Genetica molecolare

GENETICA MOLECOLARE

Lezione 04.03.21

PENETRANZA LEGATA ALL’ETA’: es. malattia di Huntington, che ha una mutazione nel gene che

codifica per una prolina all’interno del gene Huntingtina, in cui c’è il fenomeno di anticipazione

(malattia neurodegenerativa fatale). Si è però visto che, nel caso di appaiamento sfalsato, in

seguito a ricombinazione (da un lato aumentano i codoni e dall’altro diminuiscono) la malattia è

più aggressiva= ANTICIPAZIONE DEL FENOTIPO nelle progenie successive (es. genitori che

manifestano a 50 anni, avranno i figli che, se hanno l’allele ricombinato sfalsato con aumento del

numero di codoni, manifestano prima e in maniera più aggressiva).

INBREEDING: quando si viene a generare una progenie da due individui consanguinei, perché si

hanno gli alleli nella stessa posizione e la possibilità di avere delle malattie autosomiche recessive

è molto ampia.

MAPPA GENETICA= fornisce un’idea della disposizione dei geni ma NON delle reali distanze tra i

geni (MAPPA FISICA DEL GENOMA)

DOMINANZA PER APLOINSUFFICIENZAà es. Arabidopsis

Thaliana con due mutazioni che cadono nello stesso locus

sugli alleli ref4-4 e ref 4-3.

Entrambe le piantine non wildtype sono in condizioni di

eterozigosità, ed entrambe le mutazioni generano una loss of

function

La mutazione ref4-4 genera un fenotipo molto simile a quello

wildtype, perché l’allele non mutato è in grado di sopperire

alla perdita, mentre ref4-3 ha una notevole differenza.

In ref4-4 ho una mutazione puntiforme che non altera

completamente la funzione del gene, mentre in ref4-3 ho una

mutazione più estesa che comporta un allele nullo, il

fenomeno è dominante perché la quantità di enzima prodotta

dall’allele wild type non è sufficiente a superare la soglia per

determinare un fenotipo normale =aploinsufficienza

Per dimostrare che si tratti effettivamente di un fenomeno di aploinsufficienza, possiamo andare a

sovra produrre il prodotto del gene non mutato (con dCas9) e ristabilire la condizione wildtype,

bilanciando la perdita di prodotto generata dall’allele che ha perso la funzionaà si ottiene di

nuovo un fenotipo dominante

DOMINANTE NEGATIVOà è una loss/gain of function (è un mix) perché il dominante negativo è

un allele che va ad interferire con la funzione di quello selvatico.

Es. recettore di membrana che dimerizza a seguito del

legame con un legame specifico (es. recettore tirosin-

chinasico). Nello specifico ho una omodimerizzazione.

Posso avere uno dei due domini che è mutato

(eterozigosità con una loss of function) AVRO’ UN

à

FENOTIPO DOMINANTE NEGATIVO perché la coppia

mutato-wt non genera un recettore funzionante, ma

solo la coppia wt-wt è funzionale.

Avrò quindi il 75% di attività nulla e solo il 25%

funzionante. E’ infatti necessario che entrambi i domini

riescano a riconoscere il ligando per avere un prodotto

finale > del 50%

N.B. Se ho un fenotipo di dominanza negativa (causato da una loss of function) e ho dimostrato

che non è un problema di aploinsufficienza, senza conoscere né il prodotto né l’ambiente in cui

lavora, posso stabilire a priori che il mio gene produce un fattore che è organizzato in dimeri.

Un altro fenomeno molto importante è la non complementazione del secondo sito.

REMINDERà il test di complementazione permette di capire se due mutazioni sono sullo stesso

geno o su geni diversi, incrociando un eterozigote con un omozigote recessivoß

ETEROZIGOTE COMPOSTO: combinazione di due alleli non funzionali che danno un fenotipo

diverso da quello selvatico

Non complementazione del secondo sito se dovessi avere il caso in cui due mutazioni che NON

à

sono sullo stesso gene, forniscono ugualmente il fenotipo recessivo (es. occhi bianchi in

Drodosophila)

ESEMPIO:

Ho una via metabolica che ha come obbiettivo quello di formare il pigmento rosso, quindi se per

omozigosi perdo uno degli enzimi intermedi, avrò il colore bianco.

(bianco) A (w1) B (w2) C (rosso) [w1 e w2 sono gli enzimi]

- Se ho un caso di omozigosi in w1 lo 0% di A verrà trasformato in pigmento rosso

- Se go un caso di omozigosi in w2 il 100% di A verrà trasformato in B ma poi lo 0% sarà

trasformato in C quindi tutto il prodotto sarà bianco

Perché però anche l’eterozigote w1-w2 darà un prodotto bianco?

RISàNella prima condizione di eterozigosità avrò il 50% percento di enzima w1, quindi solo il 50%

di A diventerà B, e poi il 100% di B sarà trasformato in C (tot. 50% iniziale= l’eterozigote singolo è

rosso).

Nella seconda condizione di eterozigosità avrò il 50% percento di enzima w2, il 100% di A verrà

trasformato in B e poi il 50% sarà trasformato in C (tot. 50% iniziale= l’eterozigote singolo è

rosso).

Nel caso della doppia eterozigosità w1-w2 mutati, avrò il 50% di A che viene trasformato in B e un

ulteriore 50% di B che viene trasformato in C (tot. 25% iniziale, che NON è sufficiente= il doppio

eterozigote è bianco perché la quantità di C prodotta insufficiente a generare il prodotto rosso).

N.B considera che non è detto che la quantità di prodotto minimo sia 50%, ci possono anche

essere eterozigoti composti con una funzione minima del 20%.

La non complementazione del secondo sito permette di ipotizzare che due geni abbiano

un’interazione tra di loro, ovvero che i loro prodotti siano nello stesso ambito funzionale.

Un fenomeno epigenetico è la VARIAZIONE DA EFFETTO DI POSIZIONE= diversità a livello del

colore dell’occhio di Drosophila (ha un occhio composto, cioè formato da circa 800 ommatidi -ogni

ommatidio lavora come un pixel- che formano il macchinario visivo).

REMINDERà in passato per produrre i mutanti in Drosophila venivano usati degli agenti fisici,

come ad esempio i raggi X e in particolare venivano mutagenizzati i maschi, per generare delle

alterazioni cromosomiche che sarebbero state poi evidenziate a seguito di incrociß

Avevano quindi trovato un esemplare di D. con un occhio variegato (N.B. la disposizione cromatica

degli ommatidi è completamente casuale quindi, un individuo della progenie di D. con occhio

variegato, avrà delle sfumature di colore disposte diversamente), avente alcuni ommatidi con

100% rosso, altri 100%bianchi e altri con delle sfumature intermedie.

A che cosa è dovuto però questo fenomeno? E’ determinato da un’inversione che coinvolge

à

anche una funzione del centromero Le regioni centromeriche sono formate da

eterocromatina, in cui la capacità

trascrizionale è silenziata, e addirittura, in

alcuni casi, i geni in prossimità della

regione centromerica eterecromatica

possono inattivarsi a seguito di

un’espansione della eterocromatina.

L’eterocromatina del centromero è molto

importante anche ai fini della segregazione,

ma è necessario che ad un certo punto si

arresti, per disporsi come eucromatina (più

distesa e disponibile all’attacco della

RNApol) al fine di far esprimere il gene.

Esiste, per questo, un elemento di controllo

che impedisce alla cromatina centromerica

di espandersi

Ma, quando avviene l’inversione in cis, potrebbe succedere che la zona di “scambio” comprenda

anche il gene white che, come si vede dall’immagine, è ora portato in prossimità

dell’eterocromatina centromerica e venga perso anche l’elemento di controllo dell’espansione

dell’eterocromatina. La perdita di questo elemento permette alla cromatina, in maniera del tutto

casuale di espandersi o meno, e quindi potremmo avere:

- Il caso in cui l’eterocromatina si espande fino a raggiugere w+à l’ommatidio sarà di colore

bianco

- Il caso in cui l’eterocromatina non si espande e w+ non viene silenziatoà l’ommatidio sarà

rosso

- Il caso in cui la cromatina è più o meno vicina a w+ avremo le intensità di colori intermedie

e il gene sarà più o meno espresso.

Possiamo considerare l’effetto della variegazione come una forma di mosaicismo?

RISà il mosaicismo viene definito principalmente per due cellule geneticamente diverse e/o nel

caso del cromosoma X. In questo caso nessuno dei due casi si manifesta perché le cellule sono

tutte identiche tra loro (sono tutte parte dello stesso occhio) ed essendo un individuo maschio non

abbiamo l’inattivazione di uno dei due cromosomi X. Cambia solamente la disposizione dei geni sul

cromosoma in cui è avvenuta l’inversione.

Nel caso descritto sopra abbiamo una prima mutazione (=INVERSIONE) che genera un individuo

con variegazione dell’occhio. A seguito di questa prima mutazione potremmo avere altre

mutazioni (su altri geni posti su altri cromosomi) che possono, o lasciare la situazione immutata,

oppure interagire come mutanti sull’effetto della prima mutazione:

1. Su(var)= soppressione della variegazione

Una seconda mutazione su un altro cromosoma

ha soppresso (non totalmente) l’effetto del

position-effect variegation. N.B non è una

reversione perché non abbiamo ripristinato

l’inversione.

2. E(var)= potenziamento della variegazione

Una seconda mutazione (sempre su un locus

differente) va ad aumentare la manifestazione

della prima.

Nei casi di suppressors ed enhancers, posso stabilire quali altri geni, fisiologicamente, vanno ad

influire sulla manifestazione del gene di mio interesse.

Ad esempio, per il caso 1 potrei avere una seconda mutazione su un gene che codifica per un

prodotto che permette alla cromatina di espandersi, rendendolo silenziato. Se questo prodotto

manca, la cromatina rimane immobile e il gene w+ non viene silenziatoà l’occhio sarà

principalmente rosso.

Per il caso 2 potrei invece avere una seconda mutazione, sempre sul gene che codifica per il

prodotto che permette alla cromatina di espandersi, rendendolo sempre attivo. Se questo

prodotto viene sovraespresso, la cromatina sarà sempre spinta ad espandersi e il gene w+ sarà

sempre silenziatoà l’occhio sarà principalmente bianco.

N.B. il meccanismo di soppressione e di enhancement sono meccanismi allele specifici, perché se

nel gene Suv produco una mutazione, su 10 alleli diversi, non è detto che tutte le mutazione siano

soppressorie.

ENHANCEMENT SINTETICO si manifesta quando vengono considerate due mutazioni, che prese

à

singolarmente non alterano il fenotipo, e che messe insieme generano un fenotipo recessivo.

Nell’immagine si può vedere come le

mutazioni anp2/anp3/mpk4 se prese

singolarmente danno un fenotipo pressoché

normale, mentre invece combinate in anp2-

mpk4 e anp3-mpk4 influenzano di molto la

crescita delle radici.

Si parla quindi di enhancement sintetico se

una delle due mutazioni (in questo caso

mpk4) è in grado di enfatizzare l’effetto

dell’altra

Un’estremizzazione dell’enhancement sintetico è la letalità sintetica due mutazioni differenti,

à

che separatamente generano un individuo wildtype, se combinate, sono letali. Il doppio mutante

non è vitale.

Esempioà “Zebrafish” in letalità sintetica legata

alla combinazione di particolari molecole.

Il mutante fancd2 (mutante in un gene di

riparazione del DNA) è sostanzialmente wt

Il mutante con un inibitore di Chk1 (di un check-

point del ciclo cellulare) è praticamente wt.

Se però prendo un mutante di fancd2 e inserisco

l’inibitore Chk1 avrò delle larve tutte morte, cioè

la combinazione delle due mutazioni sono

letali.

Questo fenomeno di letalità sintetica viene usato oggi nella ricerca per il cancro, al fine di

generare delle combinazioni che sono letali per le cellule tumorali e che le inducono a morte

spontanea. (Si cercano dei farmaci in grado di fare ciò)

GENETICA CLASSICA:

processo biologico identificazione mutanti trovare il gene funzione biochimica

à à à

Nel caso di Morgan che vuole occuparsi della formazione dell’occhio in D. avrò:

Formazione dell’occhioàmutante occhio whiteàlocus di w+àfunzione del gene w+

Ad oggi sappiamo che w+ è un trasportatore ATP-binding del tipo efflux (trasporto verso

l’esterno), che appartiene ad una famiglia molto grande di trasportatori (nell’uomo ce ne sono 48)

e che uno di questi trasportatori è l’ortologo del gene w+ chiamato ABCG2 (nell’uomo è specifico

per la detossificazione, ed è sovraespresso nelle cellule tumorali, specialmente in quelle nel cancro

al seno=MOTIVO PER CUI ALCUNI TIPI DI TUMORI SONO RESISTENTI AI FARMACI CHEMIOTERAPICI,

abcg2 rigetta fuori il farmaco)

Vs

GENETICA MOLECOLARE (deve sempre tener conto di quella classica):

gene clonato a funzione ignota generazione di mutanti fenotipo mutante(?) funzione

à à à

Avrò ad esempio un gene di cui non conosco la funzione (ad esempio w+) e per identificarla inizio

a generare diversi mutanti e ad osservarne il fenotipo (ad esempio mutanti white hanno occhi

bianchi). A questo punto posso fare delle ipotesi sul ruolo del gene in questione.

Qual è la differenza tra DNA ed RNA?

1. Nel DNA abbiamo il deossiribosio e nell’RNA abbiamo il ribosio

2. Nel DNA troviamo la timina, nell’RNA troviamo l’uracile

3. Il DNA contiene tutta l’informazione genetica, mentre l’RNA è molto instabile ed è

funzionale ai fini di trascrizione e traduzione (funzione di trasporto).

Esistono però alcuni particolare RNA che hanno anche attività catalitica e inoltre, è possibile

isolare in vitro degli RNA che hanno delle strutture terziarie particolari, in grado di svolgere attività

enzimaticheà si pensa quindi che inizialmente il mondo era ad RNA.

Perché allora ad un certo punto l’RNA viene rimpiazzato dal DNA?

RISà Perché è necessario mantenere l’informazione stabile

il più a lungo possibile e ciò può essere fatto grazie alla

presenza del desossiribosio che, grazie all’assenza di un

gruppo -OH sul C2, non può effettuare un attacco nucleofilo

sul fosfato, andando a rompere la catena per idrolisi.

Di conseguenza è invece importante che l’RNA possa essere velocemente degradato, proprio per il

suo ruolo di messaggero temporaneo, cioè una volta svolto il suo compitò è bene che sia

eliminato per lasciare spazio agli altri: ciò avviene grazie alla presenza, nella sua catena, del

ribosio.

Come si può spiegare la differenza di basi tra DNA ed RNA (U/T)?

RISà nelle cellule la reazione di degradazione dell’RNA avviene grazie alle RNAsi, che inizialmente

non erano estremamente competenti e nelle cellule batteriche sia DNA che RNA erano nel citosol

(no nucleo). Per questi motivi era necessario trovare un modo per poter marcare differentemente

l’RNA, che doveva essere eliminato, dal DNA: venne introdotto l’Uracile, che era il marker

bersaglio delle RNasi. Quando si ha una deamminazionde della citosina, si ottiene una citosina con

gruppo chetonico, ovvero un Uracile e, non a caso, gli enzimi più abbondanti in natura sono le

Uracil-DNA-glicosilasi (enzimi di riparazione del DNA che riconoscono la presenza dell’Uracile

come un’anomalia e lo rimuovono, generando un sito a-pirimidinico,in cui successivamente una

DNApol e una ligasi inseriscono una citosina per riparare il gap).

Lezione 08.03.21

Le mutazioni che vengono effettuate durante la genetica inversa sono sito specifiche, ad esempio

per il cromosoma, ma per la posizione effettiva sono casuali.

Il gene più grande presente nel nostro genoma è quello della distrofina (2,2Mbasi) e le mutazioni

su questo gene causano la Distrofia Muscolare di Duchenne.

Le RNasi velocizzano a pH neutro l’eliminazione dell’H in C2 al fine di facilitare l’attacco dell’O- sul

fosforo, per degradare gli RNA sia a singolo filamento che a doppio filamento.

N.B. gli RNA non sono mai totalmente a singolo filamento ma sono spesso presenti degli

appaiamenti intracatena che generano delle strutture secondarie tipiche, come ad esempio la

forcina, che possono dare particolari strutture terziarie dotate di attività catalitica.

Recentemente si è scoperto che la macchina proteica dello spliceosoma (ribonucleoproteina) vede

la sua attività catalitica nella parte di RNA presente.

Perché un ambiente basico porta alla denaturazione del DNA?

RISàla teoria di appaiamento delle basi è valida solamente a pH

neutro, poichè a variazioni di pH seguono delle tautomerie

chetoenoliche (G/T) o ammino-imminiche (A/C) che vanno a

modificare la struttura delle basi che non sono più in grado di

effettuare gli appaiamenti canonici (A-T e G-C).

Nell’immagine a sinistra ho le molecole a pH neutro e a destra

quelle a seguito di variazioni del pH.

Nel caso dell’adenina e citosina ho la perdita di un H e quindi

perdo la possibilità di creare un ponte idrogeno.

Per guanina e timina a pH neutro ho la presenza del gruppo

chetonico che è un accettore di H in grado di generare ponti

idrogeno, ma a seguito di una variazione del pH l’ossigeno del

gruppo chetonico effettua un legame stabile con un H e quindi non

è più disponibile per fare un legame ad idrogeno.

Tutte queste variazioni avvengono a pH basico e, se inserite nel

DNA, ne causano la denaturazione perché non è più possibile

effettuare i legami ad idrogeno che tengono uniti i due filamenti.

Perché gli appaiamenti canonici tra basi sono gli unici possibili?

RISà perché sono gli unici compa