Glicobiologia 6 - Spettrofotmetria: Elettrospray

L’analizzatore

Negli ultimi 15 anni siamo passati da analizzatori molto ingombranti a quelli di pochi cm.

L’analizzatore di massa quadrupolare è uno dei pochi analizzatori disponibili che dà la possibilità di

fare un qualcosa che è fondamentale nel campo della spettrometria di massa e cioè la scansione.

Il massimo valore di m su z misurabile da un quadrupolo per i limiti di costruzione è m su z = 4000

Se ho un analita che pesa 10000 Da e prende una sola carica quindi 1000+ 1 = 10001 il quadrupolo

non lo visualizza visto il limite di 4000. Se la massa è 10000 Da e prende 2 cariche quindi 10002

ma visto che m/z ( dove z= carica ) allora 10002/2= 5001 e neanche lo vede. Se la massa è 10000

Da e prende 3 cariche quindi 10003 facendo 10003/3 è circa 3000 e in questo caso l’analizzatore lo

vede. Quindi l’analita che si analizza con questo tipo di analizzatore deve ricadere nel limite

massimo del rapporto m su z e deve essere protonabile cioè deve acquisire cariche.

Com’è fatto un quadrupolo?

E’ un sistema costituito da 4 barre poste in maniera parallela fra di loro che vengono attraversate da

correnti elettriche, da radiofrequenze e correnti elettriche continue in maniera alternata. L’alternarsi

di questi due campi elettrici comporta la formazione di un campo di forza oscillante (il verde) che a

sua volta determina la formazione di un filtro a banda passante. Che cosa vuol dire? Che ad un

determinato istante t solo lo ione che ha un valore m/z tale da entrare in risonanza con il campo che

si è formato può attraversare il campo, gli altri invece non passano.

Il movimento dello ione è di tipo elicoidale, dove l’ampiezza dell’oscillazione è in funzione del

rapporto massa carica. Quindi i vari analiti avranno un’ampiezza si oscillazione dipendente dal

rapporto massa carica. Il quadrupolo può operare in due modi: o viene fissato ad un valore massa

carica facendo così passare solo quel determinato analita oppure si può fare la scansione. Per capire

che cos’è la scansione facciamo si che lo spettrometro di massa sia accoppiato ad un HPLC così da

avere un flusso che si inietta nello spettrometro e se non si vogliono perdere informazioni si deve

settare il quadrupolo in modo tale che possa fare scansioni continue così da fare una scansione

completa di 4000 m/Z istante per istante relativamente agli eventi cromatici che stanno accadendo.

Se invece del cromatografo si una la siringa per iniettare con un solo glicoconiugato, la velocità di

scansione non deve essere così frenetica come nel caso precedente in quanto è un solo analita.

quindi la scansione è la possibilità di coprire tutto l’intervallo m/z caratteristico del quadrupolo e

deve essere fatta in modo tale da non far perdere informazioni sulla miscela di analiti che si sta

analizzando.

Questo è il classico esempio in cui una proteina viene sciolta nell’opportuno solvente, la metto nella

siringa la inietto e per la stessa proteina si ottengono 8 segnali. Che differenza c’è tra ognuno di

questi segnali? Cambia il rapporto massa carica (il rapporto massa carica sta sull’asse delle x) , la

massa è sempre la stessa ciò che cambia è lo stato di carica.

Si ha una proteina si vuole capire se questa è glicosilata o meno, si prende questa proteina, la si

scioglie e la si inietta all’interno dello spettrometro di massa. Si ottiene un numero n di gaussiane

(grafico sopra), che corrispondo ognuna ad una glicoforma (cioè stessa sequenza amminoacidica

diversa composizione in monosaccaridi), ogni gaussiana viene trasformata così da leggere

direttamente il peso molecolare. In base alla distanza dei vari picchi si può capire se si tratta di una

glicoproteina o meno. Se invece si ha una miscela di peptidi dalla quale si può idrolizzare per via

enzimatica (mediante Hydrolysis) l’oligosaccaride dall’asparagina a cui è legato così da avere

l’oligosaccaride libero e l’asparagina che diventa acido aspartico.

Se invece si ha una miscela complessa di peptidi e si vuole evitare di accoppiare passaggi di

cromatografia, si usa la maldi che ci dice che ogni segnale rappresenta una struttura

oligosaccaridica.

Spettrometria MS/MS

La spettrometria di massa tantem è una metodologia analitica che consente di fare delle

determinazioni strutturali a bassa risoluzione. Sostanzialmente la metodologia tantem è quella

metodologia che

combinando più analizzatori tra di loro permette di fare la determinazione del peso molecolare di

miscele di analiti e permette di selezione uno, due, tutti o nessuno gli ioni presenti nella miscela,

mentre per lo ione selezione permette di fare esperimenti di frammentazione che corrispondono

banalmente a quella che può essere definita la rottura dell’analita in vari piccoli pezzetti dall’analisi

dei quali è possibile ricostruire la struttura primaria del peptide che si sta analizzando.

Nelle regole di frammentazione nel caso dei peptidi il primo legame che si rompe è quello

peptidico, analogamente per gli oligosaccaridi anche se molto spesso si vengono a formare dei

frammenti interni che danno informazione sulla struttura dell’oligosaccaride. Quindi in base

all’analita ci sono delle regole di frammentazione da seguire così da ottenere informazioni sulla

struttura. Tuttavia non è detto che ad ogni analita sia accoppiato un evento di frammentazione

poiché questo dipende dall’analita stesso.

Come avviene la fisica di frammentazione?