA.

Se nel sistema è presente il miRNA, questo si lega alle sequenze target presenti a valle

di lacZ e il miRNA ne induce la degradazione; l’effetto interference è molto più potente

dell’effetto dei miRNA, quindi la bontà di questo reporter è che si può spegnere

attraverso un meccanismo di interference però mediato dai miRNA: se c’è il miRNA,

questo si lega alle sequenze e nn si ha espressione di lacZ, là dove è presente miRNA

nn c’è segnale di β-gal, si hanno delle regioni chiare.

Questo sistema è stato utilizzato per andare a vedere dove e come sono espressi i miR

così detti OMEOTICI: miR-10 nelle varianti a e b, miR-196a 1 e 2 e miR-196b, omeotici

perché sono miR intragenici; quindi il loro gene è contenuto all’interno di altri geni e

nel caso particolare all’interno di geni omeotici.

La domanda era: essendo la loro localizzazione intragenica, la loro espressione è

correlata con quella dei geni omeotici? (Perché è più ipotizzabile che le sequenze

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regolatrici siano quelle comuni al cluster dei geni omeotici). Gli autori hanno creato

due topi transgenici per il sensore, in cui il sensore è costruito con il lacZ e al suo 3’

delle sequenze che legano con affinità perfetta miR-10 e miR-196a. L’immagine che

ottengono dai transgeni è che l’espressione del miR sarà in questa regione più chiara,

che corrisponde con l’espressione del roxb-4 (miR-10 appartiene al suo cluster). Lo

stesso per il miR-196. Questo approccio ve l’ho riportato perché è un approccio molto

interessante e viene usato per studiare quei micro più direttamente coinvolti nello

sviluppo del sistema nervoso.

MicroRNA E PATTERNING NEURONALE.

A microRNA controlling left/right neuronal asymmetry in Caenorhabditis elegans

Robert J. Johnston Jr & Oliver Hobert. NATURE VOL 426 DECEMBER 2003.

Come ultimo esempio vi volevo riportare questo lavoro. Anche questo è un lavoro nn

nuovo, però fondamentale (dopo di questo ne sono venuti altri proprio dello stesso

gruppo), che ha destato interesse perché ha chiarito come i miRNA nello sviluppo

siano coinvolti anche nella specificazione dell’identità dei neuroni. In questo lavoro si

parla di asimmetria. Noi sappiamo che la simmetria funzionale è conservata dal verme

all’uomo, ma nn è sostenuta da una simmetria anatomica; quindi c’è un’asimmetria

anatomica, ma una simmetria funzionale e la cosa curiosa di questi miRNA è che sono

coinvolti proprio nel creare nel verme (in un sistema particolare di cui ora parliamo)

questa simmetria funzionale. Nel caso particolare si parla di una asimmetria destro-

sinistro (left-right) del verme relativamente a neuroni chemosensoriali. Nel verme i

recettori per il gusto hanno un ruolo molto importante perché il movimento avviene

per meccanismi di chemotassi: un movimento guidato dalla presenza di un elemento

chimico come può essere l’NaCl. L’NaCl nel brodo di coltura dei vermi è un elemento di

richiamo del verme, che esprime sui neuroni chemosensoriali recettori specifici per

diversi fattori chemotattici che sono di tanti tipi. La cosa importante è che questi

neuroni, descritti come ASEL e ASER, sono diversi perché hanno una funzione diversa,

perché esprimono recettori diversi. 12

In questo sta la simmetria della chemiotassi del verme,

per cui la presenza di funzioni diverse sui due lati

conferisce una reattività particolare all’individuo e quindi

una capacità motoria particolare. Questo è un sistema

molto interessante che viene usato per studiare

meccanismi molecolari dello sviluppo di questi neuroni.

Si è visto che i neuroni ASEL esprimono solo certi

recettori, qua descritti come gcy-6 e 7, mentre i neuroni

ASER esprimono gcy-5 come recettori per la chemiotassi.

Gcy: geni per recettori guanyl ciclasi.

È un sistema semplice, ma molto preciso. I neuroni ASEL e ASER esprimono recettori

In questo esperimento in cui viene util