Glicobiologia 7 - Risonanza magnetica nucleare NMR

La distanza tra questi due segnali dipende dalle geometria della molecola. Questa distanza è la

stessa per i due protoni accoppiati, quindi tramite questi segnali e queste costanti, io sono in grado

di dire qual è la posizione di ogni protone e quindi ricavare la struttura della molecola.

Tutti i nuclei accoppiati tra loro costituiscono quello che si chiama un sistema di spin. Nella

struttura di un glicoconiugato, ogni singola struttura di un monosaccaride è un sistema di spin; in

una proteina ogni singolo amminoacido è un sistema di spin.

Nel caso dei carboidrati questi accoppiamenti scalari assumono valori caratteristici che seguono la

legge di Karplus. Se noi siamo in grado di leggere questa costante, l'accoppiamento tra protone in 2

e protone in 3 avrà un valore caratteristico.

L'orientazione ci dirà di che tipo di monosaccaride stiamo parlando e quindi, sulla base di questa

informazione, ricostruiamo la struttura del monosaccaride.

Nel caso dei carboidrati, abbiamo tutti protoni legati ai carboni e ossigeno, andranno tutti a cadere

nella stessa zona. Tuttavia, la sola informazione del chemical shift ci può dare delle indicazioni:

Torniamo al monosaccaride di prima, che è un tetrasaccaride che proviene da un glicolipide

batterico, abbiamo 4 sistemi di spin, 3 dei quali sono immediatamente individuabili, perchè

abbiamo 3 protoni che si distaccano e un acido, il tiolo, che si identifica per via di questo segnale

caratteristico.

Più di questo, dallo spettro protonico non riusciamo a ricavare, perchè è un'accozzaglia di segnali,

per cui abbiamo bisogno di altre tecniche ci diano altre informazioni.

Utilizziamo quindi quella che viene chiamata spettroscopia bidimensionale, una evoluzione della

spettroscopia MNR che si utilizza appunto, per analisi strutturali. In particolar modo, per i

carboidrati, abbiamo diverse tecniche riportate in slide:

Andiamo a guardarli uno per uno.

Abbiamo un campione di oligosaccaride, lo inseriamo nel nostro spettrometro e ricostruiamo la

struttura.

La prima cosa che andiamo a guardare è lo spettro TOCSY. In questo spettro, i segnali del nostro

spettro protonico ha l'equivalente di questa diagonale (il chemical shift); in corrispondenza di ogni

segnale, vediamo delle macchie che dobbiamo mettere in correlazione. Quindi ci sono delle

correlazioni a partire dal segnale di spin che avevamo precedentemente individuato e la TOCSY.

Chi sono questi protoni? Sono i segnali che appartengono allo stesso sistema di spin, cioè il protone

anomerico presente nel residuo A, e queste sono le risonanze, vede 6 macchie che ci dicono a che

valore di chemical shift risuonano i protoni. Stessa cosa a partire da un altro segnale più distaccato.

Così facendo noi deduciamo quali sono le risonanze che appartengono allo stesso sistema di spin.

Però non sappiamo ancora niente della struttura. Abbiamo però una guida, perchè sappiamo quali

segnali devono appartenere ad ogni monosaccaride; sulla base di questa guida noi dobbiamo

interpretare l'effetto COSY.

Questo è un tipo particolare di spettro. L'informazione che dobbiamo ricavare è capire di quei valori

che sono segnati chi è 1, 2, 3, 4 e così via.

Come si fa a partire dal nostro segnale A1 che c'è una e una sola correlazione?

Se noi andiamo a sovrapporre questo spettro con il TOCSY di prima, vedremo che questa

correlazione è una delle correlazioni che avevamo nel TOCSY.

Guardiamo l'esempio C:

Quindi da questa posizione, C1, noi vediamo una correlazione, ci spostiamo sulla diagonale e

vediamo che qui sotto (coperta dalla figura) c'è un protone, che è il protone b2 del residuo C.

Vediamo che c'è un'altra correlazione, andiamo avanti così e assegnamo quelle risonanze agli

specifici protoni.

In questo spettro siamo in grado di rintraccia due segnali con due colori diversi. Questi segnali

hanno una loro forma e la distanza tra le macchie di colore diverso è totale al chemical shift dei

protoni dell'anello.

Quindi da questi segnali io posso leggere la costante di accoppiamente che mi dice qual è la

posizione dei vari protoni e quindi chi sono i monosaccaridi.

Fatto questo, mi sposto sullo spettro 1H, C13 - HSQC. Questo spettro ha un aspetto totalmente

diverso:

Anzitutto non ha la diagonale. Perchè? Perchè in questo caso le risonanze che noi abbiamo in X e Y

non sono le risonanze protoniche: in particolar modo, avremo sulle X le risonanze protoniche e sulle

Y le risonanze del carbonio.

Ad ogni segnale corrisponde una e una sola correlazione ed è il valore di chemical shift del

carbonio a cui il protone è legato.

Quindi possiamo assegnare anche i valori agli atomi di carbonio. Tutti questi valori sono

diagnostici. Ad ogni protone associo il carbonio a cui è legato.

Questo effetto è di tipo spaziale, perchè si verifica tra nuclei vicini nello spazio, ma non per forza

legati tra loro. Ci dà informazioni sulla forma, perchè se io trovo due protoni distanti tra loro che

devono stare ad una certa distanza, so com'è fatta la loro forma.

Per poter vedere correlazioni dipolari di un nucleo con altri, si utilizza la NOESY.

Se andiamo a guardare le correlazioni tra i nostri segnali di riferimento, vediamo che abbiamo sia

correlazioni molto forti tra protoni che fanno parte dello stesso anello, sia correlazioni tra un

protone e segnali che non fanno parte della stessa molecola.

Infine, l'ultimo tipo di spettroscopia bidimensionale è la HMCB. In questo caso è uno spettro su una

miscela, perchè un altro punto di forza dell'MNR è che siamo in grado di individuare anche

componenti di miscele.

Abbiamo individuato vari segnali legati tra loro che abbiamo chiamato A1, A2... A6 e vediamo che

A1 sembra essere sempre collegato al segnale A6. Però, se faccio questa analisi, vedo che restano

fuori una serie di segnali.

Innzanzitutto, come funziona l'HCMB? L'HCMB mi dà correlazioni tra un dato segnale di un

protone anomerico di riferimento e segnali di carbonio che distano 2 o 3 legami. A partire da H,

quindi, vedremo il C in posizione 2 e 3. Allo stesso modo vedremo la posizione 5.

La presenza di questa correlazione è anche diagnostica di un'altra cosa, ovvero della dimensione

dell'anello: se io vedo che l'1 è in correlazione HCMB con il 5, significa che il 5 è la posizione in

cui si chiude l'anello.

Come detto, c'erano segnali che non ci tornavano. La posizione lungo la scala C13 è diagnostica del

tipo di protone o di carbonio. Questa zona tra 100-105 ppm è la zona dove ci sono dei C anomerici.

Vuol dire che nella nostra miscela è presente anche un'altra sostanza, un polimero del fruttosio (che

è un chetoso e NON ha C anomerico) e quindi non potrei individuarlo in altri spettri, ma gli spettri

HMBC invece individuano anche i C non anomerici. Quindi risaliamo al fatto che questa è una

catena di fruttano.

Altra applicazone sui glicoconiugati: