Genetica molecolare

GENETICA MOLECOLARE

27-02

Prima parte La genetica a 65 anni dalla scoperta della doppia elica

LA SPERIMENTAZIONE CLASSICA

Inizialmente la sperimentazione classica consisteva in una variazione indotta di alcuni parametri per cui si

andava ad osservare direttamente la risposta per determinare una relazione tra la causa (che avevo

determinato) e l’effetto. Con un grosso gap centrale in quanto non conosco il meccanismo che porta dalla

variazione di questi parametri alla risposta.

L’APPROCCIO GENETICO

L’approccio genetico era quello di variare i determinanti genetici (mediante mutazione, ricombinazione,

funzione), andare ad inficiare la funzione di quel determinante genetico e dopodiché andare a localizzare e

identificare i singoli geni. Ma senza poi avere un’idea di qual era la relazione reale tra l’alterazione del gene

e l’effetto del fenotipo.

I CONCETTI FONDANTI

I concetti fondanti su cui si è basata la genetica inizialmente e in seguito alla scoperta del DNA come materiale

genetico, è stato quello di capire:

- Natura chimica dei processi biologici

- Eredità dei “caratteri”

- I cromosomi veicolano i fattori ereditari

- Eredità delle caratteristiche metaboliche

- Il concetto d “gene”

- Teoria “un gene-un enzima” (oggi non funziona più bene)

- Il DNA è il materiale genetico.

65 ANNI DI PROGRESSI

Che cosa ha portato questa scoperta del materiale genetico?

- Comprensione del codice a triplette

- Sintesi in vitro di geni e di proteine

- Manipolazioni di molecole di DNA

- Analisi di sequenze nucleotidiche analisi di interi genomi

PROGETTO GENOMA UMANO

Il primo grande passaggio estremamente importante nella genetica umana è stato il PROGETTO GENOMA

UMANO:

- Sequenziamento del genoma umano e del genoma di organismi modello (E.coli, S. cerevisiae, C.

elegans, Drosophila melanogaster, topo).

- Sviluppo di tecnologie di supporto e di strumenti specifici per la ricerca sul genoma umano.

- Espansione di reti di comunicazione e della capacità di elaborazione e di archiviazione dei dati.

C’erano due consorzi che si sono dedicati al sequenziamento del genoma umano: il consorzio pubblico diretto

da Francis Collins e il consorzio privato diretto da Craig Venter. I due approcci che sono stati utilizzati dai due

consorzi per il sequenziamento del genoma umano: l’approccio utilizzato dal consorzio pubblico chiamato

Hierarchical shotgun in cui c’è stato un lavoro iniziale per costruire la mappa genetica e la mappa fisica del

→

genoma umano inizialmente si sono create delle mappe in cui sono stati messi in ordine frammenti del

DNA e riconosciuti rispetto alla loro posizione fisica. Quindi è stato possibile costruire un contiguo di

frammenti di DNA. Una volta definita questa mappa di contigui è stato possibile prendere ciascuno di questi

frammenti, frammentarlo a sua volta e sequenziare ciascuno di questi pezzettini e ordinarli all’interno del

singolo frammento e questo ha permesso l’assemblaggio finale della sequenza del genoma.

Il consorzio privato ha adottato un altro sistema chiamato Whole Genome Shotgun ossia ha saltato lo step

→

molto lungo e costoso della costruzione della mappa fisica frammentano il genoma, sequenziano i

frammenti e sulla base delle sequenze che si sovrappongono le ordinano l’una rispetto all’altra. Una volta

sequenziato la parte più cospicua di lavoro sarebbe stato andare ad assemblare queste sequenze.

Quindi due approcci completamente diversi che hanno permesso, alla fine di ottenere quella che oggi

definiamo e conosciamo come la sequenza del genoma umano.

Con il termine genoma umano intendiamo sia il genoma nucleare che quello mitocondriale (nel 1981 è stato

concluso il sequenziamento di quest’ultimo).

Nel genoma nucleare la grossa sorpresa è stata rappresentata dal numero di geni presenti: prima della

conclusione del sequenziamento del DNA si pensava che il genoma umano fosse costituito da più di 100 mila

geni, questo perché si giustificava la complessità dell’organismo umano in seguito al confronto con la

complessità di organismi più semplici (dei quali, nel mentre, si era già ottenuto il sequenziamento completo),

ma così non era perché il numero di geni che effettivamente abbiamo è molto inferiore rispetto a quello che

ci si aspettava. Quindi, come giustifichiamo la complessità fenotipica del nostro organismo rispetto a quella

di organismi più semplici? Sta proprio nel fatto che ciascun gene del genoma umano) è in grado di codificare

per un gran numero di proteine diverse (attraverso splicing alternativi, espressione di trascritti diversi in

tessuti diversi) e questo di fatto rende che ciascun gene non codifica per una sola proteina ma per diverse

proteine che possono avere funzioni diverse in tessuti diversi.

Inoltre, il progetto genoma umano, al di là del numero di geni che sono inclusi nel nostro genoma, ci ha

anche confermato che la maggior parte del nostro DNA è un DNA non codificante il quale è costituito da

sequenze uniche o a basso numero di copie (che costituiscono un 40% del DNA extragenico) e sequenze

moderatamente o altamente ripetute.

Quello che attualmente facciamo quando vogliamo conoscere, in una determinata regione cromosomica che

geni sono presenti in quella determinata regione, qual è la loro funzione, qual è la sequenza, oggi abbiamo

la possibilità di consultare banche dati di sequenze che non hanno informazioni solo della mera sequenza

nucleotidica di una determinata regione, ma danno tutta una serie di informazioni molto importanti (per es.

Human genome browser).

LA REVERSE GENETICS

Quella che definiamo reverse genetics è l’identificazione di geni (quindi partire da una determinata sequenza

e identificare che in quella sequenza sono presenti dei geni), successivamente andare ad identificare la loro

→

funzione, non solo ma la sfida attuale è andare a vedere le relazioni funzionali (e cioè Questo prodotto

genetico con chi interagisce? Di che pathway cellulare fa parte? Quali sono gli altri fattori che determinano

insieme la funzione di quel prodotto? Come viene regolata l’espressione di quel gene? Quali sono i fattor che

influiscono sull’espressione?).

QUINDI la reverse genetics oggi consiste:

- Analisi bioinformatica delle sequenze

- Identificazione dei geni, dei loro prodotti e dei regolatori della loro espressione

- Analisi di trascrittomi e di proteomi

- Identificazione delle relazioni funzionali tra le diverse componenti responsabili dei processi.

Cenni di storia della genetica umana

Nel 1752 Pierre-Louis Moreau de Maupertuis pubblicò una relazione su una famiglia con polidattilia presente

in 4 generazioni e dimostrò che poteva essere trasmessa da maschi e femmine.

Nel 1814 Joseph Adams, medico inglese, pubblicò un libro intitolato “Trattato delle supposte proprietà

ereditarie delle malattie” in cui fornì le basi per la conoscenza delle malattie genetiche: egli differenziò

nettamente le condizioni congenite (riconducibili alla nascita dell’individuo) familiari (riconducibili a caratteri

recessivi) dalle condizioni più propriamente ereditarie (caratteri a trasmissione dominante).

Nel 1820 C.F. Nasse, professore tedesco di medicina, presentò un albero genealogico con emofilia

riconoscendone la modalità di trasmissione (X-linked recessiva).

I due pionieri della genetica umana sono stati Galton e Mendel che hanno sviluppato due teorie che

inizialmente sembravano in contrasto ma che in realtà non lo erano perché andavano a studiare

caratteristiche diverse: mentre Mendel studiava dei caratteri rari che si presentano in alternativa l’uno con

l’altro, Galton invece ha fatto degli studi su dei caratteri comuni che avevano una variabilità di espressione.

Nel 1918 Fisher risolve la controversia puntualizzando che i caratteri quantitativi possono essere spiegati

mediante l’apporto di più geni e quindi mentre nei caratteri mendeliani abbiamo un gene che contribuisce a

quel carattere (o l’uno o l’altro) invece nei caratteri più comuni che definiamo quantitativi possono esserci

più geni che vanno a modulare l’espressione di quel fenotipo.

Storicamente il primo che ha dimostrato la natura metabolica di alcuni disturbi è stato Garrod nel 1902 che

ha anche dimostrato che i disturbi metabolici sono di natura genetica. Quindi l’alterazione di determinati

enzimi che fanno parte di un determinato pathway metabolico possono indurre malattie genetiche che si

possono riprodurre in un albero genealogico e quindi in una determinata segregazione.

Lui inizialmente ha studiato l’alcaptonuria che è una malattia genetica recessiva dovuta all’accumulo di un

acido che fa parte del metabolismo della fenilalanina che determina una espressione fenotipica abbastanza

complessa in quanto può dare alterazioni della pigmentazione del palato duro, cartilagine costali pigmentate

in modo alterato e quindi anche accumulo di questo acido all’interno.

Quello che si è visto successivamente è che blocchi metabolici presenti in tre errori congeniti del metabolismo

che interessano la fenilalanina e la tirosina possono dare origine a patologie diverse a seconda di dove

→

avviene il blocco metabolico dovuto all’alterazione nella sequenza di un enzima che catalizza quella

reazione e che di fatto non funzionando più correttamente non si ha più la conversione di fenilanina e

tirosina, i suoi cataboliti si accumulano e vengono eliminati con le urine (enzima mancante fenilanina

idrossilasi = fenilchetonuria).

La tirosina non può essere convertita in DOPA e dopachinone: non formazione di pigmento melanina (=

albinismo).

L’acido omogentisico non può essere demolito e compare nelle urine (enzima mancante acido omogentisico

ossidasi = alcaptonuria).

QUINDI alterazioni in punti diversi di un determinato pathway metabolico determina l’insorgenza di malattie

genetiche che vengono ereditate come caratteri recessivi. Queste sono state le prime patologie che sono

state riconosciute come malattie genetiche ereditarie.

ALBERI GENEALOGICI

Una volta riconosciuta la presenza di queste malattie genetiche, diventava importante fare un’anamnesi

familiare ossia ricostruire la storia della patologia all’interno della famiglia e rappresentare queste

informazioni in un albero genealogico.

Rappresentazioni usate

più frequentemente.

! Il probando è la prima persona all’interno della famiglia che è stata riconosciuta affetta da quella determinata

patologia.

!! Il pallino dentro indica soggetti eterozigoti in patologie X-linked recessive.

5 tipi principali di eredità mendeliana

- Autosomica dominante

- Autosomica recessiva

- Dominante legata all’X

- Recessiva, legata all’X

- Legata all’Y Eredità autosomica dominante

In tutte le generazioni vediamo soggetti affetti.

• →

Una persona affetta ha almeno un genitore affetto (esclusi i casi di penetranza incompleta soggetti

che anche se portano la mutazione in eterozigosi non manifestano il genotipo clinico).

• Sono colpiti entrambi i sessi.

• È trasmessa da entrambi i sessi.

• Dall’unione tra un affetto (se in eterozigosi) con un soggetto sano, si ha il 50% di probabilità di

generare figli analogamente affetti.

Se un genitore è normale (bb) e l’altro è affetto (Bb) da una malattia autosomica

dominante, il 50% dei figli sarà eterozigote affetto (Bb), ed il 50% sarà omozigote

normale (bb).

Nelle malattie autosomiche dominanti, la lettera maiuscola indica il gene che dà la malattia: un solo gene

dannoso dà origine al fenotipo affetto.

Qual è la probabilità di essere affetto un figlio di entrambi i genitori affetti da una malattia autosomica

dominante ed entrambi eterozigoti?

Se entrambi i genitori sono affetti (Bb) da una malattia autosomica dominante, allora

il 75% dei figli sarà affetto (BB o Bb), e il 25% sarà omozigote normale (bb).

! è raro che un individuo affetto da una malattia autosomica dominante sia omozigote per il gene che dà la

malattia. →

Più frequentemente vediamo che queste malattie genetiche sono eterogenee dal punto di vista genetico

presentano un’ampia eterogeneità genetica. Vuol dire che mutazioni in geni diversi danno la stessa malattia

genetica.

Può succedere che due soggetti che portano mutazioni in due geni diversi si incrocino e abbiano un figlio che

abbia ereditato entrambe le mutazioni. Quindi nella maggior parte dei casi questi soggetti che portano una

doppia mutazione hanno una manifestazione clinica più grave. Questa non è una regola perché ci sono

soggetti che hanno entrambe le mutazioni e sono completamente asintomatici per la penetranza incompleta

in quel soggetto di entrambe le mutazioni.

Quindi in patologie autosomiche dominanti si possono anche trovare soggetti che presentano più mutazioni

in geni coinvolti nell’espressione fenotipica di quella malattia genetica.

Eredità autosomica recessiva

• Gli individui affetti di solito sono figli di individui non affetti (portatori asintomatici).

• C’è un aumentata incidenza di consanguineità tra genitori (nelle forme rare).

• Sono colpiti entrambi i sessi.

• Dopo la nascita di un figlio affetto (in molti casi riconosco la presenza dell’allele recessivo nei due

genitori dopo che è nato un figlio affetto), ciascun ulteriore figlio ha 1/4 di probabilità di essere

affetto.

• La probabilità per un fratello non affetto di essere eterozigote è di 2/3.

Se entrambi i genitori sono portatori sani (Aa), il 25% in media dei figli sarà omozigote

normale (AA), il 50% sarà eterozigote non affetto (Aa), e il 25% sarà omozigote affetto

(aa).

Se un genitore è portatore sano (Aa) e l’altro è affetto (aa), allora il 50% in media dei figli

sarà eterozigote non affetto (Aa), e l’altro 50% sarà omozigote affetto (aa).

Ci sono delle eccezioni a questa situazione. Questo si osserva, analogamente in questa patologia, il morbo di

Tay-Sachs. È una malattia da accumulo lisosomico a trasmissione autosomica recessiva.

I sintomi compaiono nei primi mesi di vita, molto progressiva con esito fatale entro i cinque anni di vita.

Deficit dell’enzima esosaminidasi A, che a livello del SNC è responsabile della demolizione del ganglioside

GM2 (sostanza composta da zuccheri e grassi).

L’accumulo di GM2 determina cecità e degenerazione completa della funzionalità mentale e motoria.

È una patologia con frequenza molto bassa nella popolazione tuttavia ci sono alcune popolazioni, per

esempio quella degli Ashkenazi, che hanno una frequenza più elevata dell’allele recessivo rispetto alla

popolazione generale. Quindi di fatto in questa popolazione abbiamo una frequenza di eterozigoti di 1/30

che è molto elevata per una malattia recessiva rara e quindi di fatto mi posso aspettare anche in questo caso

di avere degli incroci molto più frequenti tra soggetti portatori in eterozigosi rispetto a quello che mi aspetto

nella popolazione. In questo caso se mi trovo in una popolazione in cui ho un’elevata frequenza

dell’allele recessivo, in realtà questa può essere una modalità di trasmissione

autosomica recessiva dove in questi due incroci, si ha l’incrocio tra un

soggetto affetto e un soggetto portatore dell’allele in eterozigosi.

Altro esempio è la sordità che viene trasmessa come un

carattere autosomico recessivo ma in questo caso

dall’incrocio di due soggetti affetti ho la nascita di due

soggetti sani (dovrebbero avere figli omozigoti affetti.

Bisogna tenere in considerazione l’eterogeneità genetica di

queste malattie, in particolare la sordità ha un’ampia

eterogeneità genetica (sono noti più di 100 geni coinvolti

nella sordità). Di fatto questi soggetti hanno la stessa mutazione nello stesso gene (se sono parenti tra loro

vuol dire che c’è un allele mutato che segrega all’interno della famiglia). L’incrocio tra consanguinei in alto a

destra mostra che questi due soggetti sono portatori della mutazione nel locus b che va in omozigosi in

questo soggetto affetto (nel pallino viola). Posso avere che quest’altro soggetto (quadratino blu) è affetto

perché omozigote in una mutazione in un altro gene che dà la sordità familiare. I due individui (dell’incrocio

centrale) risultano omozigoti dominante uno per un allele e l’altro individuo per l’altro. Quindi di fatto

dall’incrocio tra questi due soggetti che portano mutazioni in omozigosi di due geni che segregheranno in

modo indipendentemente l’uno dall’altro avrò che non c’è nessuna probabilità che ci siano soggetti

omozigoti aa così come non ci siano soggetti omozigoti bb. Questo effetto è detto complementazione:

queste mutazioni in entrambi i soggetti affetti si trovano in geni che sono fisicamente separati tra loro e che

segregheranno in modo indipendente e non daranno omozigosi per quell’allele recessivo.

Dobbiamo riconoscere delle situazioni in cui mi aspetto di trovare quella mutazione in omozigosi quindi se

vado a sequenziare il gene che dà quella malattia genetica recessiva in questa famiglia (B) in cui i genitori

hanno un rapporto di consanguineità, mi aspetto di trovare una mutazione in omozigosi: quel nucleotide etc.

mutato sarà lo stesso che trovo in questi due allei dei due soggetti.

Ma nelle patologie a trasmissione recessiva non è sempre così perché in questo caso (A) hanno sì l’allele

mutato in eterozigosi ma la mutazione è diversa perché provengono da due alleli che sono diversi perché

provengono da due antenati che sono indipendenti gli uni d