Glicobiologia 5: La spettrofotometria - Maldi

(ES).

4. La separazione di ioni può avvenire mediante l’utilizzo di campi magnetici, campi elettrici,

(TOF) time of flight.

A questo punto la strada si separa possiamo avere :

Il detector direttamente, Mentre negli strumenti di ultima

quindi l’analisi è generazione dopo una prima analisi

computerizzata. degli ioni, possono avvenire

esperimenti di frammentazione

(MSMS) degli analiti che ci danno

altre informazioni, dopodiché dopo

aver ottenuto lo spettro di

frammentazione, i pesi molecolari

dei frammenti ottenuti, possono

essere ancora una volta mandati al

detector, analizzati, e si può così

ottenere lo spettro di questi

È da tenere bene a mente che tutta questa parte dello spettrometro di massa è sotto vuoto spinto,

ovviamente gli attriti che potrebbero esserci con l’aria potrebbero competere informazioni, ma nel

caso del TOF vedremo che è necessario che tutto sia sottovuoto.

Particolarità:

L’elettrospray divide le sorgenti definite hard da quelle definite soft, le sorgenti hard danno luogo a

frammentazione totale del campione, cioè l’analita supera l’inlet e passa alla sorgente, se sottoposto

ad un tipo di ionizzazione ad impatto elettronico, ha come conseguenza la totale frammentazione

dell’analita. Ma nell’elettrospray, grazie agli accorgimenti di Fenn e Tanaka, non si ha la rottura del

campione, questo viene preservato nella sua interezza, e a meno che non si decida di fare precisi

esperimenti di frammentazione, il campione rimane intatto, quindi lo spettro dell’ analita che

ricaviamo alla fine è relativo all’analita intatto.

La prima informazione che ci da uno spettrometro di massa è quello relativo alla massa degli analiti

presenti, la massa essendo strettamente correlata alla struttura chimica dell’analita, ci permette di

identificare, dal punto di vista qualitativo, gli analiti presenti, inoltre si possono dare informazioni

sulla composizione di una miscela, oppure la purezza del picco cromatografico, per le informazioni

quantitative andiamo con i piedi di piombo. Abbiamo detto che la caratteristica delle molecole che

possono essere analizzate allo spettrometro di massa, è che devono essere ionizzabili e passare in

fase gassosa; i vari analiti hanno diversa capacità di fare ciò ciò dipende dalla loro efficienza di

ionizzazione, che è strettamente correlata con la loro natura fisico-chimica, quindi non è una

grandezza che può essere rifinita

a prescindere osservando la sequenza di una proteina. Quindi a meno che la miscela di analita non

venga modificata, parlare di informazione qualitativa basandosi semplicemente sullo sprettro di

massa, è una questione delicata che va affrontata con la dovuta attenzione.

Abbiamo detto che i metodi di introduzione del campione sono vari, il campione può essere

iniettato direttamente tramite siringa all’interno dello spettrometro di massa, attraverso un gas

cromatografo, o attraverso un HPLC…

Il fisico che ha inventato il Maldi ha studiato tutti i possibili metodi di trasferimento di energia da

una sorgente agli analiti, per avere dei segnali riconducibili al peso molecolare degli analiti.

A meno che una molecola non abbia delle caratteristiche particolari per quanto riguarda gli

orbitali, se io vado a bombardare con un laser “succede quello che pensate cioè che se ne va a quel

paese”, tuttavia il laser fornisce dei vantaggi enormi, poiché costiuisce una fonte di energia

focalizzabile che può trasferire energia sotto opportune condizioni alla miscela di analiti, e grazie a

questo trasferimento è possibile ottenere gli spettri di massa.

Il piatto porta campione è una piastrina, dove

ogni numero corrisponde ad un esperimento. Ad

esempio in posizione 99 io vado a caricare una

miscela di analiti con opportuna matrice, che sarà

diversa rispetto alla miscela presente in 98.

Quindi su una piastrina posso caricare fino a 100

esperimenti. Sulla piastrina che adesso c’è in

dipartimento si possono caricare un numero

ancora maggiore di esperimenti.

Come funziona il MALDI?

C’è una sorgente laser che mi permette la produzione del fascio laser che impatta la piastrina, sulla

quale sarà stato depositato (in blu) l’analita, (in nero) eventuali cationi che inevitabilmente ci si

porta appresso in qualsiasi tipo di esperimento, possono essere sodio o altri cationi, e (in giallo)

abbiamo la matrice.

Cosa è la matrice? La matrice ha la funzione di sovrapporsi tra la sorgente di energia laser e

l’analita, proteggendo quest’ultimo e andando a trasformare quell’energia in qualcosa che possa

essere utilizzabile dall’analita. A una prima occhiata che che caratteristica accomuna queste

molecole? Sono sistemi p greco coniugati, il che garantisce un ottima interazione con la sorgente di

luce. Questo perché avviene la promozione da π a π* (da pgreco a pgreco star), se io fornisco

energia al sistema avviene la promozione allo stato eccitato, al ritornare allo stato fondamentale

avviene un emissione di energia che viene presa dall’analita. Ecco un esempio di alcune matrici che

vengono utilizzate.

Un’ altra cosa in comune di queste matrici, è che sono tutte e 3 acidi, liberano H+ in soluzione,

protonano la mia miscela di analiti, e quindi gli analiti possono essere analizzati.

Questo è quello che succede: viene depositata sulla piastrina una miscela di matrice e analita,

quando viene depositata io non posso inserire la miscela allo stato liquido nello spettrometro di

massa, ma devo aspettare che questa si secchi (si dice cristallizzare, ma non è corretto perché non

c’è niente di cristallino), quando questa si secca si osserva sulla superficie una totale eterogenicità

di matrice e analita, quindi il rapporto matrice/analita su un punto della

piastrina non corrisponderà a quello presente su un altro punto. Questo perchè il processo di

essiccazione è un processo accoppiato all’aumento del disordine del sistema e quindi la superficie

che si genera non è omogenea.

Diverse generazioni dello spettrometro di massa MALDI presenta sempre un joestik in quanto

essendo ogni pozzetto della piastrina infinitesimale, dobbiamo andare a beccare il punto in cui il

rapporto tra matrice e analita è tale da darci una buona risoluzione, e per fare ciò dobbiamo fare

appunto movimenti infinitesimali.

Il laser parte e avviene la ionizzazione in fase gassosa dell’analita e la formazione degli ioni che

saranno MH+, questo per dire che gli ioni che vengono prodotti con la sorgente MALDI sono di

tipo monocarica. Per ogni analita, a prescindere da gli esso sia, viene aggiunta una sola carica.

Questo è fondamentale perché sull’ asse delle x c’è M/Z, se la carica è una ad ogni picco del grafico

corrisponde il peso molecolare dell’ analita intatto.

C’è la parte all’interno dello strumento dove metto la piastrina, sparo con il laser si formano gli ioni

in fase gassosa carichi di energia, a questo punto noi abbiamo le condizioni per porterli analizzare.

L’analisi è il far interagire il nostro analita con qualcosa che ci permette di dedurne il peso

molecolare. La prima cosa che si può fare per analizzarli è usare un campo elettrico di segno

opposto rispetto agli ioni che vogliamo analizzare, in questo modo gli ioni si staccano dalla

piastrina, ma noi non vogliamo che questi una volta staccati passino alla rinfusa all’interno

dell’analizzatore, ma vogliamo che la linea di partenza sia la stessa per tutti in modo tale da andare

a discernere per il tempo di percorrenza del tratto in analisi. Per garantire ciò c’è un ulteriore campo

elettrico all’entrata dell’ analizzatore, che a differenza del precedente deve avere lo stesso segno

degli analiti, perché quando questi partono il campo elettico deve fungere da tappo rallentandoli. Io

decido il periodo di durata del blocco ed ogni tot di tempo il blocco viene tolto si formano così

pacchetti di ioni che passano all’interno dell’analizzatore dove avviene la separazione sulla base del

tempo di percorrenza nello stesso settore.

In base al raccolto questi ioni avranno una diversa permanenza all’interno del tubo di volo. I diversi

pacchetti di ioni non hanno la stessa energia cinetica, ciò che hanno di uguale è la stessa spinta

iniziale, perché il potenziale che io ho messo per staccare gli ioni è lo stesso, ma poi come

quest’energia venga dissipata sottoforma di energia cinetica all’interno del tubo di

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volo, ciò dipende dalla massa. Perché l’energia cinetica è ugaule ad ( per × ) ed m è diversa

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i vari analiti. 2