Genetica Prof. Landi

Genetica

Regola di Chargraff

• La prima regola mostra l'esistenza di un rapporto 1:1 tra le basi puriniche (A+G) e le basi pirimidiniche (T+C) contenute nel DNA di una cellula. Il rapporto è costante in tutte le specie, ma per specie diverse le percentuali delle varie basi saranno anch'esse diverse. Questo rispecchia la diversità genetica delle diverse specie.

• La seconda regola mostra che in una molecola di DNA a doppio filamento la concentrazione di adenina eguaglia quella di timina e la concentrazione di citosina eguaglia quella di guanina (%A = %T; %C = %G). I nucleotidi della doppia elica del DNA si appaieranno quindi nella seguente maniera A=T; G=C.

Tautomeria delle basi

L’esistenza di forme tautomeriche delle basi rende possibile alcune variazioni, minori, nella forma e nella costituzione del DNA. Alla luce di quanto abbiamo detto prima, riferendoci all’appaiamento tra A-T e G-C, la presenza di forme tautomere di basi rende possibile varianti che, ad esempio, portano alla formazione di A-C e T-G.

Struttura del DNA e RNA

DNA: A. T. T. G. A. A 5’ 3’

Doppia elica antiparallela 5’3’ T. A. A. C. T. T filamento stampo per mRNA

RNA: 5’ CAP Poli A 3’ Singolo filamento A. T. T. G. A. A direzione di trascrizione e traduzione

Enzimi e processi di replicazione

RNA polimerasi: enzima per la trascrizione di un filamento di mRNA a partire dal DNA. La traduzione dell’mRNA segue la direzione 5’ (inizio del gene)—>3’(fine del gene), la sintesi di tale filamento ha quindi come stampo quello 3’—>5’ del DNA.

DNA polimerasi: enzima per la replicazione del DNA innescata da un primer (RNA sintetizzato dalla primasi), che polimerizza i nucleotidi sulla base dei due filamenti stampo, il filamento 3’—>5’ godrà di una replicazione continuata, mentre il filamento 5’—>3’ avrà una replicazione discontinua. Il proofreading (o correzione di bozze) è quel processo attraverso cui la DNA polimerasi che sta replicando il DNA rileva l'appaiamento di un nucleotide scorretto e lo rimuove.

Elementi genetici e strutture

Plasmide: piccolo frammento di DNA circolare vantaggioso per l’organismo ma completamente autonomo da esso.

Gene: sequenza di nucleotidi costituente un’unità di regolazione o trascrizione per la sintesi di mRNA o RNA.

Genoma: intero corredo di geni appartenenti ad un organismo, compresi DNA mitocondriale e cloroplastidiale. Il genoma umano è composto da 22 coppie di cromosomi omologhi (autosomi) ed una coppia di cromosomi sessuali.

Cromosomi e loro strutture

Cromosomi omologhi: ciascuno dei due cromosomi che si appaiano durante la meiosi I. Negli organismi diploidi le coppie di cromosomi omologhi sono formate da cromosomi con gli stessi loci ma diverse sequenze nucleotidiche (alleli diversi).

Cromatidi fratelli: i due cromatidi identici (loci e sequenze uguali) che si formano per duplicazione del cromatidio parentale durante la fase S (sintesi) del ciclo cellulare e rimangono uniti tra loro a livello del centromero. Nelle fasi successive della divisione nucleare i due cromatidi si separano e vengono distribuiti ad ognuna delle cellule figlie.

Concetti di genetica

Allele: una delle forme alternative che un gene può assumere nel medesimo sito (locus) cromosomico; spesso l'effetto di uno dei due alleli (detto dominante) è prevalente ai fini dell'espressione del carattere, rispetto a quello dell'altro allele (detto recessivo).

Cariotipo: cromosomi appartenenti al genoma di un individuo ordinati secondo la loro dimensione.

Telomero: strutture costituenti le estremità cromosomiche che stabilizzano e compattano la cromatina. Ad ogni ciclo cellulare a causa della replicazione discontinua del filamento 3’—>5’ il telomero viene in parte consumato fino ad una senescenza replicativa, a meno che non siano allungati dall’enzima telomerasi; presente nelle cellule staminali e tumorali. I telomeri sono costituiti da sequenze mini-satellite standard (es. TTAGGG) ripetute n° mila volte.

Ciclo cellulare

• Interfase:
  • G1: Fase di quiete in cui la cellula raddoppia le sue dimensioni in attesa di stimoli esterni alla replicazione. Produce nuovi organelli ed enzimi per la duplicazione del DNA. 1° check-point di controllo: L’ambiente è favorevole?
  • S: A seguito di stimoli avviene la replicazione del DNA: A differenza del primo filamento di senso concorde alla DNA polimerasi (3’—>5’), il secondo filamento viene sintetizzato a pezzi (frammenti di Okazaki). Gli istoni del nucleosoma di partenza vengono smontati e ridistribuiti casualmente alle molecole di DNA figlie assieme agli istoni neo-sintetizzati. Questa associazione istoni-DNA è mediata dal fattore di assemblaggio della cromatina CAF1 che lega gli istoni e li indirizza alla forca replicativa. CAF1 arriva alla forca replicativa mediante il legame con l’antigene nucleare delle cellule proliferative PCNA.
  • G2: Avviene il 2° check-point di controllo mediato dalla proteina P53 che verifica eventuali danni al genoma replicato, inoltre la cellula si prepara alla mitosi producendo Cicline e Chinasi-ciclino-dipendenti, molecole che regolano l’inizio e la fine della mitosi.
• Mitosi:
  • Profase:
    • La condensazione del DNA è stimolata dalla fosforilazione dell’istone H3.
    • La membrana nucleare si disgrega.
    • Le coesine che uniscono i cromatidi fratelli vengono eliminate a livello periferico.
  • Metafase:
    • Precoce—> migrazione dei centrioli ai poli opposti della cellula.
    • Formazione del complesso del fuso mitotico.
    • Aggancio dei microtubuli sui centromeri dei cromosomi nel complesso del cinetocore.
    • Tardiva—> allineamento equatoriale dei cromosomi. 3° checkpoint di controllo (aggancio corretto di tutti i cromosomi).
  • Anafase:
    • Rimozione delle coesine anche a livello centromerico.
    • Migrazione dei cromatidi fratelli singoli ai poli opposti della cellula.
  • Telofase:
    • Decondensazione del DNA.
    • Riformazione della membrana nucleare in 2 nuclei distinti.
    • Citodieresi.

Meiosi

È un processo di divisione mediante il quale una cellula eucariota con corredo cromosomico diploide dà origine a quattro cellule con corredo cromosomico aploide. Da una cellula madre si formano quattro cellule figlie, tutte diverse fra loro.

Meiosi I

La prima meiosi è chiamata riduzionale poiché da una cellula diploide si generano due cellule aploidi a causa dell'appaiamento dei cromosomi omologhi. Inoltre, al contrario della seconda meiosi, è preceduta dalla duplicazione del materiale genetico.

• Profase I:
  • Leptotene: in cui il materiale genetico si condensa a formare strutture bastoncellari in forma di filamenti sottili, allungati, non scissi longitudinalmente.
  • Zigotene: durante il quale avviene l’appaiamento dei cromosomi omologhi a formare una tetrade. L'appaiamento dei cromosomi omologhi avviene grazie ad una struttura sub-microscopica proteica, il complesso sinaptinemale.
  • Pachitene:
    • Precoce: in cui si completa l'appaiamento degli omologhi.
    • Avanzato: in cui i cromosomi si accorciano, si inspessiscono e avviene il crossing-over, che però ancora non si nota.
  • Diplotene: in questo stadio i cromosomi omologhi cominciano a separarsi, soprattutto a livello del centromero, per la progressiva scomparsa del complesso sinaptinemale. Tuttavia i due cromatidi di ciascuna coppia di omologhi restano in contatto grazie a connessioni chiamate chiasmi, segni visibili dell'avvenuto crossing-over.
  • Diacinesi: i cromosomi completano la loro condensazione e sono chiaramente visibili. Ormai è ben formata la tetrade o bivalente e avviene la dissoluzione della membrana nucleare e del nucleolo. Durante la profase I, inoltre, si sviluppa il fuso, costituito da due coppie di centrioli, situate ai poli opposti della cellula, da cui fuoriescono fibre di microtubuli. Tali fibre agganciano i cromosomi mediante il cinetocore, una piastra proteica situata a livello del centromero. La profase I può durare per giorni o anche più a lungo e occupa il 90% del tempo richiesto per quasi tutta la divisione meiotica.
• Sinapsi: è quel processo mediante il quale i cromosomi omologhi si mettono in coppia durante la profase I. Ciascun cromosoma è formato da due cromatidi, e quindi quattro cromatidi formano una tetrade. In seguito alla sinapsi degli omologhi può avvenire il crossing-over, un processo mediante il quale i cromosomi omologhi si scambiano sequenze equivalenti, determinando nuove combinazioni di geni e favorendo l'evoluzione. Il risultato visibile del crossing-over è una struttura a croce chiamata chiasma (croce di Holliday). In ciascun chiasma i cromosomi omologhi possono scambiarsi segmenti di cromatidi.
• Metafase I: Le fibre del fuso si collegano ai cromosomi: ogni cromosoma, diviso in 2 cromatidi tenuti insieme dal centromero, è legato tramite gli asteridi alle fibre del fuso. Le fibre allineano tutti i cromosomi lungo la piastra equatoriale.
• Anafase I: A differenza dell'anafase mitotica, durante questa fase i cromatidi fratelli restano attaccati per mezzo dei centromeri, mentre i cromosomi omologhi si staccano e migrano ai poli opposti della cellula. In questo modo si ha un corredo cromosomico aploide proprio perché sono gli omologhi parentali a separarsi.
• Telofase I: La telofase I può variare a seconda della specie. In seguito alla migrazione dei cromosomi omologhi verso i poli opposti della cellula, si può verificare la formazione della membrana nucleare e la citodieresi con la conseguente scissione cellulare, come avveniva nella mitosi; oppure vi è la semplice migrazione dei cromosomi senza scissione.
• Interfase: In alcuni casi, terminata la meiosi I, può avvenire l'interfase in cui i cromosomi si despiralizzano; in molte specie si passa invece direttamente dalla telofase I alla profase II.

Meiosi II

La seconda divisione meiotica è identica alla mitosi: i cromatidi fratelli si separano e sono generate quattro cellule aploidi con lo stesso materiale genetico delle due cellule madri aploidi risultanti dalla meiosi I. (IL DNA NON SI REPLICA!!)

• Profase II: Compaiono nuovamente le fibre del fuso che agganciano i cinetocori dei cromosomi. Nel caso si sia verificata una scissione durante la telofase I, la membrana nucleare si dissolve affinché i microtubuli del fuso possano attaccarsi ai cromosomi.
• Metafase II: I cromosomi si toccano sulla piastra equatoriale; ogni cromosoma è costituito da due cromatidi fratelli.
• Anafase II: I centromeri dei cromosomi dei cromatidi fratelli si staccano e i cromatidi si dividono, migrando ai poli della cellula. In questa fase avviene l’assortimento indipendente.
• Telofase II: Ai poli opposti della cellula si cominciano a formare i nuclei e avviene la citodieresi, con la conseguente scissione cellulare, i microtubuli del fuso scompaiono. I quattro nuclei contengono un numero aploide di cromosomi.

Assortimento indipendente

Disposizioni casuali dei cromosomi non omologhi paterni e materni nel corredo cromosomico del gamete 23 cromosomi paterni 2²³ possibili combinazioni 23 cromosomi materni.

DNA etero-duplex

Sono frammenti di DNA non esattamente appaiato al momento del crossing-over.

Costruzione di linee evolutive

Un albero evolutivo è un diagramma semplificato che mette in relazione le varie specie sulla base della similarità tra le sequenze di un determinato gene comune. A sinistra è mostrato l’albero evolutivo basato sul confronto delle sequenze del citocromo c nei vari organismi, i numeri indicano il livello di sostituzioni nucleotidiche che ci sono state lungo le linee evolutive del gene codificante la proteina e le distanze sono proporzionali ad essi.

Genetica diretta

Trattamento di cellule wild-type (normali) con agenti mutageni. Selezione della mutazione—> scoperta del gene—> sequenziamento del DNA e funzione del gene. Se il gene è stato studiato in organismi sperimentali, grazie all’omologia evolutiva della sua sequenza è molto probabile che la sua funzione sia nota (uguale a quella che esercita in questi organismi).

Genetica inversa

Conosco la sequenza del gene (esplorata da un sequenziamento di tutto il genoma). Gene (Sequenza del DNA)—> inibizione del gene—> funzione del gene (confrontando il wild-type).

Mendel

Legge della dominanza dei caratteri

Incrociando due individui omozigoti che differiscono per una coppia allelica, otterremo alla prima generazione individui tutti uguali il cui fenotipo è dato dall'allele dominante.

Generazione parentale P. AA x aa a gameti di P. A A a a. Prima generazione finale F1. tutti Aa A Aa Aa Aa Aa A quadrato di Punnet

Legge della segregazione

Durante la generazione della prole, gli alleli associati a uno stesso gene si separano tra di loro, facendo sì che ad ognuno dei due gameti giunga solo uno degli alleli stessi.

Prima generazione finale F Aa x Aa1. A gameti di F A a A a1.

Seconda generazione finale F AA; Aa; aA; aa2. A AA Aa. Incrociando l’individuo portatore del gene ignoto con il wild-type posso osservare in base al rapporto di segregazione degli alleli Aa aa la recessività/dominanza o il tipo di eredità del gene scelto.

Legge dell'assortimento indipendente

Durante la formazione dei gameti, coppie alleliche su coppie cromosomiche diverse si distribuiscono indipendentemente, i geni sullo stesso cromosoma non assortiscono indipendentemente in quanto tenuti insieme dal cromosoma stesso.

Terminologia

• Zigote: prima cellula che si sviluppa in un individuo.
• Omozigote: individuo con la coppia di alleli di un gene identici (AA, aa).
• AA—> omozigote dominante
• aa—> omozigote recessivo
• Eterozigote: individuo con la coppia di alleli di un gene diversi (Aa).
• Genotipo: tutte le combinazioni alleliche alla base di un fenotipo (AA, Aa, aa).

Interazioni geniche

• Alleli nulli (o recessivi): a causa di una mutazione le proteine codificate da questi alleli sono completamente prive di una funzione biologica.
• Mutazioni leaky: sono mutazioni sugli alleli che riducono la funzionalità enzimatica senza comprometterla del tutto.
• L’allele recessivo manifesta l’incapacità di codificare correttamente determinate proteine che manifestano un dato fenotipo. Se però sull’altro allele è presente il gene dominante (in grado di codificare correttamente la proteina del locus) possiamo distinguere due casistiche:
• Aplosufficienza: L’allele dominante presente in singola copia è sufficiente per una corretta produzione della proteina in questione.
• Aploinsufficienza: L’allele dominante presente in singola copia non è sufficiente per produrre abbastanza proteina ed il fenotipo non si manifesta.
• Dominanza negativa: L’allele codificante una proteina a più sub-domini, produce a causa di una mutazione una proteina anomala che va a sequestrare la proteina wild-type alterandone la corretta funzione (in genere si verifica in proteine omo-dimeriche in cui una delle due sub-unità mutata altera quella wild-type osservando quindi un’alterazione della sua corretta funzionalità).
• Dominanza incompleta: Il fenotipo che viene osservato in un eterozigote è intermedio tra quelli dei due omozigoti, manifestandosi in base alla scala quantitativa di presenza della proteina nelle cellule.