Glicobiologia - 3

Sintesi del precursore (core pentasaccaridico):

Siamo sul lume del RE. Al doligolfosfato, che si trova ancorato all'iterno membrana e funge da

punto di inizio della sintesi, vengono aggiunti i residui monosaccaridici, fino a formare il precursore

(man5). Tramite un enzima, la flippasi, questo precursore viene trasferito dall'altro lato della

membrana del RE e portato in blocco sulla catena proteica che si sta formando, in corrispondenza

dell'Asparagina nella sequenza consenso.

I tre glucosi che ha la proteina, formano da “bandierina”: se la proteina è correttamente foldata,

allora questi tre glucosi vengono idrolizzati e staccati e la proteina viene portata nella sua sede. Se

invece restano, funziona come segnale di non corretto folding e allora la proteina viene presa e

avviata alla degradazione.

Core pentasaccaridico: Asparagina + 2 N-acetil-glicossamina + 3 mannosi. È comune a tutte le

glicoproteine, forma una Y.

Esse però sono caratterizzate da eterogenicità:

– proteine che sviluppano l'oligosaccaride soltanto con un'unità di mannosio (strutture high

mannose o oligomannosio). Ogni braccia che si sviluppa viene chiamata antenna che si può

ramificare in modo diverso;

– strutture complesse, ovvero aggiunta di precisi monosaccaridi in punti precisi di un

oligosaccaride. Questa è l'informazione che correla una glicoproteina a uno stato di una

cellulare. Per esempio: stadio infiammatorio in cui c'è sempre una iper fucosilazione, ossia

massiccia presenza di fucosio nelle catene rispetto a stadi normali.

– Strutture ibride tra le prime due.

Il tipo di precursore cambia negli organismi. Posso identificare la glicoproteina senza purificare,

quindi solo sapendo se c'è o meno e come il precursore.

Glicoproteine O-linked-Le mucine

La O glicosilazione avviene a carica di serina o treonina. Non c'è una sequenza consenso e la

composazione degli oligosaccaridi che vengono legate ad esse è particolare e ha degli andamenti

che sono molto eterogenei.

Le mucine sono glicoproteine il cui scopo principale è la ritenzione dell’acqua. Esse sono presenti

alla superficie del tratto digestivo e genitale, e nel sistema respiratorio.

In genere posseggono catene oligosaccaridiche che terminano con residui di acido sialico (capping).

Per stabilire se una proteina è glicosilata

•Reazioni chimiche sui monosaccaridi (riduzioni, reazioni con periodato, con alcol, con

fenilidrazine. La maggior parte di queste reazioni basa il proprio risultato su reazioni di tipo

colorimetrico. Se io ho un aldoso in ambiente basico, ho la formazione di un tiolo che posso

ossidare con ioni rame 2 e la soluzione da blu scuro diventa rossa a causa dell'ossido di rame

precipitato. Nelle razioni con fenilidrazine si formano iosazoni, ovvero solidi cristallini gialli)

•Uso di lectine o di anticorpi

Purificazione delle glicoproteine (pdf glicoproteine caratteristiche)

I comuni metodi di estrazione spesso non sono molto selettivi e permettono di ottenere una miscela

di proteine e glicoproteine.

- ELETTROFORESI 2D

- punto isolelettrico vs peso molecolare

- Staining specifico per glicoproteine

I metodi di estrazione che permettono di isolare la glicoproteina, richiedono in genere l’utilizzo di

tamponi non volatili, incompatibili con la maggior parte delle tecniche di ionizzazione utilizzate per

l’analisi di questo tipo di campioni.

- Desalificazione

- zip-tip puntali con microcollonne C18 o C4

- biogel microcolonne gel filtration

- microcon membrane

Approccio Bottom-up

1. Idrolisi enzimatica della glicoproteina

2. analisi della miscela di peptidi e glicopeptidi → Peptide mass fingerprint

2a. uso di programmi per il calcolo dei peptidi teorici

2b. uso di database per l’identificazione di proteine

3. distacco degli oligosaccaridi dal peptide ed analisi classica degli oligosaccaridi

1. degradazione enzimatica della glicoproteina

La tripsina è l’enzima più utilizzato. Esso opera ad un pH ottimale di 8 ad una temperatura di 37°C.

Porta alla formazione di peptidi con un residuo di lisina o arginina terminale. La presenza di

amminoacidi carichi sul peptide favorisce il processo di ionizzazione.

1a. Riduzione dei ponti disolfuro

Molti residui di Cys nella sequenza amminoacidica → Presenza di ponti disolfuro → Difficoltà di

attacco dei siti di idrolisi della proteina da parte dell’enzima → Riduzione e Alchilazione dei residui

di Cisteina → siti di idrolisi più disponibili

2. analisi della miscela di peptidi e glicopeptidi

Peptide mass fingerprint

spettro MALDI → lista di peptidi

MASCOT

input: lista di peptidi ottenuti sperimentalmente

output: proteina da banca dati

Peptidi non presenti nelle liste teoriche → Potenziali glicopeptidi → Spettrometria di massa

TANDEM

3. Distacco degli oligosaccaridi dal peptide ed analisi classica degli oligosaccaridi

N-glycans

Idrolisi enzimatica mediante peptide-N-glicosidasi (PNGase F o PNGase A)

Idrolisi chimica mediante idrazinolisi

O-glycans

Idrolisi alcalina in condizioni riducenti (b-elimination)

Idrolisi chimica mediante idrazinolisi

SITI DI GLICOSILAZIONE N-glicoproteine

Una volta individuato il glicopeptide, è possibile che su questo ci sia un solo sito di glicosilazione

possibile.

Approccio Top-down

– Analisi della glicoproteina intatta mediante Spettrometria di Massa

Massa osservata – Massa attesa = Post translational modifications