Genetica molecolare

Metodi di analisi del gene PMP22

Delezione (1,5 Mb) o mutazioni puntiformi del gene PMP22 possono causare la perdita di funzione (aploinsufficienza).

I vari metodi di analisi del gene PMP22 sono:

• Southern Blot: (DNA) - laborioso, uso di radioisotopi/chemioluminescenza, digestione parziale e/o degradazione del DNA.
• PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis): sangue fresco, tecnica complessa.
• FISH (Ibridazione in situ fluorescente): metodologia costosa, sangue fresco, tecnica complessa.
• Microsatelliti (DNA): poca informatività.
• Real time PCR: ottimo.
• MLPA (Multiple Ligation-dependent Probe Amplification): ottimo.

La PCR real time, denominata anche PCR quantitativa o PCR quantitativa in tempo reale, permette di avere indicazioni sulla quantità di DNA stampo relativamente a quella determinata regione cromosomica. Pertanto, con questa tecnica è possibile andare ad evidenziare delezioni e duplicazioni di quella determinata regione cromosomica.

Si possono anche effettuare analisi di marcatori microsatelliti nella regione.

amplificando ciascuno di questi avrò una banda di amplificazione se il numero di blocchetti ripetuti è lo stesso nelle tre copie del marcatore microsatellite, due bande se due copie hanno lo stesso numero di blocchetti ripetuti, tre bande se ho tre copie diverse con tre blocchetti diversi ripetuti.

Altra situazione: parallelamente alla duplicazione posso avere una delezione della regione cromosomica come nella forma HNPP. Con la PCR-real time dovrei andare ad amplificare quella regione, esone del gene PMP22 e andare a vedere una ridotta quantità di quella regione cromosomica e anche in questo caso vengono utilizzati marcatori microsatelliti. In questo caso c'è una delezione quindi di fatto quando vado ad analizzare questa regione cromosomica ho un allele che presenta la regione e l'altro allele che presenta la delezione quindi mi aspetto di vedere un allele solo (per ciascun marcatore). Anche nei soggetti della popolazione di controllo posso vedere un

allele solo evedere il marcatore in omozigosi. Nel soggetto indicato con la freccia (probando) vedo che tutti imarcatori di quella regione sono in omozigosi. Vado a seguire lasegregazione di questa regione cromosomica all'interno dellafamiglia, questo mi aiuta a stabilire la presenza della delezione perché in questa famiglia ho tre soggetti affetti(il padre del probando e la nonna). Se entrambi sono affetti vuol dire che il padre è deleto per quella regioneed è la porzione con la delezione che ha trasmesso al figlio affetto. Quindi quando vado ad amplificare questimarcatori, non amplifico mai la regione deleta ma l'allele dell'altro cromosoma omologo che è quello che luinon ha trasmesso al figlio affetto perché dei due cromosomi 17 lui ha trasmesso quello che porta la delezione. Analogamente la nonna affetta avrà trasmesso al figlio affetto il cromosoma 17 deleto e quindi i marcatoriche ho amplificato sono nell'altro.

cromosoma omologo.Quando seguo la segregazione di questo aplotipo all'interno della famiglia non mi ritrovo con la segregazionedi questi alleli perché quello che segrega è quello che io non vedo perché è deleto. Quindi la caratterizzazionedella delezione, in questo caso, con questi marcatori microsatelliti viene fatta utilizzando più marcatori e peravere la conferma definitiva seguendo la segregazione cromosomica all'interno della famiglia dove vedo chegli alleli di quei marcatori non segregano nel senso che non sono quelli presenti nel cromosoma 17 trasmessonelle diverse generazioni. 59Un esempio di una separazione elettroforetica in un gel di poliacrilammide. →Sono stati caricati 4 campioni (l'ultimo è il campione di controllo). Nel campione di controllo ho due bandevuol dire che in questo soggetto (che ha due copie della regione cromosomica), il marcatore microsatellitedifferisce per il numero di blocchetti ripetuti

Caso però la regione con lo stesso numero di blocchetti ripetuti è presente in duplice copia rispetto all'altra regione. Mi aspetto che rispetto alla situazione di controllo, la banda presente in duplice copia abbia intensità maggiore rispetto a quella presente in duplice copia nel DNA di quel soggetto e qui (secondo caso) è abbastanza evidente che partendo dalla stessa quantità di DNA ho un allele che viene amplificato molto di più rispetto ad un altro che viene amplificato meno, questo sbilanciamento nella quantità di amplificato dei due alleli, mi fa supporre che uno dei due sia duplicato rispetto all'altro. Questa situazione di un'amplificazione differenziale (intensità diversa delle due bande) è un'indicazione della presenza di duplicazione in quel soggetto affetto. Quello che visualizzo in un soggetto duplicato affetto da... mediante separazione elettroforetica presenza di tre bande con uguale intensità.

la presenza di due bande come il DNA di controllo ma l'intensità è diversa proprio perché una delle due rappresenta l'allele del marcatore che è presente in duplice copia.

Elementi da considerare quando si studia una patologia umana:

• Natura della mutazione
• Mutazioni differenti a carico dello stesso gene possono portare a fenotipi più o meno severi o a fenotipi diversi, a seconda degli effetti delle diverse mutazioni sull'espressione del gene o sulla funzione del prodotto proteico.
• Background genetico
• Due individui di una stessa famiglia (che non siano gemelli identici) pur avendo uno stesso gene mutato, potranno esprimere fenotipi malattia più o meno gravi a causa del diverso "background" genetico.
• Influenza ambientale
• Fattori quali lo stile di vita, la dieta e l'esposizione a sostanze tossiche può influenzare il fenotipo della malattia.

6003-04 β-talassemia α-globina

metodi indiretti mi permettono di ricercare se esoni o porzioni di un determinato gene presentano delle varianti puntiformi.

DIRETTI

• Restriction fragment lenght polymorfism (RFLP)
• Digestione con enzimi di restrizione

Vado a vedere se quella variante che ho trovato nel DNA del soggetto altera il sito di restrizione per un determinato enzima. Quindi di fatto la sostituzione di un nucleotide, una piccola delezione o una piccola inserzione, può modificare il sito di riconoscimento per il taglio di un particolare enzima. In questo modo sono in grado di vedere se viene alterato il pattern di restrizione di quel frammento.

Una mutazione puntiforme può:

• O abolire un sito di taglio
• O creare un nuovo sito di taglio

Qual è l'approccio?

1. Amplificazione del DNA (PCR)
2. Digestione dell'amplificato con quel determinato enzima di restrizione che ho identificato avere un sito di taglio in quell'amplificato e ho visto che la variante presente abolisce o crea il sito di taglio.

Elettroforesi in gel di agarosio

4. Vado a vedere i pattern di frammenti caratteristici

Se quella variante crea un nuovo sito di taglio, il frammento che ottengo viene tagliato con quell'enzima di restrizione se è presente la variante quindi avrò 1 banda in più rispetto al wt (ottengo due frammenti invece che uno). Se la sequenza wt normalmente veniva tagliata il fatto che sia presente una variante fa sì che non venga più riconosciuto il sito di taglio e quindi l'enzima non taglia più (abolizione sito di taglio).

Devo sempre tener conto che posso avere la variante in omozigosi (vedo solo le bande tagliate perché entrambi gli alleli sono stati tagliati) o eterozigosi (l'individuo eterozigote avrà l'allele wt quindi nell'elettroforesi vedo la banda wt e poi le due bande in cui è presente in uno dei due alleli il sito di taglio).

Vantaggi: metodo rapido e poco costoso

Svantaggi: è necessario che la

Mutazione modifichi un sito di restrizione