Genetica molecolare

Genetica molecolare 1

Introduzione

Tappe fondamentali degli studi molecolari che hanno dato il via alla biologia molecolare e alla

genetica molecolare:

Esperimento di Griffith 1928

- : scoperta della possibilità del trasferimento di una

sostanza che trasforma batteri non virulenti in batteri virulenti.

Esperimento di Avery

- : ha determinato che la sostanza trasferita è DNA, principio

trasformante

Esperimenti di R. Franklin, Wilkins, Watson e Crick (1953)

- : determinazione della

struttura del DNA

Primi esperimenti di DNA ricombinante

- : scoperta di enzimi di restrizione e della

possibilità di clonare DNA lineare in plasmidi con cui si può trasformare cellule

batteriche

Invenzione della PCR

- : rivoluzione nel campo della biologia molecolare

Sequenziamento del DNA (1977)

- : sequenziamento del genoma di un batteriofago

Sequenziamento del genoma umano (2001)

- : HPG e Celera

ERA POST-GENOMICA: applicazioni del progetto genoma umano, malattie genetiche

 - Mendeliana o monogenica: mutazione dovuta a un singolo gene, trasmissione

familiare molto chiara soprattutto per quelle malattie con una penetranza del 100%

(malattia per cui se un individuo eredita la mutazione ha il 100% di probabilità di

manifestare il fenotipo).

- Multifattoriali: malattia dovuta al coinvolgimento di più geni, non tutti gli individui

mostrano gli stessi fenotipi perché questi dipendono anche dal resto del loro genoma e

dalla combinazioni delle mutazioni presenti.

- Cellule somatiche: generalmente dovuta a una mutazione ereditata più altre

mutazioni all’interno di una cellula che insorge successivamente.

Quindi in seguito alla pubblicazione di HGP, si è passati alla ricerca di geni malattia in

patologie mendeliane e ricerca di geni e mutazioni predisponenti a malattie multifattoriali e

oncologiche.

Partendo dalla sequenza completa si può notare che il 99,9% di essa è identica in ogni

individuo, le variazioni fra l’uno e l’altro dipendono dal restante 0,1%. Queste variazioni

consistono in cambiamenti delle singole basi, fra cui conversione di una base in un’altra,

delezioni e inserzioni, i cosiddetti SNP. Questi possono non aver nessun effetto, effetti

innocui o portare allo sviluppo di malattie.

La maggior parte delle malattie genetiche sono dovute a mutazioni puntiformi, tuttavia non

tutte le mutazioni portano necessariamente a un difetto ed è alla base della variabilità

all’interno di una popolazione. La variabilità è molto importante per sopravvivere a un

ambiente che cambia nel tempo, organismi con poca variabilità non hanno molto successo

evolutivo. Due chiari esempi sono rappresentati dal diavolo della Tasmania, in cui non si

verificano fenomeni di rigetto di cellule tumorali trapiantate (ma anche in seguito a

trasferimenti da morsi) e dalla pianta di banana, questa negli anni 50-60 era coltivata una

sola cultivar, in seguito alla diffusione di un patogeno ha determinato la scomparsa della

Gros Michel. Si è quindi iniziato a coltivare la Cavendish resistente al Fusarium, attualmente

però il fungo è mutato e può attaccarla. Per quanto riguarda l’uomo sono stati identificati

quasi 5 milioni di SNP, ma anche altre 70.000 tipologie di variazioni fra cui delezioni,

duplicazioni, inserzioni e inversioni.

Da uno studio su 2500 individui sono

stati identificate 24-30 mutazioni che

causano malattie mendeliane in

eterozigosi. Si è detto che le

mutazioni non causano

necessariamente difetti, ogni giorno

all’interno di ciascuna cellula

avvengono numerosissime lesioni al

DNA (non necessariamente una mutazione, ad esempio ssDNA breaks, depurinazioni, 2

alchilazioni, deaminazioni ecc.), all’interno della cellula sono però presenti sistemi di

riparazione del danno. Ad esempio la luce solare causa circa 100.000 lesioni al DNA in ogni

cellula ogni ora.

Difetti dei processi nella riparazione dei danni al DNA causano instabilità genomica e in

 ultima istanza cancerogenesi. Nell’immagine un’idea del processo non funzionante e la

malattia associata.

Cromosoma eucariotico, cariotipo umano e struttura dei cromosomi

Il genoma umano è composto di 23 cromosomi, 22 autosomici più quelli sessuali. L’uomo è un

organismo diploide, per cui per ciascun cromosoma sono presenti due copie, una di origine

paterna e una di origine materna. In seguito alla replicazione del DNA si trovano sdoppiati nei

due cromatidi fratelli, i cromosomi sono stati numerati in base alla dimensione, posizione del

centromero ecc. L’assetto cromosomico normale di un organismo è detto euploidia e la ploidia

è caratteristica per ogni organismo (uomo diploide, banane triploidi, alcuni insetti sono

monoploidi e S. cerevisiae può essere sia aploide che diploide in base alla fase in cui si trova).

Una variazione del grado di ploidia

nell’uomo non è compatibile con la vita,

mentre nel regno vegetale è tollerata bene

e viene sfruttata in agricoltura.

Struttura

I cromosomi sono composti da:

Telomeri

- : terminali del cromosoma,

sono complessi nucleo-proteici.

Centromeri

- : porzione centrale del

cromosoma che prende contatto

con le fibre del fuso mitotico.

Origini di replicazione

- : la replicazione parte da diversi punti, altrimenti ci vorrebbe

troppo tempo per replicare il DNA.

Le varie forcelle di replicazione si incontrano a generare i due cromatidi fratelli (identici,

DNApol genera pochissimi errori) che verranno separati durante l’anafase.

Il DNA ha diversi gradi di compattamento, partendo dalla fibra a 2nm fino ad arrivare a gradi di

condensazione estremamente elevati dei cromosomi metafasici. Il grado di compattamento

dipende anche dalla fase del ciclo cellulare in cui ci si trova.

Ciclo cellulare

G1 : fase di crescita e normale metabolismo cellulare

S : il DNA e i cromosomi vengono replicati e i cromatidi fratelli vengono tenuti in contatto dalle

coesine

G2 : fase di crescita in cui la cellula si prepara alla divisione

M : in cui si ha la divisione cellulare, è la fase più veloce rispetto alle altre e si divide in profase,

metafase, anafase, telofase e citochinesi. Il centromero entra in contatto con i microtubuli

provenienti dal centro di organizzazione dei microtubuli. A questo punto la coesina viene

degradata, i due cromatidi fratelli separati e tirati ai poli opposti della cellula. La coesina

assicura proprio che i due cromatidi fratelli vengano separati in modo corretto.

Durante la meiosi invece in seguito alla replicazione del DNA, i cromatidi fratelli si

 appaiano a formare una tetrade e avviene il crossing over, si la segregazione dei

cromosomi omologhi seguita dalla segregazione dei cromatidi fratelli e infine si ha la

formazione di 4 cellule aploidi.

Durante la meiosi i cromatidi fratelli non vengono tenuti associati dalle coesine ma dalla 3

formazione del complesso sinaptinemale che consente il crossing over.

Alterazioni del corredo cromosomico

Possono esserci poliploidie, monoploidie che riguardano l’intero assetto cromosomico e

aneuploidie che riguardano il numero di uno o pochi cromosomi. Queste alterazioni derivano da

eventi di non disgiunzione durante la meiosi a generare gameti sbilanciati. L’errore può

avvenire sia durante la prima divisione meiotica sia durante la seconda, nel caso della

sindrome di down c’è una relazione molto stretta con l’aumentare dell’età della madre.

DNA damage

Il DNA a differenza dell’RNA è una molecola

estremamente stabile, tuttavia può

anch’essa essere soggetta a danni. I danni

possono essere causati da agenti endogeni prodotti dalla cellula stessa o anche esogeni ovvero

molecole esterne (agenti mutageni).

Fra gli eventi principali troviamo:

- Incorporazione di dNTP sbagliati

- Incorporazione di rNTP (ribonucledoside trifosftao) che normalmente non sono

componenti del DNA

- Deaminazione e depurinazione

- Danni da ROS: ossidazione delle basi

- Agenti alchilanti

- Raggi UV (dimeri di pirimidina)

- Fenomeni di rottura di uno o entrambi i filamenti del DNA.

Esistono proteine specifiche per il riconoscimento di una particolare lesione che attivano

specifici meccanismi di riparazione del danno.

Bisogna innanzitutto fare una distinzione fra danno al DNA e mutazione, il primo è una

modificazione della struttura molecolare del DNA mentre la seconda è un cambiamento

ereditabile della sequenza.

Il danno al DNA se non viene riparato correttamente

 può portare a mutazioni, queste non possono essere

riparate.

Danni endogeni

Le fonti di danno endogene possono essere:

Mismatch

- : incorporazione di un nucleotide errato

durante la replicazione, si tratta di una lesione e

non di una mutazione (lo diventa nel momento in cui l’errore non viene riparato 4

correttamente).

Deaminazione delle basi

- : tre delle 4 basi possono subire eventi di deaminazione,

ovvero la perdita del gruppo amminico (la citosina diventa uracile, può avvenire in modo

spontaneo).

Depurinazione e depirimidinazione

- : determinate entrambe da eventi di idrolisi

spontanea del legame fra la base e il deossiribosio, si genera un sito apurinico mentre lo

scheletro rimane intatto.

Danno ossidativo

- : i ROS generati dalla respirazione dell’ossigeno che possono andare

ad ossidare le basi portando a diverse alterazioni (danni alle basi e rotture del

filamento). Ad esempio l’ossidazione della guanina porta alla formazione di 8-oxoG (GO).

Incorporazione di analoghi alle basi durante la replicazione del DNA

- : ad

esempio il 5-bromouracile può essere scambiato come una timina, può appaiarsi quindi

a una T o a una G.

Danni esogeni

Fra gli agenti esogeni troviamo gli agenti mutageni:

Agenti idrossilanti

- : idrossilammina che idrossila la citosina a dare 4-idrossicitosina

che al posto di legare una G lega una A.

Agenti alchilanti

- : fra cui l’etilmetansulfonato, che determinano l’alchilazione delle

basi. Tra questi eventi troviamo l’etilazione della guanina a dare 6-etilguanina (G*) che a

questo punto appaia una T invece che una C.

Agenti intercalanti

- : fra cui la proflavina e il bromuro di etidio, si intercalano fra la

molecola di DNA.

Radiazioni ionizzanti

- : generalmente inducono la rottura della doppia elica (raggi x e

gamma), raggi UV-C provocano i dimeri di pirimidine (legame covalente fra due T

adiacenti).

Conseguenza dell’insorgenza di lesioni al DNA

I danni al DNA possono essere trasformati in mutazioni. Fortunatamente nell’uomo solo 48Mb

codificano per geni contro le 3200Mb di genoma totale, di conseguenza la probabilità che una

mutazione avvenga all’interno di una sequenza codificante è bassa. Alcuni esempi di lesioni

trasformate in mutazioni:

mismatch A:G al posto di A:T

- : errore inserito durante la prima replicazione del DNA,

se questo non viene riparto, al secondo round di replicazione una delle due cellule

erediterà in quella posizione una mutazione da A:T a C:G. La cellula a questo punto non

possiede più strumenti per capire che in quella posizione c’è una coppia sbagliata, è

quindi fondamentale che la cellula riconosca il mismatch prima di una seconda

replicazione.

Citosina idrossilata (C*, da idrossilammina)

- : primo round di replicazione, nel

momento in cui la DNApol incontra una C* inserisce una A invece che una G. Alla

successiva replicazione del DNA al posto di una G iniziale verrà inserita una T (cha

appaia giustamente con una A). La C* deve essere riparata prima della prima

replicazione del DNA.

Guanina etilata (G*, da etilmetansulfonato)

- : se il danno non viene riparato, la

DNApol anziché inserire una C inserisce una T, alla successiva replicazione alla T viene

appaiata una A. Si passa dunque da una coppia G:C a una A:T.

5-bromouracile

- : normalmente si comporta come una T e quindi può essere

incorporato nella sequenza appaiato a una A, tuttavia in alcuni casi può appaiarsi con

una G. Può quindi capitare che durante la prima replicazione al posto di una A venga

inserita una G, che alla replicazione successiva verrà appaiata con una C causando una

mutazione da T:A a C:G.

Acido nitroso

- : modifica la C in U, se questo non viene rimosso durante la prima

replicazione verrà appaiato con una A causando, nella successiva replicazione

l’inserimento di una T. Si passa dunque da C:G a T:A. In alternativa l’acido nitroso può

convertire la A in ipoxantina (A*) che se non viene rimossa al primo round di

replicazione viene appaiata con una C che alla successiva replicazione del DNA la

DNApol inserisce una G. si passa quindi da A:T a G:C.

Le mutazioni possono insorgere nelle linee germinali, in questo caso tutte le cellule

 5

dell’organismo che origina da quello spermatozoo o cellula uovo conterranno la mutazione.

In alternativa può insorgere in cellule somatiche, questa sarà presente solo nelle cellule che

derivano da quella cellula somatica. Tuttavia nel caso di mutazioni precoci, se queste

avvengono in cellule da cui origina la linea spermatica, potranno essere trasmesse alla

progenie.

Più è precoce l’insorgere della mutazione più è probabile che

questa possa interessare la linea spermatica e quindi essere

trasmessa alla progenie. Un individuo in cui insorgono

mutazioni somatiche viene

definito mosaico, esistono

mosaicismi genetici (se l’individuo

è costituito da linee cellulari che

differiscono per il genotipo) o

cromosomici (se differiscono per il

cariotipo). Esistono diversi gradi di

mosaicismo in funzione di quando

la mutazione insorge, più

precocemente un mutazione

insorge, più l’individuo mostra un grado elevato di mosaicismo

(come mostrato in foto).

Inoltre l’insorgenza di mutazioni è un fenomeno casuale che non è influenzato dall’ambiente (a

meno che l’individuo non si trovi in un ambiente mutageno). Questo è stato dimostrato dal test

di fluttuazione di Luria-Delbruck, le mutazioni

insorgono casualmente senza alcun riferimento al

vantaggio ambientale che ne deriva. Per dimostrarlo si

utilizzarono cellule batteriche infettate con il fago T1,

una mutazione TonR rende il batterio resistente

all’infezione da parte del fago. Se la mutazione che

determina la resistenza fosse indotta dall’esposizione

al fago ci si aspetterebbe che nelle 4 colture iniziali ci

sia un numero di cellule resistenti uguale. Tuttavia

quello che si è visto è che in alcune colture si mostrava

resistenza in altre no, inoltre a seconda del momento

di insorgenza della mutazione si ha un grado di cellule resistenti diverse.

Le mutazioni si suddividono in:

Geniche

- : mutazione puntiforme, sono quelle responsabili della maggior parte delle

malattie genetiche.

Cromosomiche

- : mutazioni che alterano la struttura dei cromosomi (delezioni,

inversioni, traslocazioni ecc.).

Genomiche

- : alterano il numero di singoli cromosomi o dell’intero set cromosomico.

Conseguenza delle mutazioni

Mutazione missenso

- : circa il 45-50% delle mutazioni missenso causano varie

patologie nell’uomo. Una sostituzione di base cambia l’amminoacido codificato per

quella tripletta e può determinare una mutazione neutra (se l’amminoacido sostituito è

chimicamente simile a quello di origine, non causa effetti), una mutazione silente (la

mutazione non cambia l’amminoacido, codice genetico degenerato).

Mutazioni non senso

- : la sostituzione di base determina l’inserimento di un codone di

stop nella sequenza codificante, si generano così proteine tronche che non sono

funzionali.

Mutazioni frameshift

- : inserzioni e delezioni di base determinano lo spostamento del

frame di lettura, mutazione molto drastica.

Esempio della fibrosi cistica: delezione di 3 coppie di basi dalla sequenza (TCT o CTT)

 causano la delezione di una Phe dalla catena polipeptidica (ΔF508).

Mutazione in regioni non codificanti

- : possono comunque affliggere la funzionalità 6

della proteina in quanto possono insorgere in regioni intergeniche regolatrici (promotori,

enhancer ecc), in siti di splicing o in regioni 5’ e 3’ non tradotte (hanno un ruolo molto

importante nella regolazione della traduzione dell’mRNA).

Meccanismi di mantenimento della stabilità del genoma

L’insorgere di lesioni al DNA non riparati inducono mutazioni nella sua sequenza, questo porta

a instabilità genomica che è associata a cancerogenesi e malattie genetiche. Le cellule

possiedono un sistema di risposta ai danni al DNA genericamente chiamato DNA Damage

Response network (DDR). Questo sistema si attiva per riparare i danni e permette alla cellula di

tollerare le lesioni evitando che questi vengano tramutati in qualcosa di peggiore. Quando la

DDR non si attiva a causa di mutazioni nelle proteine che regolano questo sistema, allora il

danno si trasforma in mutazioni e in ultima istanza cancro e malattie genetiche. Quando le

lesioni vengono trasformate in mutazioni il sistema DDR non è più in grado di ripristinare la

normalità. È anche vero che la sopravvivenza di una specie è data da un bilancio fra

riparazione e non riparazione dei danni in quanto la non riparazione dei danni e quindi

l’insorgenza di mutazioni è alla base della divergenza fra le specie e l’adattamento

all’ambiente.

Riparazione dei danni al DNA

Le riparazioni dei danni al DNA si dividono in due grosse famiglie, la reversione diretta delle

lesioni (comprende fotoriattivazione e riparazione delle basi alchilate) e l’excisione delle lesioni

(excisione di basi BER, dei nucleotidi NER e riparazione degli errori di

appaiamento delle basi MMR).

Fotoriattivazione

Meccanismo di riparazione diretta che la cellula utilizza per la

riparazion