Genetica molecolare

PROPAGAZIONE

Secondo requisito possedere un gene di selezione, ovvero un sistema che ci permetta di selezionare le cellule che hanno inglobato il plasmide = SISTEMA DI SELEZIONE

Le cellule che hanno acquisito il plasmide saranno, ad esempio, resistenti all'ampicillina e quindi potranno crescere su un terreno che la contiene, mentre le cellule che non presentano il plasmide muoiono.

Il plasmide possiede anche una zona di clonaggio, cioè una porzione ben definita in cui troviamo una serie di siti di riconoscimento per gli enzimi di restrizione (= endonucleasi che sono in grado di tagliare il DNA a doppio filamento riconoscendo sequenze specifiche).

Per inserire il frammento di DNA vanno effettuati dei tagli con gli enzimi di restrizione e va usata la ligasi come enzima in grado di ripristinare i legami fosfodiesterici tra le basi all'interno del complesso enzima + inserto. Per l'inserimento effettivo dobbiamo tagliare in dei punti specifici, ovvero a livello del

galattosio. Nell'immagine ho la molecola artificiale X-gal, formata da galattosio + molecola indolica (contenente gruppi Cl e Br), che quando è inserita nel messo di coltura ed entra nella cellula viene riconosciuta dall'enzima che la taglia e separa le due molecole. La scissione in presenza di O2 può dar luogo ad un dimero che precipita sotto forma di colorante blu.

Il ceppo di Coli che stiamo considerando noi adesso è un ceppo delta-B-Lac cioè ha una delezione nel locus dell'operone Lac della B-galattosidasi, che quindi viene fornita in trans dal plasmide stesso. Ciò ci permette di effettuare sia una selezione per sopravvivenza ad ampicillina, che selezione per colore della colonia, ovvero uno screening (non c'è morte cellulare ma solo una differenza fenotipica).

Le colonie che hanno acquisito il plasmide e di conseguenza la B-galattosidasi esogena, avranno un colore blu grazie alla presenza dell'X-gal che genera un precipitato colorato.

N.B.

In questo caso possiamo dire che il plasmide va a complementare l'attività B-galattosidasicadel ceppo deleto. Il MCS è una sequenza artificiale costruita in maniera tale che, sia la prima porzione di LacZ che la seconda porzione siano in registro, cioè che la RNApol si lega sul promotore e trascrive tutta lacassetta fino alla fine, producendo una B-galattosidasi funzionale sebbene una porzione del gene sia occupata dal MCS, generando quindi una proteina avente una parte della sua catena polipeptidica derivante dagli amminoacidi del MCS. Gli amminoacidi giusti della B-galattosidasi partono quindi con la prima piccola porzione azzurra (vedi foto plasmide) e riprendono dopo l'MCS, rimanendo appunto in registro. Perché però abbiamo fatto questa costruzione, con LacZ e MCS? RISÀ l'MCS si trova alla porzione N-terminale della B-galattosidasi (al 5'), dove sarà poi necessario tagliare per inserire una porzione di DNA qualsiasi.

ma potrei avere un frameshift che mi annulla l'attività della mia proteina. In questa immagine posso vedere sia la selezione che lo screening. La selezione permette di distinguere tra le cellule che sono adatte all'ambiente o meno (ampicillina). Le colonie sopravvissute quindi hanno portato dentro il plasmide tagliato con EchoRI, inserito sulla porzione di DNA tagliata con lo stesso enzima, il tutto unito dalla ligasi. Se è vero ciò che ho detto sopra (risposta all'ultima domanda) allora io so che solamente le colonie bianche hanno correttamente inserito il plasmide, perché l'inserzione ha mandato fuori frame LacZ che, non producendo più una proteina funzionale, non può manifestarsi sotto forma di fenotipo blu.

N.B. anche le colonie blu hanno il plasmide, perché non sono morte in presenza di ampicillina, ma non lo hanno inserito correttamente, perché il frame della B-Galattosidasi è rimasto invariato.

Esistono anche

L'inserto può avere una doppia possibilità di inserimento, che non crea problemi solo se usiamo dei vettori di propagazione (come pUC18/19), visto che il fine ultimo non è quello di amplificare un prodotto proteico.

Lezione 15.03.21

TRASFORMAZIONE fenomeno scoperto nel 1928 da Griffith ed è un meccanismo di trasmissione orizzontale tra microrganismi, è un fenomeno poco efficiente, ma noi lo usiamo per trasformare le cellule batteriche aumentandone l'efficienza.

Per aumentarne l'efficienza dobbiamo inoculare le cellule, ottenendo una coltura cellulare a plateau, di cui una parte viene prelevata e messa in un terreno fresco, con una densità ottica molto bassa (pochissime cellule per volume di terreno ottimale). Vengono fatte crescere e ne viene poi misurata la densità ottica (funzione numero di cellule/mL), il cui valore massimo è circa 2, cioè la raggiunta del plateau, per poter prelevare le cellule in

cellule viene poi aggiunto unterreno massimo, per permetterne la crescita. Silasciano quindi crescere in fase Benton (terrenoliquido) per mezz’ora e poi si piastrano su Petri.

Per essere sicuri della correttezza delprocedimento, bisognerebbe produrre anche trecontrolli: la trasformazione senza plasmide, celluleche sono venute a contatto solo con in vettore equelle che hanno avuto un contatto con il vettore aseguito di ricombinazione.

In fase di piastramento usiamo un terreno contenente anche ampicillina + X-Gal, in questo modoottengo:

• Piastra vuota se le cellule non hanno inglobato il plasmide
• Colonie blu, se il plasmide è stato inglobato, ma senza andare incontro a ricombinazione
• Colonie bianche, se il plasmide ricombinante è stato correttamente inglobato (quelle dinostre interesse)

Il fenomeno che porta alla manifestazione di una colonia blu, su delle cellule delete su LacZ,prende il nome di alfa-complementazione, cioè nel nostro vettore c’è

Una porzione di B-galattosidasi più piccola di quella del genoma batterico. Se presi singolarmente, i due frammenti di DNA del vettore e del batterio, non sono in grado di dare un enzima funzionale. In realtà, però, quando consideriamo il vettore senza inserto, nella cellula batterica, abbiamo due polipeptidi uno proveniente dal vettore e uno proprio della cellula e si vengono a formare quindi due proteine. Questi due frammenti sono in grado di interagire tra di loro grazie ad un dominio di interazione intramolecolare che permette quindi la rigenerazione della funzione fisiologica della proteina, detta ALFA COMPLEMENTAZIONE IN CIS.

N.B. Generalmente in questi casi si è soliti pensare che queste due mutazioni (che deletano), cadano su due cromosomi diversi MA in realtà è un caso particolare in cui i due mutanti appartengono allo stesso locus e i due prodotti polipeptidici sono in grado