Genetica

Genetica

Genoma umano:

genoma cellulare (piccola porzione

codi cante) + genoma mitocondrio

(maggiormente codi cante)

Caratteristiche: (Mb megabase)

Piastra metafasica (solo durante la metafase è possibile osservare i cromosomi compatti): insieme

dei cromosomi umani contenenti in una cellula, sono 46 cromosomi ed è stato possibile

identi carli e numerarli tramite l’utilizzo della tecnica del bandeggio (n1 più grosso) e

successivamente eseguito il sequenziamento grazie al quale è stato possibile quantizzare la

quantità di DNA contenente in ciascun cromosoma (cromosoma n1 ne contiene di più e via a

diminuire, eccezioni n9 ne contiene di meno del n10 e il n11 ne contiene di più).

Cromosomi sessuali de niti con lettere e non con i numeri ovvero XX femmine o XY maschi

(cromosoma Y molto piccolo).

Telomeri: estremità del cromosoma

Centromero: porzione centrale di unione

I cromosomi nella maggior parte del loro ciclo cellulare non si trovano nella forma condensata

presente durante la piastra metafasica.

Bandeggio:

Cromatidi fratelli ovvero contengono

copie identiche del DNA e stessa

quantità di DNA, si formano durante la

metafase in cui il DNA è altamente

compattato; al momento della

separazione i due cromatidi fratelli si

separano nelle cellule glie per

diventare cromosomi.

Nell’immagine i due cromatidi fratelli si

trovano a ancati.

Bandeggio G (Gimsa): si utilizza un

enzima (ex tripsina) che degrada le

proteine di rivestimento del

cromosoma che lo rendono compatto

e quindi avremo delle regioni più

rilassate e regioni meno rilassate

ottenendo delle colorazioni di erenti. Colorazione eseguita con colorante gimsa che si lega

maggiormente alle regioni compatte dando bande scure e di meno alle regioni rilassate dando

bande chiare (bandeggio cromosoma-speci co e uguale in ogni individuo).

Bandeggio Q: …. 1

Silvia Turini

fi fi ffi fi fi fi ff fi

Mitosi e meiosi

Le cellule non sono obbligate a dividersi ma possono rimanere quiescenti ovvero nello stato G0

interposto tra la fase M e G1 (ex neuroni).

Fasi:

- G1 fase di accrescimento cellulare (maggioranza del tempo di una cellula); i cromosomi in

questa fase sono lamenti a doppia elica di DNA quindi nello stato rilassato, il centromero

esiste come struttura ma non è ra gurabile

- S fase di replicazione semiconservativa del DNA cosi da ottenere i cromatidi fratelli sempre

nello stato rilassato (sempre 46 cromosomi ma duplicati)

- G2 in cui si completa la fase S e rappresenta una fase di controllo, se è presente un errore la

cellula va incontro ad apoptosi sennò procede nella fase successiva

- M fase di divisione cellulare in cui abbiamo la formazione dei cromosomi

Ploidia: si riferisce a n ovvero numero dei cromosomi nel loro set aploide (noi abbiamo 46

cromosomi in 23 coppie di cromosomi omologhi e quindi abbiamo una ploidia di 2 con n=23

quindi siamo diploidi ovvero 2n).

Cromosomi omologhi: non sono identici in quanto non portano la stessa sequenza di DNA ma

hanno lo stesso ordine dei geni (portano la stessa funzione ex colori occhi ecc) composti da

sequenze di erenti (cromatidi fratelli invece hanno stessi geni e stessa sequenza).

Cellule in divisioni sono sempre diploidi, se nella fase G1 ho un contenuto di DNA C nella fase G2

ho una quantità di DNA 2C (sempre 46 cromosomi ma ogni cromosoma è stato duplicato) e

quindi nella fase M ho la cellula madre 2n 2C e le cellule glie 2n C.

Interfase: tutte le fasi del ciclo cellulare tranne la fase M in cui non sono visibili i cromosomi in

quanto sono strutture lamentose (visibile il nucleolo che presenta una quantità di DNA peculiare

e più addensato ma non si vedono i cromosomi).

Il cromosomi presenta dei domini che rimangono più compatti (ex il centromero).

Cromatina: unità strutturale del DNA associato a proteine.

Mitosi

Fasi:

- profase: i cromosomi iniziano a condensare e

ad essere visibili

- metafase: abbiamo la formazione della piastra

equatoriale e sono visibili i cromosomi

- anafase: disgregazione dei centromeri e

migrazione dei cromosomi gli (cromatidi

fratelli)

- telofase: formazione delle cellule glie diploidi

identiche geneticamente alla cellula madre,

ogni cromosoma omologo è costituito da due

cromatidi fratelli

Meiosi

Formazione dei gameti ovvero cellule aploidi (n) quindi deve avvenire una divisione riduzionale.

Fasi (abbiamo due cicli di divisione: meiosi 1 e meiosi 2):

- profase 1: avviene il fenomeno della ricombinazione; presenta delle sottofasi

leptotene: cromosomi risultano visibili in lamenti

• zigotene: cromosomi omologhi si appaiono (grazie all’intervento di proteine che

• uniscono sequenze omologhe), utile alla cellula per identi care i due omologhi e

veri care un controllo sulla presenza di tutti gli omologhi, e si ha la formazione del

complesso sinaptonemale in cui si veri cano le sinapsi (cromosomi omologhi 2

Silvia Turini

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nell’interfase non sono vicini e all’interno del nucleo sono localizzati

in regioni distinte, visualizzato attraverso le sonde)

pachitene: ispessimento dei cromosomi omologhi

• Tetrade

diplotene: separazione tra i cromosomi omologhi detta desinapsi e

• avremo solo alcune regioni dove rimangono in contatto detti chiasmi

in cui si veri ca una ricombinazione detta crossing-over ovvero

scambio di materiale genetico (non abbiamo più i cromatidi fratelli in

quanto non sono più identici, abbiamo solo cromosomi omologhi e

vengono detti cromatidi ricombinanti; non è cambiato l’ordine dei

geni ma è cambiata la successione)

- profase 1 tardiva: sono sempre presenti i

chiasmi (cromosomi lunghi possono

avere 2-3 chiasmi, cromosomi piccoli 1)

- metafase 1: uguale alla mitosi ma si

separano i cromosomi omologhi cosi da

ottenere una riduzione della quantità di

DNA (da 2C a C e ottengo cellule glie n)

- telofase 1: fase transitoria in cui si ha una

parziale decondensazione utile per il

funzionamento di alcuni geni

- meiosi 2 è identica alla mitosi; di erenze

è che non abbiamo i cromatidi fratelli, la

quantità di DNA nelle cellule glie è C/2 Metafase 2

con 23 cromosomi (unioni gameti ottengo Risultato

46 cromosomi e quantità di DNA C) e

abbiamo 4 cellule glie

Esistono organismi che hanno una fase aploide più lunga (ex piante) in cui i gameti non vanno

subito incontro a procreazione ma proliferano per mitosi sviluppando speci che strutture e

successivamente abbiamo l’unione dei gameti.

Altri organismi hanno un ciclo aplodiplonte ovvero metà del ciclo vitale aploidi e metà diploidi (ex

funghi).

Ciclo riproduttivo ascomiceti ovvero funghi lamentosi (importanti per studio della meiosi):

Sono formati da un micelio vegetativo e un micelio aereo utili per disperdere le spore aploidi;

riproduzione asessuata ovvero dispersione nell’ambiente delle spore, riproduzione sessuale

abbiamo l’unione di spore provenienti da funghi di erenti quindi abbiamo la fusione delle ife o con

strutture di erenti.

Ricombinazione

Processo voluto dagli organismi e regolato da proteine ed

enzimi, non è un processo spontaneo (processo spontaneo

di ricombinazione si ha quando un cromosoma viene rotto

tramite ex agenti sici). Cromosoma omologo 1

Cromosoma omologo 2

Eventi:

- rottura di un singolo lamento di DNA detta Nick su

entrambi gli omologhi, incrocio dei due lamenti e unione

- l’incrocio viene fatto scorrere di circa 20-200 nt ottenendo

DNA eteroduplex ovvero quando una emielica non è No

Ricombinazione

perfettamente appaiata con l’altra emielica in quanto ricombinazione

presentano una sequenza di erente, possiamo ottenere la

struttura di Holliday attraverso isomerizzazione (rotazione

di 180°)

- se ho taglio verticale della struttura di Holliday allora ottengo cromatidi

ricombinati, mentre se ho taglio orizzontale ottengo cromatidi che terminano

con lo stesso colore e quindi non abbiamo ricombinazione; entrambe le 3

Silvia Turini

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strutture però presentano DNA eteroduplex per un breve tempo in quanto viene percepito dalla

cellula come una mutazione/errore e quindi tenderà a ripararlo rimpiazzando le basi non

appaiate utilizzando come lamento stampo uno dei due lamenti, processo detto conversione

genica (perciò nel caso del taglio orizzontale riottengo i cromatidi originali)

Presenza di eteroduplex venne ipotizzata attraverso le archeospore in quanto le cellule glie

presentavano un fenotipo di erente dalle aspettative (non poteva essere una mutazione in quanto

era troppo frequente).

Allele: sequenza di DNA che speci ca per una certa caratteristica/variante (ovvero dice se ho

capelli neri o biondi), quindi è variante di un determinato gene.

Gene: unità di DNA codi cante per proteina ed è ereditabile (locus genico mi identi ca la

posizione di un determinato gene).

Locus: è una determinata posizione all'interno del cromosoma, di dimensioni variabili (un

nucleotide o una regione).

Caratteristiche DNA

- contiene le informazioni

- proprietà strutturali che assicurano una replicazione fedele da cellula a cellula e stabile con le

generazioni (eccezioni sono le mutazioni)

Composto da deossiribosio (zucchero pentoso, molecola eterociclica in quanto ha un ossigeno al

vertice) + base azotata + gruppo fosfato.

Deossiribosio: non presenta OH in posizione 2’ ma solo al 3’ (nell’RNA invece è presente in

entrambe le posizioni).

Base azotata: legata al C 1’, classi cate in pirimidine (anello esoso, C e T) e purine (doppio anello

pentoso e esoso, A e G).

Gruppo fosfato: legato al C 5’.

Nomenclatura: base + zucchero = deossi-nucleoside (ex deossi-adenosina o deossi-citidina)

base + zucchero + fosfato = deossi-nucleotide (ex deossi-adenosina monofosfato)

RNA è più labile in soluzione mentre il DNA è più stabile in soluzione e quindi è più facilmente

conservabile.

Regole di Charga : scoprì che in tutti gli organismi vi erano delle regole sempre mantenute ovvero

G=C e A=T (con quantità di erenti a seconda della specie) e il rapporto purine:pirimidine=1 (A+T

diverso da C+G).

Watson e Crick: costruirono un modello che rappresentava la struttura del DNA sulla base delle

regole di Charga e altre informazioni.

Esperimenti di di razione della luce: fenomeno sico per cui un'onda quando incontra

un’ostacolo devia; in questo caso si usa una fonte di luce con un’unica lunghezza d’onda e con i

fotoni con stessa frequenza ovvero una luce coerente (ex laser). L’utilizzo di questo fenomeno può

essere utilizzato per ottenere la struttura di molecole semplici che devono essere cristallizzate

ovvero le molecole vengono disidratate e si compattano a formare delle strutture ordinate.

Tecnica utilizzata per lo studio anche della struttura del DNA in cui si

utilizzarono i raggi X.

Doppia elica di DNA: lo scheletro è formato da zucchero e gruppo

fosfato, mentre le basi si trovano all’interno e sono planari perpendicolari

all’asse dell’elica.

Presenta una polarità in cui la testa è all’estremità 5’ e la coda è

all’estremità 3’ (5’->3’) direzione in cui si aggiungono anche i nucleotidi.

Inoltre i lamenti sono antiparalleli.

Le basi complementari (geometria dell’appaiamento mantiene costante

la forma del DNA) sono appaiate tramite legami idrogeno e anche se

sono legami deboli nell’insieme mantengono stabile la doppia elica. 4

Silvia Turini

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T=A presentano due legami ad idrogeno e infatti sono presenti nelle regioni di DNA che devono

essere facilmente apribili ovvero denaturabili (denaturazione può essere eseguita attraverso un

aumento della temperatura o trattandolo con soluzioni basiche forti pH=10 che vanno a indebolire

la struttura; la cellula usa degli enzimi).

Struttura ad elica viene indotta in quanto in soluzione acquosa tende a compattarsi e presenta un

solco minore e un solco maggiore quindi non è un’elica lineare; inoltre il DNA può presentare varie

forme in soluzione che di eriscono per passo e attorciglianti (ex forma Z, B e A), quindi all’interno

della cellula la forma del DNA non è costante.

Replicazione del DNA procarioti

Apertura della doppia elica nelle regioni ricche di AT a 37° tramite

l’utilizzo di enzimi e proteine SSB che impediscono il riappaiamento

delle basi della doppia elica mascherando i punti utili alla formazione

dei legami a idrogeno.

Nel DNA procariotico abbiamo un unico sito di inizio della replicazione

composto da una sequenza ricca di AT e da regioni dette box

composte da sequenze speci che utili come siti di riconoscimento per

le proteine. L’interazione tra proteina-DNA avviene grazie ai residui

amminoacidici delle proteine che interagiscono con speci che basi e

possono tollerare delle piccole di erenze con la sequenza di

riconoscimento (ex proteina che riconosce sequenze ricche di AT ma la

sequenza di riconoscimento presenta delle di erenze l’interazione

avviene uguale; per l’interazione DNA-DNA deve avvenire un

appaiamento perfetto).

Eventi:

- legame tra proteina e regioni box

- apertura della doppia elica con formazione della bolla di replicazione

- reclutamento del replisoma ovvero insieme degli enzimi che mediano

la replicazione (ex DNApol e elicasi utile per mantenere aperta la

doppia elica)

- replicazione

Reazione di polimerizzazione

Sintesi direzionata e coordinata; occorre un templato rappresentato dal lamento 3’->5’, enzima

DNA polimerasi (legge il templato 3’->5’ e sintetizza il nuovo lamento in direzione 5’->3’) e i

nucleotidi trifosfati utili anche per fornire l’energia. L’OH in posizione 3’ si lega al fosfato alfa, con

un legame fosfoesterico, del nucleotide trifosfato con liberazione del pirofosfato (poi degradato

dalla pirofosfatasi con liberazione di energia utile per stabilizzare la doppia elica replicata e

rendere la reazione irreversibile).

DNA polimerasi necessita di un primer che dispone di un gruppo OH libero al 3’.

DNA polimerasi

Classi cate con i numeri romani; la più di usa e importante è la DNA polimerasi 3 con una

processività di 1000 nt/sec e la DNApol 1 ha una progressività di 20 nt/sec.

DNA polimerasi procariotica è composta da un’unica proteina, mentre quelle eucariotiche sono

formate da un complesso proteico.

L’attività caratteristica è un’attività polimerasica 5’->3’, inoltre hanno un’attività di correzione di

bozze detta proof-reading con la funzione di idrolizzare e rimuovere i nucleotidi errati alle

estremità dei lamenti detta attività esonucleasica (endonluceasi danno un taglio netto nel mezzo

del DNA) e ha una direzione opposta all’attività polimerasica ovvero 3’->5’.

Le DNA polimerasi 3 e 1 hanno sia attività polimerasica sia attività esonucleasica, però la DNApol

1 ha anche un’attività esonucleasica 5’->3’ così può degradare un acido nucleico in avanti

sostituendolo con un nuovo lamento.

Fenomeno detto tautomeria ovvero quando un determinato composto

assume una di erente struttura per un breve periodo in quanto poco

stabile; ex nella citosina in cui il gruppo amminico può assumere la

forma imminica dovuto allo spostamento del doppio legame

dell’azoto così da permettere l’accoppiamento con l’adenina detto

appaiamento non convenzionale (anche l’adenina può avere una 5

Silvia Turini

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forma imminica), mentre per timina e guanina abbiamo le forme enoliche in cui abbiamo lo

spostamento del doppio legame dell’ossigeno dando un appaiamento T=G.

Queste rappresentano delle fonti di errore ovvero delle mutazioni; meccanismi della cellula per

proteggersi attraverso l’attività di correzione della DNApol durante la replicazione o dopo la

replicazione attraverso il meccanismo DNA mismatch repair svolto da un gruppo di enzimi.

Durante la replicazione (sia eucarioti sia procarioti) avrò un lamento principale (sintesi continua) e

un lmato ritardato (sintesi discontinua).

Nel lamento ritardato abbiamo

l’utilizzo di più primer (nel lamento

principale ne abbiamo uno solo)

sintetizzati dalla RNA primasi

(possono anche presentare degli

errori in quanto il loro unico scopo è

quello di fare da innesco per la

DNApol e successivamente rimossi)

che portano alla sintesi dei frammenti

di Okazaki tramite la DNApol 3.

La DNApol 3 quando incontra l’ibrido

di RNA-DNA si distacca e interviene

la DNApol 1 con la funzione di

rimuovere il primer (30-40 nt) e sostituirlo con le basi corrette e successivamente si distacca,

in ne interviene la DNAligasi che unisce i frammenti con utilizzo di ATP. Comunque i due lamenti

vengono sintetizzati alla stessa velocità in quanto è un processo coordinato.

Fedeltà di errore <10^-10 grazie alla correzione di bozze, risultato migliore raggiunto con la DNA

mismatch repair (da 0 a 3 errori per un lamento lungo 3 miliardi di nt).

Struttura DNA eucariotico

Nucleosoma scoperto con esperimento che prevedeva l’utilizzo di una DNasi e osservazione con

elettroforesi su gel, mano a mano che la digestione procedeva si formavano dei cammini su gel

di erenti in quanto l’enzima andava a degradare i frammenti di DNA non protetti dalle proteine

no ad ottenere una singola banda contenenti solo i nucleosomi.

Nucleosoma (spesso 10 nm) è l’unità di base della cromatina (unità strutturale del DNA), formato

da DNA avvolto da otto istoni (uguali due a due, H2A H2B H3 H4) e mantenuto dall’istone H1

(proteine particolari ricche di arginina