Genomica Funzionale

Genomica funzionale

Introduzione storica

La genetica è nata all'inizio del 1800 con Mendel. Nel 1953, Watson e Crick hanno descritto la struttura del DNA. Il genoma umano è 6x10 coppie di basi.

Mappe genomiche

Per lo studio del genoma, sono state costruite delle mappe genomiche sulla base dello studio del linkage. Per studiare una famiglia, devo conoscere il genotipo o il fenotipo. Tuttavia, andando a vedere dei semplici incroci, non posso vedere in che posizione si trova il gene; posso solo dire se è autosomico o legato a X o Y.

Per studiare la posizione del gene, si andava a vedere se due geni segregavano insieme o se erano indipendenti tra loro. Se segregavano insieme, significava che erano associati e che si trovavano vicini al cromosoma 1. Il crossing-over avviene su due cromatidi su quattro, quindi si ottengono sempre due ricombinanti e due non ricombinanti. Questo è il motivo per cui la frequenza di ricombinazione non è mai superiore al 50%. In questo modo, però, si potevano mappare solo alcuni geni.

Genetica molecolare

Questo scoglio è stato superato con la genetica molecolare, attraverso cui è possibile variare la sequenza del DNA. Studiando i fattori polimorfici e scoprendoli, è stato possibile utilizzare marcatori molecolari su di essi.

Fattori polimorfici

• Gruppi sanguigni
• Proteine differenziate in base alla mobilità elettroforetica
• HLA
• DNA RLFP (frammenti di restrizione che individuano un polimorfismo)
• DNA VNTR (minisatelliti, variabili per lunghezza da individuo a individuo)
• DNA SNP (polimorfismo a singolo nucleotide, scoperti nel 2000, e densamente distribuiti in tutto il genoma)

Analisi di restrizione

Tagliando il genoma in due individui diversi con un enzima di restrizione (es. ECORI) e dividendo con elettroforesi i frammenti poi trasferiti su fogli di nitrocellulosa (con Southern blot) aggiungendo sonde marcate, queste vanno ad evidenziare polimorfismi di una singola base. ECORI riconosce GAATTC. Una mutazione ha una frequenza bassa (minore dello 0,1%), mentre i polimorfismi vengono definiti tali quando la loro presenza è maggiore dell'1%. Comunque, l'analisi di restrizione ci dice che gli alleli segregano indipendentemente.

VNTR

I VNTR sono polimorfismi che hanno a che fare con la lunghezza del DNA (minisatelliti). I minisatelliti sono sequenze che si ripetono:

• Microsatelliti: sequenza ripetuta fatta da max 4 basi
• Minisatelliti: sequenza ripetuta fatta da min 5 basi

Queste sequenze possono trovarsi sia negli introni che negli esoni. Questi polimorfismi sono significativi, e posso dividere i cromosomi in base al numero di ripetizioni, da cui deriva un numero enorme di individui diversi individuabili in base al diverso numero di ripetizioni. Per analizzare questi polimorfismi è necessaria la PCR. Vengono sintetizzati due primer (uno a monte e uno a valle della sequenza interessata). Se l'individuo è omozigote, avrò una sola banda; se invece è eterozigote, avrò due bande (es. una con 10 ripetizioni e una con 16). VNTR è un buon marcatore per la mappatura, per vedere quali geni sono vicini a questi.

SNP

Gli SNP presentano il maggior numero di variazioni a singola base nella popolazione. Rappresentano un’alta frequenza, si ha uno SNP ogni 100 bp. Utilizzando questi marcatori si può capire come posizionare e studiare i geni.

Mappe genetiche

La prima mappa genetica è stata creata nel 1987 ed era basata su RFLPs. Nel 1992 è stata creata una seconda con microsatelliti con 814 marcatori (1 marcatore per ogni 3,5 Mb). Nel 1994 si è iniziato a creare mappe utilizzando più marcatori diversi insieme (1 marcatore per ogni Mb). La più recente mappa basata su SNP comprende 3 milioni di SNP, 1 per ogni Kb. Lo studio e il sequenziamento del DNA sono stati possibili grazie all’aumento dei metodi molecolari per il DNA.

Vettori e mappaggio genico

Shotgun e vettori

All’inizio degli anni '80 si è iniziato a creare vettori per il sequenziamento del DNA attraverso un metodo definito shotgun:

• Prendere cellule nucleate
• Estrarre DNA
• Tagliare il DNA con un enzima di restrizione che taglia in maniera sfalsata, in modo da avere frammenti sovrapposti. Si utilizza una ridotta quantità di enzima per creare frammenti sfalsati.
• I frammenti vengono clonati in opportuni vettori
• Questi frammenti vengono riutilizzati per ricostruire e mappare il genoma

I primi vettori usati sono stati i plasmidi, derivanti da molecole di DNA di E. Coli, che permettono di inserire al massimo 10 Kb; vengono quindi usati solo per subclonare piccoli frammenti, o per costruire librerie di espressione (non genomiche). Più tardi sono stati utilizzati vettori derivanti dal fago λ, che permette di inserire 20-25 Kb per costruire librerie di cDNA.

Cromosomi artificiali di lievito e BAC

Sono stati creati cromosomi artificiali di lievito, definiti YAC (0,2-2 Mb), usati per le librerie genomiche. Con gli YAC è stato possibile effettuare il mappaggio del genoma.

La sequenza da clonare viene inserita all’interno del taglio ECORI. Se le cellule crescono in presenza di uracile, significa che sono ricombinate. Dopo qualche anno si accorsero che erano presenti incongruenze, come lo stesso gene presente in due cromosomi diversi. Si è capito che questi vettori e le cellule di lievito creavano effetti di ricombinazione. A questo punto, siamo tornati alle cellule batteriche, e sono stati creati i BAC (20-250 Kb), che mimano non un plasmide batterico, ma un cromosoma batterico. Questi BAC risultano stabili e non ricombinanti, quindi le librerie BAC sono state elette le librerie per la mappatura perfette.

Metodi per costruire le mappe

• Metodi citogenetici
• Mappe di restrizione
• Mappe dei cloni contigui: basata su mappa STS. Per cloni contigui si intendono i frammenti che, dopo una corsa elettroforetica, dimostrano caratteristiche simili.

L'utilizzo di ibridi somatici serve per lo studio del genoma umano: una cellula umana viene fusa con una cellula murina tramite particelle virali che determinano la fusione delle membrane, formando una sola cellula con due nuclei. Quando la cellula entra in mitosi, i genomi si ricombinano e nelle cellule figlie ci saranno sia il genoma murino che quello umano. Il genoma delle cellule murine è ibridato con molecole fluorescenti, mentre il genoma umano, durante la mitosi, viene perso. Otteniamo quindi diverse linee ibride contenenti cromosomi diversi.

Strategie di mappaggio

Dopo aver determinato che il marcatore si trova sul cromosoma 3, come faccio a sapere che sta vicino a quello? Semplicemente, il clone trovato può essere studiato in base alla presenza o meno di caratteri polimorfici (SNP, VNTR, ecc.) o si crea un STS (bandierine di sequenza). Si usano due primer, uno a monte e uno a valle del clone, e si creano sequenze piccole (di 150 bp) che diventano bandierine. Si cerca nei cloni quelli che presentano queste bandierine e li si posiziona accanto al proprio clone.

(Questo discorso non ha senso, guarda sul libro) Inserisco ogni clone in un pozzetto di piastre da 99. Poi faccio dei due pool di colonie e guardo quale è positivo. Ammettiamo di avere 10000 cloni e di dividerli in 5 piastre; facendo la PCR trovo la positività nella piastra 2. A questo punto, faccio la PCR per le colonne (12) e per le righe (7) della piastra 2. Con una ventina di PCR trovo il pozzetto dove ho la sequenza di interesse, lo prendo, lo cresco, faccio le STS e rifaccio le PCR e così via.

Tipi di mappe

Le mappe genetiche sono importanti per avere informazioni sul locus responsabile delle patologie comuni. Le mappe fisiche permettono di costruire fisicamente il genoma, ma non forniscono informazioni sul fatto che un gene mutato possa determinare una malattia, perché non ne ho seguito la distribuzione e segregazione. La possibilità di risolvere questo problema è stata resa possibile dal fatto che si possono ottenere sia STS che EST (bandierine di espressione).

Studio del genoma umano

Tecniche per lo studio del genoma umano

• Partendo dalla malattia
• Studiando le famiglie
• Attraverso la segregazione delle famiglie cerco un mappatore polimorfico che cosegrega con il fattore malattia
• Attraverso l’utilizzo di cloni fatti con STS e ordinati per formare la mappa fisica.

A questo punto, sulla mappa fisica è facile trovare il marcatore polimorfico che cosegrega con il fattore. Il clone che contiene il marcatore contiene anche il fattore. Lo studio di questo clone permette lo studio del gene che determina la malattia.

La conoscenza funzionale si basa sullo studio della mutazione nel gene che comporta la malattia. Nel clonaggio funzionale si parte dalla malattia che ci dà informazioni sulla funzione del gene e ci permette di andare a cercare e clonare il gene di interesse. La conoscenza posizionale si basa sulla posizione fisica del gene. Nel clonaggio posizionale parto dalla malattia, attraverso tecniche citogenetiche e riesco a trovare il locus e lo localizzo in una particolare regione. Isolo il gene e studio la funzione.

Se conosco la funzione vuol dire che conosco la proteina e la sua sequenza amminoacidica. Ma a ciascun aa può corrispondere più di una tripletta (codice genetico degenerato), quindi costruisco una sequenza degenerata. All'interno di questa regione cerco sequenze con la minor degenerazione e costruisco delle piccole sequenze non degenerate, che vado ad ibridare sui cloni.

Clonaggio posizionale

Un altro esempio di clonaggio è quello usato per studiare una forma specifica di sordità, però non si conosceva nulla se non il fenotipo. Analizzando dei topi, si è scoperto che avevano un fenotipo simile (topi shaker). Quindi si è fatto un mappaggio genetico nel topo shaker con uno wild type e, analizzando la famiglia, si mappa il gene, che è stato trovato nel cromosoma 11 del topo che corrisponde al cromosoma 17 dell'uomo. Sono stati isolati i BAC con questi cloni e sono stati iniettati nelle cellule uovo di topo shaker per vedere se il DNA esogeno immesso andava a modificare il fenotipo generando topi normali, oppure se i topi rimanevano shaker. E ha funzionato, cioè ha dato topi normali, dimostrando che effettivamente quel gene si trovava nel locus del cromosoma 17 umano. In particolare, si è scoperto che i soggetti malati presentavano mutazioni nella miosina 15.

Con il clonaggio posizionale è stato possibile studiare molti geni che determinano malattia, ad esempio:

• X fragile
• Distrofia muscolare di Duchenne: in genere presente negli uomini sull'X. È stata trovata una sola donna malata, dovuto al fatto che era stato silenziato l'X normale e veniva espresso l'X malato. Strano perché di solito l'organismo è in grado di silenziare l'X con abbassamento di funzione.

Passaggio dalla genetica alla genomica

Genomica funzionale (Baresani)

Mappatura geni

Le metodologie usate per lo studio di malattie mendeliane e non possono variare a causa del fatto che le malattie mendeliane presentano un unico locus. La penetranza incompleta, l’eterogeneità di locus (fenotipo uguale causato da mutazioni in geni diversi), l’eterogeneità allelica (mutazioni diverse nello stesso gene danno fenotipi diversi), complicano lo studio della malattia. L’approccio utilizzato per lo studio di malattie causate da un solo gene è diverso.

Malattie poligeniche

Le malattie poligeniche possono essere anche multifattoriali, cioè legate all’ambiente. Le malattie poligeniche non sono studiate con il linkage ma con lo studio di associazione, cioè comparando un gruppo di persone malate con un gruppo di persone che non presentano la malattia.

Metodi tradizionali

• Linkage
• Allele-sharing
• Associazione

Metodi più recenti

• Focalizzarsi su popolazioni specifiche
• Aplotipo-sharing

Analisi di linkage

La situazione ottimale per lo studio di linkage è quella di avere un unico allele che determina la malattia. Parliamo di linkage quando si parla di una prossimità fisica di due loci. Una frequenza di ricombinazione dell’1% corrisponde a 1 cM (centimorgan).

Aplotipo e fase

Aplotipo: sequenza di alleli per ogni marcatore (SNP, delezioni) che si trovano su un unico cromosoma. Ho un allele A per il primo SNP, l’allele B per il secondo SNP e l’allele C per il terzo SNP; questa sequenza sullo stesso cromosoma è definita aplotipo.

Fase: quando vado a studiare due alleli, devo verificare se questi sono in cis o in trans:

• Cis: gli alleli sono sullo stesso cromosoma
• Trans: gli alleli sono su cromosomi diversi dello stesso tipo

Metodi di linkage

• Metodi parametrici: in questi metodi devo stabilire a priori il tipo di ereditarietà che sospetto. Inoltre, ho bisogno di avere famiglie con tanti figli e con più generazioni.
• Metodi non parametrici: non stabilisco a priori il tipo di modello che devo applicare ai dati, metto tutto nel computer e non specifico il tipo di ereditarietà. In questo metodo mi aspetto di avere fratelli affetti che posso andare a comparare, meglio ancora se ne ho anche non affetti.

Metodo parametrico

Un modo comune di analizzare i dati è vedere la presenza di una corrispondenza tra il DNA dei soggetti sani tra loro, e tra il DNA dei soggetti malati tra loro. Quindi i soggetti malati presentano lo stesso allele uguale tra loro e i soggetti sani presentano lo stesso allele uguale tra loro, ma non si riscontra una corrispondenza tra alleli sani e malati. Il metodo di confronto tra i DNA è molto lungo, ma non viene più utilizzato perché veniva usato per le malattie mendeliane, e la maggior parte sono già state mappate, e in più adesso possiamo fare il sequenziamento. Ma lo guardiamo lo stesso.

Marcatore e gene responsabile

Come faccio ad usare un marcatore in particolare se non so dove si trova il gene responsabile della malattia? Uso tutti/tanti marcatori sparsi per tutto il genoma. Posso farmi una vaga idea di dove si trova la mutazione, ad esempio facendo un cariotipo; se vedo che c’è traslocazione sempre nello stesso cromosoma e nello stesso punto, vado a studiare quella parte. Per verificare una corrispondenza tra il marcatore e il gene di interesse, devo calcolare la frequenza di ricombinazione tra il gene di interesse e il marcatore; se non sono associati, la frequenza deve essere del 50%.

Studio di linkage e di associazione

Negli studi di associazione, usati per le malattie poligeniche, vado a identificare i locus. Mentre negli studi di linkage, vado a localizzare la regione del genoma dove si trova il locus che regola la malattia. Nel linkage mi baso sulla famiglia, nello studio di associazione mi baso sulla popolazione, cioè su grossi gruppi che io vado a comparare, perché nell’associazione io scommetto sul fatto che ci sia una regione di DNA che determina la malattia.

Studi di linkage: cosa sapere

Ci basiamo sul fatto che durante la meiosi avvenga il crossing-over che determina la ricombinazione. Noi abbiamo quattro filamenti, il crossing-over avviene però su due, quindi la massima frequenza di ricombinazione che posso avere è del 50%, il che significa che i due locus sono sufficientemente lontani da ricombinarsi sempre. Tanto più sono vicini i marcatori, tanto minore è la frequenza di ricombinazione. Quindi io devo avere la madre e il padre e devo andare a vedere nei figli se ho dei ricombinanti o no. Nel caso di malattia, vado a vedere se il soggetto presenta o no la malattia. Quindi, per ogni figlio che vado a guardare, devo capire se c’è stata una ricombinazione o no.

Mappatura

Guardo i marcatori e la loro frequenza di ricombinazione. In passato, sono già stati mappati i marcatori che adesso vengono utilizzati come punti di riferimento. Per la mappatura venivano usate le funzioni di mappa (Haldane) che consistono in una relazione tra la frazione di ricombinazione e la distanza di mappa genetica (non sapere la funzione). Da queste funzioni si è ottenuto che 1 cM corrisponde più o meno a 1 Mb. La relazione tra la distanza genetica e la distanza fisica non è costante, quindi devo tenerne conto durante lo studio. Per lo studio di linkage ho bisogno che le meiosi siano informative, cioè che i genitori siano eterozigoti per quell’allele in modo da potermi permettere di capire quale allele è da quale genitore il figlio l’ha ricevuto.

Analisi statistica

Devo avere un'analisi statistica per capire se due locus sono associati o se è solo un caso. Questo studio statistico è il Lod Score (Z). Lod Score = Z = log delle probabilità che i loci siano associati (frazione di ricombinazione = 0) piuttosto che non siano associati (frazione di ricombinazione = 0,5). Per far sì che il test sia significativo, devo avere un lod score di 3. Questo studio devo farlo su TUTTI i marcatori e non su uno soltanto. Log del rapporto tra la probabilità che i marcatori siano associati fratto la probabilità che non lo siano.

La probabilità di non essere ricombinante è = 1-frequenza di ricombinazione. Nella famiglia, la probabilità di non avere la frequenza di ricombinazione è = 1-frequenza di ricombinazione elevato al numero di figli per la frequenza di ricombinazione. Per calcolare la probabilità che i loci siano associati, devo calcolare la probabilità che i figli non siano ricombinanti, cioè 1-frequenza ricombinazione. Io però la frequenza di ricombinazione non posso stabilirla a priori perché varia in base al numero di figli, quindi questo calcolo viene fatto in maniera teorica. La frequenza di ricombinazione viene assegnata a caso (quella che penso possa essere).