Glicobiologia 5: La spettrofotometria - Maldi

Corso di tecniche analitiche in glicobiologia

Lezione 5: Spettrofotometria

La spettrofotometria è una metodologia analitica che negli anni si è rivelata essere molto utile ai fini diagnostici, soprattutto per la possibilità di lavorare in soluzioni e miscele più o meno complesse. Nel 1920 la spettrometria di massa richiedeva l’uso di magneti; successivamente sono stati introdotti campi elettrici e non solo magnetici e ciò ha permesso di inserire spettrometri di massa da hangar aeroportuali a stanze di laboratori compatte.

Un grosso limite, tra il 1960 e 1970, era che tutte le parti costituenti lo spettrometro di massa dovevano essere settate, pezzo per pezzo, manualmente con delle manopoline. Quando ci fu il boom dei computer e di tutto ciò che concerne l’interazione tra strumento e controllo di tipo informatico, ci fu il boom anche della spettrometria di massa, che dagli anni ’80 fino ad oggi ha avuto un’evoluzione considerevole. Questo perché molto spesso l’ottima conoscenza del software che gestisce una macchina di per sé rappresenta un buon passo avanti per la buona riuscita di un esperimento di spettrometria di massa.

Si passa dagli anni ’80 ad oggi, dove un intero sistema cromatografico, quindi anche per la separazione multidimensionale, miscele complesse, oligosaccaridi, peptidi, ecc. e lo strumento per l’analisi di queste miscele, cioè lo spettrometro di massa, può essere sistemato sul più piccolo di queste dimensioni.

Storia della spettrometria di massa

Thomson, che fu l’inventore della spettrometria di massa, grazie a ciò vinse il premio Nobel. Successivamente, Fenn e Tanaka hanno vinto il premio Nobel nel 2002 in quanto, grazie agli accorgimenti tecnologici, hanno permesso di utilizzare la spettrometria di massa non solo su polimeri inorganici, ma anche su polimeri biologici.

Campi di utilizzo della spettrometria di massa

In quali campi è utilizzata la spettrometria di massa? L’unico requisito che una molecola deve avere per essere analizzata da questa tecnologia è che questa molecola deve poter essere ionizzata. Dopo di che non c’è limite alle molecole che possono essere analizzate. La spettrometria di massa è molto richiesta in analisi forensi, in quanto è un’analisi molto sensibile che consente anche di identificare analiti presenti in tracce. Negli ultimi anni, un’ulteriore applicazione della spettrometria di massa avviene nell’ambito delle arti, ad esempio nell’ambito del restauro.

Basi della spettrometria di massa

• Deve essere uno ione, quindi una molecola carica.
• Le specie cariche possono essere separate in base al loro rapporto massa/carica.
• Le molecole vengono ionizzate nella sorgente di ioni.
• Gli ioni vengono separati dall’analizzatore.

Una caratteristica della sorgente ionica non è solo quella di dare carica alle molecole, ma anche quella di poter ottenere ioni in fase gassosa. Ciò ci permette di utilizzare qualsiasi analizzatore di massa ottenendo poi dei segnali al detector che ci restituiscono lo spettro di massa, potendo così estrapolare informazioni sul peso molecolare.

Schema generale di uno spettrometro di massa

1. Introduzione del campione.
2. Introduzione per GC (gas cromatografo) o per LC.
3. La sorgente può essere di varia natura, ma quella che noi vediamo è quella ad impatto elettronico (EI), ma esiste anche la ionizzazione chimica (CI), FAB, MALDI ed elettrospray (ES).
4. La separazione di ioni può avvenire mediante l’utilizzo di campi magnetici, campi elettrici, (TOF) time of flight.

A questo punto la strada si separa: possiamo avere il detector direttamente, mentre negli strumenti di ultima generazione dopo una prima analisi degli ioni, possono avvenire esperimenti di frammentazione (MSMS) degli analiti che ci danno altre informazioni. Dopodiché, dopo aver ottenuto lo spettro di frammentazione, i pesi molecolari dei frammenti ottenuti, possono essere ancora una volta mandati al detector.