Genetica Molecolare

Regolazione dell'espressione genica tramite auto-repressione dell'operatore

Si ha perciò un sistema di auto-repressione dell'operatore. Il ceppo batterico in cui viene inserito il plasmide esprime costitutivamente la polimerasi di T7 (l'espressione di questo gene non è regolata dall'operatore Lac, ma da un promotore costitutivo), che potrebbe attivare immediatamente la trascrizione dell'ORF GST-X se non fosse presente l'operatore Lac, legato dal repressore LacI, la cui trascrizione è fortemente attivata. La T7 polimerasi riconoscerà la regione Q ma troverà un'interferenza (effetto hindrance), dovuto al fatto che il tetramero LacI le impedisce di attivare la trascrizione.

Per dereprimere il locus della proteina di fusione si aggiunge IPTG, una molecola analoga all'allolattosio, ma molto più stabile. L'IPTG entra nella cellula e interagisce con il tetramero di LacI, causando un cambio conformazionale che lo fa staccare e che permette alla polimerasi di trascrivere.

Possiamo

attivare e disattivare la trascrizione di un determinato locus in molti modi, per tenere sotto controllo il sistema e impedire il funzionamento della trascrizione fino al momento in cui non viene fornita una molecola che impedisca la derepressione.

Domanda: per quanto riguarda il phage display, il genoma virale in cui inseriamo il filamento è il derivato del genoma a singolo filamento, duplicato per formare DNA a doppio filamento?

Risposta: sì, ed è un processo che il fago fa naturalmente quando infetta il batterio: la prima cosa che deve fare il fago è duplicare il suo genoma perché su entrambi i filamenti sono presenti delle ORF utili. Facciamo queste operazioni su genomi fagici a doppio filamento ingegnerizzati, che funzionano perciò come strutture circolari a singolo filamento. Il frammento di interesse viene inserito modificando il genoma del fago. Quando il plasmide viene inserito nel ceppo batterico, viene riconosciuto come se fosse un

genomafagico già duplicato e inizia a sintetizzare le proteine codificate nel genoma fagico. Inseriamo sequenze dalla lunghezza circa corrispondente alla lunghezza di un esone. Tendenzialmente, ogni esone corrisponde ad un determinato dominio proteico. Ogni costrutto contenuto nella libreria contiene un inserto diverso ed è invece identico nella porzione del genoma fagico. Costruendo la libreria originiamo una popolazione fagica innumerevole, nella quale ogni fago esprime sulla proteina finger una proteina chimerica, con un dominio extra corrispondente al dominio inserito. L'inserto viene inserito a partire dal cDNA, che viene poi sottoposto a sonicazione e frammentato. Casualmente, si spera che uno dei domini riesca ad entrare nel fago e ad essere in registro con la sequenza della proteina della fimbria, in modo tale da permettere l'espressione della proteina chimerica. Man mano che si va sui grandi numeri, avremo un numero di fagi sufficientemente elevato da

Rappresentare i domini di tutte le proteine codificate dal nostro genoma. Qualsiasi organismo che produca RNA può essere utilizzato per produrre inserti per il phage display.

Il sistema può poi essere utilizzato per arricchire un gruppo di fagi rispetto ad un determinato dominio, utilizzando una cromatografia per affinità con una resina a cui è legata la proteina di cui stiamo cercando di definire l'interattoma (es. TBP). Caricando sulla colonna la libreria fagica, tutti i fagi che esprimono un dominio capace di interagire specificamente con la proteina legata alla resina saranno trattenuti sulla colonna.

Dopo di che, per eliminare il rumore di fondo dato da fagi che non legano selettivamente la proteina ma che, a causa delle proprietà della proteina chimerica hanno un minimo di stickyness, si lava abbondantemente per selezionare solo i fagi che si legano in modo forte alla proteina di interesse. Si eluiscono quindi i fagi, e li si diluisce molto.

amplificandoli nuovamente in batteri, per poi ripetere la lacromatografia d'affinità. Si va ad arricchire così, in maniera selettiva, il pool di fagi che presentano domini con altissima affinità per la proteina di interesse.

I fagi vengono inoculati su una piastra, infettando E. coli in modo da avere una forte diluizione, così che il fago che infetta una cellula formi una placca separata da altre placche, formando placche di tipo clonale, che derivano da un fago originale.

Per sapere quali sono i domini proteici che interagiscono con la proteina di interesse si preleva una coltura e la si inocula, generando una coltura unica di quel fago. Si estrae il DNA e si utilizzano dei primer per sequenziare l'inserto. 16 nucleotidi sono sufficienti per identificare una sequenza nucleotidica. L'inserto è sicuramente più lungo di 16 nucleotidi e usando tecniche bioinformatiche è possibile confrontare la sequenza ottenuta con sequenze di DNA.

precedenza sequenziate. Si possono scoprire così le proteine che interagiscono con la proteina di interesse. In questo modo è possibile, ad esempio, osservare che TBP interagisce fortemente con le TAF. Domanda: Le TAF sono sempre necessarie per la trascrizione? Risposta: Dipende dal promotore, ma nel complesso di TFIID, questa non è sempre costituita dalle stesse TAF. TFIID è stato scoperto a seguito dell'ipotesi che, se nei batteri esiste un fattore σ che serve a reclutare la polimerasi, questo fosse presente anche negli eucarioti. Si scoprì che, negli eucarioti, il fattore che recluta la polimerasi è un complesso fattore multiproteico. Sulla base di esperimenti in vitro, sembrava che le TAF fossero fondamentali per la trascrizione. In vitro, senza TFIID la polimerasi non era in grado di fare trascrizione. Poiché in quegli anni non erano ancora state sviluppate tecnologie per effettuare mutazioni selettive nei mammiferi, in

particolare nel topo, non era possibile effettuare esperimenti in vivo.

Successivamente, si provò a dimostrare che le TAF, essendo così importanti, dovevano essere conservate anche in lievito. Non avendo ancora sequenze genomiche disponibili non si poteva studiare facilmente la conservazione delle sequenze.

Dopo aver isolato i TAF e sulla base della sequenza peptidica, ricavata dalla spettrometria, si riuscì a ricostruire la probabile sequenza nucleotidica.

In quegli anni, fu pubblicato il genoma di lievito e si rivelò che le proteine isolate appartenevano a peptidi più grandi e avevano una conservazione del 40% con quelle umane. Questo significa che alcuni dei complessi che vanno a permettere la trascrizione di un numero di geni sono conservati e uguali a quelli umani.

Il lievito era anche il primo eucariote in cui fu possibile fare inattivazione sito specifica. Inattivando ogni TAF separatamente ci si rese conto che l'inattivazione della maggior parte

dei TAF non dava letalità. Se fossero indispensabili per la trascrizione, e quindi geni essenziali, l'organismo con delle TAF inattivate non avrebbe potuto sopravvivere. Purificando, si lavora su più complessi diversi, ognuno dei quali si associa a promotori diversi. Purificando per la prima volta, si pensò che tutti i fattori proteici trovati facessero parte dello stesso complesso. Invece, fanno parte di complesso diverso e sono specifici per alcuni promotori. La genetica permette di osservare fenomeni che non possono essere visti con tecniche biochimiche, che permettono solo saggi in vitro. La genetica permette anche di effettuare saggi in vivo. La sperimentazione in vivo è fondamentale. Con i soli esperimenti in vitro non si può essere sicuri della propria ipotesi. Ad esempio, attraverso studi con criomicroscopia, una tecnica di congelamento a temperature bassissime dei complessi proteici e analisi con risoluzione di 2-3 Å a microscopia elettronica.

I singoli complessi vengono congelati in tutte le loro fasi intermedie di esistenza. Si riesce perciò a vedere non solo la struttura del complesso, ma anche tutte le sue conformazioni, da quella più stabile a quella meno stabile. È così possibile ricostruire il complesso in forma dinamica attraverso algoritmi bioinformatici.

Yeast Two-Hybrid System (Sistema a doppio ibrido)

Sfrutta i lavori di Mark Ptashne (che ha studiato Gal4), che arrivò alla conclusione che i fattori trascrizionali sono strutture modulari. Se sono presenti il domino di legame al DNA e il dominio di attivazione, posso separarli e fonderli con i domini di altri fattori, creando nuove proteine.

Il sistema a due ibridi si basa sull'utilizzo di due proteine chimere, una delle quali può legarsi al DNA, mentre l'altra è in grado di attivare la trascrizione. Normalmente, nei fattori trascrizionali, il dominio DNA-binding (DBD) e quello di transattivazione (AD)

sono collegati perché appartenenti allo stesso polipeptide. I due domini sono indipendenti, e il loro legame può quindi essere interrotto. È necessario mantenere ogni componente in posizione, e per farlo si possono utilizzare due domini proteici aggiuntivi che riescano ad interagire tra loro, fusi a ciascuno dei due domini originali. In questo modo, il dominio DBD può portare in una determinata posizione il dominio di transattivazione. Se i due domini aggiuntivi interagiscono bene tra loro si ricostruisce, dal punto di vista funzionale, la molecola originale. Abbiamo così trovato un sistema per mappare le interazioni proteina-proteina. Per far funzionare il sistema, bisogna fornire il target giusto, una sequenza promotrice che sta a monte di un gene reporter di funzionalità, ad esempio la cassetta HIS3 o URA3, che codificano per geni i cui prodotti sono parte della via metabolica di sintesi, rispettivamente di istidina e uracile. Se avviene

Interazione tra i domini aggiuntivi X e Y, si ha attivazione della trascrizione e il gene HIS3 si esprime. Questa operazione viene fatta in un ceppo batterico HIS3-, che cresce solo se la cassetta HIS3, che complementa il locus HIS3-, è trascrizionalmente attiva. La trascrizione di HIS3 dipende dalla ricostruzione funzionale del costrutto dell'attivatore trascrizionale.

Prima facciamo crescere il ceppo in terreno ricco di istidina, in modo che sopravviva anche se il sistema non viene ricostituito. Utilizzando il replica-plating (inventato da Joshua Lederberg), durante lo studio della coniugazione in E.coli), le colonie vengono trasferite dal terreno ricco in terreno povero di istidina.

Se le colonie muoiono, significa che il sistema non si è ricostituito. Se invece sopravvivono, significa che i domini X e Y possono interagire tra loro per ricostituire il sistema.

Il dominio DNA-binding spesso utilizzato è il dominio di Gal4, uno dei primissimi transattivatori.

ibile utilizzare Gal4 come strumento per studiare l'espressione genica e la regolazione dei geni nella famiglia Gal.