Genetica umana

Genetica

I geni sono composti da elementi codificanti (esoni) e da elementi non codificanti (introni). Tra gli elementi non codificanti vi sono gli elementi regolativi: il promotore al 5' del gene e la sequenza regolativa al 3' del gene. Sugli esoni sono localizzati i codoni, ossia triplette, ognuna codificante per un amminoacido.

Gli esoni contengono l'ORF (open reading frame) che vuol dire cornice di lettura. Poi vi sono i siti di splicing che sono le sequenze-giunzioni tra introni ed esoni. Nel promotore vi sono delle box che legano i fattori di trascrizione e l'RNA polimerasi.

Per essere espresso in proteina, il gene deve essere trascritto in mRNA, successivamente il trascritto primario deve essere sottoposto a splicing, processo in cui si tagliano gli introni e si incollano gli esoni. Al 5' e 3' della sequenza formata dalla fila di esoni incollati fra loro, vi sono le sequenze UTR (untranslated region), sequenze che sono trascritte ma non saranno mai tradotte, che hanno la funzione di stabilizzare e di interagire con i ribosomi al momento della traduzione. Al termine si ha la traduzione in proteina.

Ci sono geni molto piccoli con pochi esoni e pochi introni, altri geni più grandi. Quando i geni sono molto grandi ci sono introni grandissimi che rendono il gene lunghissimo. Il nostro genoma è frutto di milioni di anni di evoluzione, eventi casuali che hanno portato pezzi di DNA prima lontani poi vicini e poi eventi di selezione che mantiene gli eventi vantaggiosi.

Mutazioni

In genetica, sono molto frequenti le mutazioni cromosomiche che hanno un impatto sul cariotipo e possono essere: inserzioni, delezioni, duplicazioni di sequenze molto lunghe di DNA, megabasi, aneuploidia (alterazione numero di cromosomi, come la perdita di un cromosoma).

Una mutazione può avvenire anche a livello di sequenza, in un promotore, in un esone, in un introne o in una sequenza regolativa. Se una mutazione avviene in un esone, può essere puntiforme se tocca uno o pochi nucleotidi. Se cambio una base con un’altra può essere una mutazione silente (il codice è degenerato, quindi posso avere più codoni che codificano per un determinato amminoacido ed al momento della traduzione non cambia l’amminoacido prodotto); può essere una mutazione in cui una base con un'altra ed il codone ha un senso diverso, al posto di missenso altro nella proteina e se l’amminoacido nuovo ha caratteristiche di carica, ingombro sterico, etc molto simili non avrà un impatto funzionale; se al termine di una mutazione si forma un codone di stop prematuro, si ha una proteina tronca dall’RNA da cui deriva tronco perché l’RNA polimerasi non capisce cosa copia e copia anche i codoni di stop: si ferma non la trascrizione ma la traduzione.

Se aggiungo o tolgo una base (anche se aggiungo o tolgo due basi) faccio una mutazione frameshift: cambia il frame di lettura e leggo tutto sfalsato da quel punto in poi e molto spesso per caso da questo sfalsamento si genera un codone di stop prematuro. Se tolgo o aggiungo tre basi (un amminoacido) o multipli di tre, non cambio il frame di lettura ma avrò semplicemente un amminoacido diverso. All’inizio ed alla fine dell’introne amminoacido in meno o più rispetto a uno di basi che deve restare mutato, se a livello di queste sequenze avvengono mutazioni o avviene un difetto di splicing, l’introne non viene eliminato, l’introne viene trattenuto nel messaggero e si ottiene un messaggero anomalo che non può essere tradotto.

Se la mutazione avviene nel mezzo di un introne potrebbe avere un effetto nullo ma il cambiamento mutazionale potrebbe anche generare un nuovo sito di splicing, lo splicesoma potrebbe andare in tilt. Un certo numero di volte usa la sequenza giusta e quindi fa un messaggero giusto, altre volte se usa la sequenza di splicing sbagliata, crea un messaggero anomalo con un pezzo di introne al suo interno e quindi non potrà essere tradotto. Alla fine dalla somma dei processi giusti e sbagliati avrò meno proteina. Anche sequenze esoniche sinonimo, che non interferiscono con la qualità della proteina, possono interferire con l’efficienza dello splicing. Una sequenza lontana mutata, immaginando una struttura tridimensionale della proteina, può rendere lo splicing inefficiente, a seguito di un riarrangiamento spaziale della proteina con conseguente avvicinamento di siti di splicing.

Le mutazioni nel promotore possono avere effetto devastante se impediscono il legame della polimerasi. Mutazioni sia alla regione 5’UTR che al 3’UTR sono molto ed impattano sull’espressione genica. Si parla di effetti quantitativi sulla importante quantità di proteina prodotta.

I miRNA sono RNA piccoli (20 basi) che agiscono sui messaggeri legandovisi in base al livello dell’ORF e soprattutto alla lunga sequenza 3’UTR. Ogni mRNA può legare più di un miRNA ed in più posizioni diverse. Se un legame è perfetto fra miRNA ed mRNA si ha la degradazione del messaggero. Quindi sono dei regolatori negativi. Se il matching non è perfetto o perfetta complementarietà tranne che per una base, il miRNA rimane legato e rende difficile la traduzione di quel messaggero producendo meno proteina. Il destino di un messaggero dipende da quali e quanti miRNA incontra.

Quindi mutando le sequenze di riconoscimento dei miRNA soprattutto a livello 3’UTR (che essendo molto lunga può contenere un alto numero di siti di riconoscimento), posso agire sul destino di un messaggero e sulla sua down-regolazione. Anche il miRNA può essere mutato (lungo il genoma ci sono dei geni che codificano per i miRNA ed essendo molto piccoli possono essere localizzati anche dentro gli introni di geni più grandi: mutazioni introniche sono pericolose perché possono interferire sia con lo splicing, ma anche con la sequenza dei miRNA).

Varianti e polimorfismi genetici

Sequenziando il genoma di più individui, scopriamo che siamo tutti diversi. Si introduce il concetto di varianti. Se sequenziamo i nostri genomi otteniamo sicuramente varianti comuni a più genomi ma anche qualche variante rara specifica solo per quel genoma. In genere varianti comuni sono non patologiche, mentre non è sempre detto per le varianti rare.

Un genoma è tutto il materiale ereditario che serve a costruire ma anche ad organizzare funzionalmente un organismo vivente. Il genoma è organizzato in cromosomi che contengono geni che dal punto di vista chimico altro non sono che DNA. Un organismo umano è costituito da 6*10¹³ cellule di tipi diversi, i sono tipi diversi all’interno. Per ogni neurone i sono proprio sinapsi. Ogni cellula somatica ha una copia completa dell’intero genoma dell’intero organismo. Gli eucarioti si organizzano il genoma in grado di ripostosi, all’interno del nucleo, che aiutano a compattare una grande quantità di informazioni sotto forma di DNA; il compattamento si ha finché la cellula deve dividersi per mitosi o per meiosi. I cromosomi hanno anche un’importante funzione regolativa.

La specie umana ha 46 cromosomi, suddivisi in 22 paia di autosomi più la coppia XX o XY. Non esiste correlazione fra numero di cromosomi, complessità ed evoluzione (uomo=46 cromosomi, pisello=14 cromosomi, riccio di mare=42 cromosomi, cane=78). I cromosomi possono essere classificati in base a diverse tecniche di colorazione che forniscono un bandeggio corrispondente al contenuto in basi delle varie porzioni del cromosoma. Dal bandeggio si evince la diversa morfologia e dimensione dei vari cromosomi. Ad esempio con la tecnica del chromosome painting, utilizzando fluorocromi specifici per determinate sequenze cromosomiche, ottenendo una gamma di diverse colorazioni, si sono ottenute informazioni sul cariotipo di cellule anomale.

Il DNA compie una replicazione semiconservativa trasmettendo l’informazione da una cellula madre a due cellule figlie al momento della meiosi. Dalla trascrizione e quindi dalla sintesi proteica si ottengono le proteine che compongono l’organismo e che hanno funzioni regolative e strutturali. La trascrizione avviene nel nucleo, successivamente il messaggero prodotto subisce un processo di apprendimento e di polimerizzazione al UTR; segue il processo di splicing.

Dopo lo splicing il messaggero trasloca nel citoplasma dove ha luogo la traduzione. Le proteine costituiscono il 20% del peso corporeo e svolgono funzioni di: enzimi, ormoni, neurotrasmettitori, actinope, istone, proteine di membrana. L’emoglobina è un esempio di proteina tessuto-specifica che lavora da sola e non in pathway. Si trova negli eritrociti o hanno un nucleo e quindi l’emoglobina non può essere prodotta al loro interno ma deve essere sintetizzata da precursori eritroidi nel midollo osseo). In questo caso il gene non è trascritto e tradotto in tutte le cellule, ma solo nei precursori eritroidi.

Le proteine della riparazione del DNA sono invece espresse ubiquitariamente in tutti i tessuti, in quanto errori della replicazione del DNA possono avvenire in tutte le cellule alla mitosi e quindi tutte necessitano di un sistema riparativo.

L'idea di sequenziare tutto il genoma è alla base del Progetto Genoma Umano (HGP), completato dopo 13 anni nel 2003, anno in cui compare la prima bozza di tutto il genoma. Le dimensioni del genoma sono enormi: 6*10¹³ paia di basi, mentre la lunghezza totale del DNA (sommando la sequenza di tutti i cromosomi in tutte le cellule) è 2,0*10⁹ metri.

All'inizio gli scienziati volevano sequenziare solo la porzione codificante (esoni) del genoma, che come sappiamo è una piccolissima parte del genoma. Alla fine, si è deciso di sequenziare fortunatamente tutto il genoma sia nella sua parte codificante che non codificante. Si sono affinate tecniche sempre più sofisticate come sistemi robotizzati per lavori ripetitivi, sequenziatori automatici del DNA ed hardware e software per l’analisi dei dati. Estraendo il DNA di cellule somatiche di poche persone si osservano tantissime differenze individuali. All'inizio si pensava che l’uomo avesse più geni di altre specie, l’ipotesi era che ci fossero almeno un milione di geni.

Nel 2003, si è poi arrivati invece a catalogare un numero definitivo di soli 22 mila geni, che non sono tanti paragonati a specie molto meno complesse dell’uomo. Vi è tanto DNA (2,0*10⁹ paia di basi), ma alla fine solo 22mila geni. Per giunta solo il 2-3% del genoma umano è codificante, il resto è junk DNA (DNA spazzatura), che forma una grande impalcatura su cui si calano anche mutazioni ed esercita un’importante funzione regolativa).

Nell'uomo in media c’è un gene codificato mediamente per proteine. Da un gene grazie a differenti modalità di splicing alternativo, processo fisiologico all’interno delle cellule, posso generare più RNA possibili. Vi sono diverse modalità di splicing alternativo:

• Salto dell’esone: in questo caso un esone può essere eliminato dal trascritto primario.
• Esone mutuamente esclusivo: solo uno di due esoni viene mantenuto nell'RNA maturo, non entrambi.
• Sito di taglio alternativo 5’: sito di taglio alternativo, varia dove viene usato un'estremità dell'esone a monte.
• Sito di taglio alternativo 3’: viene usato un sito di taglio alternativo, varia dove l’estremità dell’esone è a valle.
• Introne trattenuto: i siti di taglio di un introne possono essere non riconosciuti. In questo caso l’introne non viene eliminato dal trascritto di RNA.

La differenza con il salto dell’esone sta nel fatto che la sequenza trattenuta non è fiancheggiata dai tronchi. Se l’introne trattenuto si trova nella regione codificante, esso non deve alterare la cornice di lettura degli esoni. Se avviene il cambiamento di quest’ultima, esso potrebbe generare una proteina tronca o non funzionale.

Con il Progetto Genoma Umano si è ottenuta la precisa sequenza dei tre miliardi di paia di basi. Le sequenze sono state raccolte in banche dati e sono stati realizzati degli strumenti in silico per l’analisi. Si sono ottenute informazioni anche dalle sequenze non codificanti. La tecnica genome-wide ha permesso di estendere lo studio a tutto il genoma, analizzando tutti i geni contemporaneamente.

Ad esempio per studiare le differenze di espressione di un gene in un tessuto normale o tumorale si è utilizzata la seguente tecnica: si è estratto l’RNA globale dal tessuto tumorale e si è estratto dallo stesso individuo dal tessuto sano. Dal momento che l’RNA è denaturato, si è eseguita la sua retrotrascrizione in cDNA (corrisponde all’RNA, non è DNA genomico).

Le due molecole di cDNA sono state marcate con due fluorocromi diversi: il cDNA malato in rosso ed il cDNA normale in verde. Adesso si esegue un esperimento con un micro-array, una specie di vetrino che su uno spazio minimo ha spottato delle sequenze corrispondenti ad una molecola di acido nucleico che è complementare ad un gene e vi possono essere anche 22mila spots sul vetrino se voglio vedere tutti i geni insieme. Dopo denaturazione, ibrido fra di loro le molecole estratte dai due tessuti e nel contempo le ibrido con il vetrino.

Se il gene in analisi è rappresentato in uguale quantità sia nel DNA normale quanto nel DNA tumorale, le molecole (verde e rossa) si annullano a vicenda e quindi quando le ibrido fra di loro ed alla sequenza sul vetrino, complementare al gene, non avrò prevalenza né di rosso né di verde. Lo spot sarà quindi in questo caso giallo (dal mescolamento in parti uguali di rosso e verde). Se lo spot invece risulta rosso, significa che i cDNA che si sono ibridati fra di loro e con la sequenza complementare sul vetrino che corrisponde al gene, non si sono annullati fra loro durante il mescolamento e quindi se avanzano molecole rosse in prevalenza daranno segnale rosso. Se lo spot risulta verde, il caso è opposto, sono prevalse le molecole verdi.

Quindi se prevale il segnale rosso, vuol dire che il gene è up-regolato nel tessuto tumorale e down-regolato nel tessuto normale. Se prevale il segnale verde, il gene è up-regolato nel tessuto normale e down-regolato nel tessuto tumorale. Se lo spot è incolore (in questo caso giallo), il gene non è né up né down-regolato.

La lettura del vetrino si effettua con un fascio laser che vede segnali fluorescenti e fornisce immagini a spots colorati.

Genetica

Dal Progetto Genoma Umano, mediante l’utilizzo di metodologie in vitro (metodologie di laboratorio) ma anche di tecnologie in silico (strumenti informatici) si è giunti alla luce di un numero enorme di varianti individuali, dalla scoperta di milioni di varianti sui singoli genomi, e quindi non si può parlare di singolo polimorfismo.

Per polimorfismo genetico si intende che esistono più forme alternative dello stesso gene o forme alternative della stessa sequenza. Si ha un polimorfismo quando gli individui di una popolazione, un certo gruppo di individui, possono essere classificati in base a diversi fenotipi determinati da due o più alleli (A/a) ad un locus. Se abbiamo due alleli (A/a), i genotipi possibili sono 3: AA, Aa, aa; i fenotipi possibili sono 2: (AA, Aa)=fenotipo dominante; aa=fenotipo recessivo.

Per avere un polimorfismo devo avere almeno due alleli, ossia forme alternative dello stesso gene, dello stesso locus. I due alleli devono inoltre essere relativamente comuni, non frequenti nella popolazione; l’allele meno frequente deve aggiungere una frequenza dell’1% e quindi per la legge di Hardy-Weinberg almeno il 2% della popolazione deve essere eterozigote per quel carattere unifattoriale. Per allele frequente si intende allele non raro, senza significato patologico, svantaggioso o vantaggioso. E può essere variabilità.

Un esempio di polimorfismo genetico è il gruppo sanguigno AB0, dove per gruppo sanguigno si intende il fenotipo di un certo individuo che può essere: A, AB, B, 0. Per sapere il gruppo sanguigno di appartenenza, si prende poco sangue da quell’individuo, si cimenta sui globuli rossi con degli anticorpi anti-A ed anti-B ed a seconda del tipo di reazione avuta si mette l’individuo in una certa categoria perché se l’individuo di gruppo A significa che sui suoi globuli rossi ci sono gli antigeni di tipo A, non ci sono quelli di tipo B; se un individuo è di gruppo B si ha il contrario; se un individuo è di gruppo AB vuol dire che sui suoi globuli rossi ci sono antigeni sia A che B; se un individuo è di gruppo 0 vuol dire che non ha antigeni né A né B. Quindi nel momento in cui si cimentano i suoi antigeni con gli anticorpi specifici, a seconda che ci sia o non ci sia un certo antigene ci sarà il riconoscimento antigene-anticorpo.

Dietro il fenotipo di un genotipo, il locus uno a questo locus AB0, posso avere 3 alleli diversi nella popolazione, ma in ciascun individuo sono presenti 2 alleli al locus. Se un individuo ha il fenotipo A può essere omozigote (I^A I^A) o (I^A i⁽⁰⁾); se è di gruppo AB avrà un allele I^A ed un allele I^B; se è di gruppo B sarà 0 (I^B I^B) o (I^B i⁽⁰⁾); se è di gruppo 0 sarà necessariamente omozigote i⁽⁰⁾i⁽⁰⁾. Quindi in totale gli alleli sono 3: I^A, I^B, i⁽⁰⁾. Emerge che sia I^A che I^B sono dominanti su i⁽⁰⁾ ed I^A ed I^B sono tra loro codominanti (insieme danno fenotipo AB) ed i⁽⁰⁾ è recessivo. In totale quindi abbiamo 4 fenotipi comuni. È un polimorfismo perché sia I^A che I^B che i⁽⁰⁾ sono molto frequenti nella popolazione, tanto che facendo uno screening troveremo tante persone di gruppo A, tante AB, tante B, tante 0. Perché non si parla di frequente né nei genotipi né nei fenotipi? Perché le frequenze dipendono poi dalla popolazione (caucasica, asiatica, etc). Si parla comunque di polimorfismo perché tutti gli alleli sono tutti molto frequenti in tutte le popolazioni e raggiungono la soglia dell’1%.