Glicobiologia - 4

Corso di tecniche analitiche in glicobiologia - Lezione 4

Cromatografia

La cromatografia è un processo di separazione basato su una proprietà chimico-fisica intrinseca della molecola (punto isoelettrico, forma, massa, ecc). Si parla di strumenti diversi, a partire da quelli TLC. TLC è la cromatografia su strato sottile nella quale è presente un supporto rigido (plastica o metallo, dipende dal tipo di visualizzazione usato in seguito). Su questo supporto viene stratificata una superficie di fase stazionaria e viene inserito in un contenitore all'interno del quale esiste una fase mobile che si muove in quella stazionaria per capillarità.

Viene usata per i glicoconiugati, in particolare la separazione dei monosaccaridi. In questo caso la fase stazionaria è la silice e i monosaccaridi presentano una grossa affinità per essa e rimangono incollati. Sulla lastrina viene disegnata a matita una riga che è la linea di partenza, dove vengono segnati i punti in corrispondenza dei quali si faranno camminare le miscele da separare (pochi microlitri di miscela). La lastrina viene poi immersa alla base nella fase mobile (un solvente non polare), avendo cura che il liquido non ricopra le sostanze depositate, chiudendo la camera.

La fase mobile sale lungo la fase stazionaria per capillarità trascinando con sé le sostanze. La corsa di una sostanza dipenderà dal grado di interazione di questa con la fase stazionaria. Quanto più polari sono i composti, tanto più verranno trattenuti dalla fase stazionaria (i monosaccaridi si separano in base alla diversa affinità per la silice).

Queste macchie vanno quindi visualizzate grazie ad un metodo di visualizzazione universale. Esempi: Acido solforico in etanolo, Anisaldeide-acido solforico, Anilina-difenilammina-acido fosforico. Il reattivo si spruzza sulla TLC. La TLC viene riscaldata a 80-100 °C fino alla comparsa degli spots.

Quindi non ho modo di recuperare il campione, dopo l'analisi lo avrò distrutto e perduto. Un processo separativo di tipo cromatografico ha quindi come risultato un profilo di concentrazione di analiti risolto nello spazio o nel tempo di forma gaussiana (cromatogramma o picco cromatografico).

TR (tempo di reazione dell'analite) viene misurato nel punto di massimo del picco; Wb viene ottenuto tracciando le tangenti al punto di flesso e misurando l’intercetta sulla linea di base (ampiezza del picco); Wh è la larghezza del picco misurata al 50% dell'altezza; Wi è la larghezza del picco misurata ai punti di flesso. Gli ultimi tre parametri ci danno la “forma” del picco.

Parametri che caratterizzano un picco cromatografico

• Risoluzione: è una misura dell'abilità di un determinato metodo di separare due analiti. Una buona forma di picco (picco sharp, numero 1) dà una cromatografia migliore, ma anche il picco 2 ha una sua validità. Se io ho picchi abbastanza slargati, nulla vieta che al di sotto ci siano altri picchi più piccoli (un altro analita), quindi il potere risolutivo deve essere il maggiore possibile e questo risente sia del metodo di separazione che di visualizzazione.
• Selettività: è una misura del potere separativo di un metodo e dimostra la capacità di separare due analiti.
• Efficienza: dipende esclusivamente dal cromatografo usato.

Piatì teorici

Quando si parla di piatti teorici iniziamo ad immaginarci le colonne di distillazione, che sono tubi di vetro con dentro dei piattini. Per la distillazione si usa un contenitore con un liquido a cui viene collegata la colonna. Il contenitore viene messo su una piastra riscaldante e il vapore parte dal liquido e, man mano che la temperatura aumenta, avviene la separazione lungo la colonna. Il vapore che parte dalla nostra soluzione incontra i nostri piatti di condensa, diventa liquido e rimane lì; quando il sistema aumenta la temperatura, questo liquido torna vapore, così tramite passaggi successivi abbiamo la separazione dei componenti della miscela.

Quanto maggiore è la lunghezza della colonna, più piatti si possono posizionare e quindi migliore sarà la separazione perché questo processo di condensazione e ri-evaporazione avviene più e più volte e il processo separativo è migliore. Dal punto di vista teorico, questo principio viene usato in campo cromatografico, introducendo il concetto dei piatti teorici: gli analiti vengono trascinati dalla fase mobile attraverso la fase stazionaria e separati in base alla loro differente affinità per le due fasi. Quello che succede è che l'analita, istante per istante, stabilisce un equilibrio reversibile tra la fase mobile e quella stazionaria, ciascuno di questi equilibri viene definito piatto teorico. Quante volte questo equilibrio viene ripetuto lungo la colonna cromatografica rappresenta il numero dei piatti teorici, stabilito tramite una equazione: H = L/N (equazione di Van Deemter).

Quindi quando la cromatografia è davvero efficace? Quando il numero di piatti teorici è massimo.