Genetica molecolare

Funzionamento del meccanismo di checkpoint

Abbiamo visto molte proteine coinvolte, nomi da ricordare: Tel1 (ATR), Mec1 (ATM), Ddc2 (ATRIP), RFC-like e complesso 9-1-1. Fra i mediatori ricordare Rad9 (53BP1) e le chinasi effettrici Rad53 (Chk2) e Chk1 (Chk1).

Sensori

Mec1 e Tel1 sono proteine chinasi ad alto peso molecolare che funzionano come sensori per il danno al DNA. Tel1 funziona attraverso il complesso MRX, è quest'ultimo che monitora il DNA. Infatti MRX lega l'estremità incorrispondenza del DSB e attiva Tel1 che da sola non è in grado di legarsi al DNA (nell'uomo è uguale ma con MRN e ATR).

Mec1 è in grado di legarsi autonomamente al DNA ma funziona attraverso il suo interattore, Ddc2. La piena attivazione di Mec1 richiede però il complesso 9-1-1. Questo complesso lega il DNA indipendentemente dalla presenza di Mec1 e ne amplifica l'attività (Mec1 funziona senza il complesso 9-1-1 ma è meno efficiente).

9-1-1 viene caricato sul DNA dal complesso RFC-like. I complessi RFC-like e PCNA like sono molto simili a quelli della replicazione, la differenza è che nel primo al posto di Rfc1 abbiamo Rad24 (rad17) mentre le altre subunità sono le stesse (Rfc2-5). Nel secondo complesso invece, mentre nella replicazione ci sono 3 subunità uguali di PCNA, qui abbiamo il complesso 9-1-1. Durante la replicazione PCNA serve per mantenere la DNApol associata sul DNA, durante il checkpoint non è ancora ben chiaro quali proteine aiutano a legare il DNA. Quello che si sa è che togliendo uno dei 2, Mec1 non funziona al massimo delle sue potenzialità. Tel1 (ATM) riconosce la rottura della doppia elica di DNA e viene caricato sul DNA da MRX (MRN), Tel1 (ATM) fosforila MRX (MRN) anche se questo evento non è ben chiaro a cosa serva. Mec1 (ATR) attraverso Ddc2 (ATRIP) riconosce il DNA a singolo filamento ricoperto da Rpa e si lega a quest'ultimo, anche in questo caso Mec1.

(ATR) fosforila Ddc2 (ATRIP) anche se non si sail ruolo fisiologico di questo evento.

ATM: si è visto nell'uomo che ATM è presente come dimero inattivo, una volta caricata sul DNA da MRN avviene una serie di eventi di autofosforilazione intermolecolare in cui una subunità fosforila l'altra provocando la dissociazione del complesso. In questo modo vengono rilasciati imonomeri di ATM attivi, il meccanismo preciso di come MRN attiva la funzione chinasica di ATM non è ben chiaro.

Adattatori e trasduttori

L'attivazione di Mec1 (ATR) e Tel1 (ATM) promuove l'attivazione delle chinasi downstream Rad53 (CHK2) e Chk1 (CHK1). Questo avviene attraverso un adattatore, ovvero Rad9 (53BP1).

RAD53 e RAD9: Mec1 fosforila Rad9 su diversi siti, Mec1 fosforila anche Rad53. La fosforilazione di Rad9 promuove l'associazione con Rad53. La presenza di altri siti fosforilati su Rad9 determina la capacità di più Rad9 di associarsi a formare un tetramero.

In questo modo diverseRad53 si trovano vicine nello spazio, è come se Rad9 faccia da scaffold per far incontrareRad53. A questo punto Rad53 va incontro ad autofosforilazione intermolecolare (una Rad53 fosforila l'altra) e viene rilasciata la forma attiva di Rad53.A cosa serve quindi la fosforilazione di Rad53 da parte di Mec1 se poi la forma attiva viene rilasciata in seguito alla autofosforilazione intermolecolare? Questo evento serve a pre-attivareRad53, se Mec1 non fosforila Rad53, quest'ultima non è in grado di autofosforilarsi pur legandoRad9.La fosforilazione di Rad53 e Ddc2 è stata dimostrata sperimentalmente attraverso analisi biochimiche. In particolare per Rad53 si è visto che in seguito al trattamento delle cellule con raggi UV col passare del tempo si osserva uno shift di banda che poi scompare con la progressiva defosforilazione di Rad53.Per Ddc2 si è fatta la stessa cosa utilizzando diverso agenti mutageni, per verificare.che loshift di banda fosse effettivamente dovuto alla presenza di residui fosforilati parte dei campioni sono stati trattati con fosfatasi λ, un enzima che rimuove le fosforilazioni. In questa analisi si osserva lo shift di banda solo nei campioni che non sono stati trattati con la fosfatasi. Inoltre, per verificare lo stato di attivazione del checkpoint in un campione trattato con agenti mutageni, si va a effettuare un gel per verificare la presenza di Rad53 fosforilata.

Segnali che inducono l'attivazione del checkpoint

Fra i segnali che attivano il checkpoint troviamo i dimeri di T, lesioni al singolo e doppio filamento e danni alle basi. Abbiamo visto che Tel1 (ATM) attiva la risposta al danno al doppio filamento, mediata da MRX (MRN). Per quanto riguarda le altre lesioni che vengono riconosciute da Mec1 (ATR), si è ipotizzato che il danno primario non agisca di per sé come attivazione ma che venga processato a formare una struttura secondaria comune che viene poi

riconosciuta per attivare il meccanismo di checkpoint. Il segnale secondario si è ipotizzato essere il DNA a singolo filamento. Infatti nel caso di dimeri di T, il meccanismo NER fa un taglio a sinistra e un taglio a destra, si espone un tratto a singolo filamento che viene ricoperto da RPA. Nel caso di una rottura del singolo filamento in fase G2, si innesca un processo di resection che espone un tratto di ssDNA ricoperto da RPA e si innesca la ricombinazione omologa. Analogamente nel caso di basi danneggiate in fase S, lo stallo della forca replicativa causa un iniziale disaccoppiamento della leading strand e della lagging strand che espone un tratto di ssDNA, ricoperto da RPA. È stato infatti dimostrato che Mec1 (ATR), riconosce il ssDNA ricoperto da RPA generato dal processamento del danno primario. Tuttavia bisogna tenere conto che il ssDNA, in alcune situazioni, viene generato anche in assenza di danni al DNA come ad esempio durante la replicazione del DNA in corrispondenza dellaforca replicativa si formano tratti di ssDNA, ricombinazione meiotica, trascrizione (in generale tutti quei processi che aprono la doppia elica). Si è visto infatti che le cellule sono in grado di tollerare una certa soglia di ssDNA senza attivare il checkpoint, nel momento in cui si supera questa soglia si attiva il checkpoint. Fasi in cui agisce il DNA damage checkpoint Abbiamo già accennato alle fasi in cui il checkpoint agisce, vediamole ora nel dettaglio. Questi studi sono stati condotti in lievito in quanto è possibile sincronizzare la fase del ciclo cellulare di una popolazione di cellule, con cellule umane è molto difficile farlo. G1/S Quando il danno avviene in fase G1, si ha il rallentamento della transizione alla fase S. Per arrestare una popolazione di cellule in fase G1 si utilizza α-factor, un feromone peptidico che lega i recettori presenti sulla superficie cellulare (agisce in 2h). L'arresto in G1 si può verificare mediante

1. citofluorimetria a flusso (FACS), misurando il contenuto di DNA della popolazione.
2. Cellule wt senzairraggiamento: partendo da cellule aploidi le cellule al tempo 0 dall'aggiunta di α-factor, si notano 2 picchi il primo indica che il contenuto di DNA nella cellula è 1C, il secondo 2C (ovvero quando la replicazione del DNA è completa), l'area fra i due picchi indica le cellule che in quel momento sono in fase S.
3. Nel momento in cui si aggiunge α-factor si nota che il picco si sposta su 1C, per verificare che le cellule siano in fase G1 si valuta il profilo di gemmazione al microscopio ottico (la gemma infatti determina la transizione G1/S, se le cellule sono bloccate in fase G1 non hanno la gemma).
4. Rimuovendo α-factor il ciclo cellulare riprende in modo sincrono, tutte le cellule iniziano la replicazione del DNA (dura circa 30 minuti), si forma la gemma e si dividono (dopodiché si perde la sincronia).
5. In caso di danno al DNA in cellule wt: dopo aver...

sincronizzato le cellule in G1 induco ildanno al DNA usando UV. Dopo irraggiamento si nota che l'ingresso in fase S è moltorallentato, a 90 minuti la maggior parte delle cellule non ha ancora replicato il DNA e nonhanno formato la gemma. Se guardiamo lo stato di fosforilazione di Rad53 si nota che dopo 10minuti dal trattamento con UV tutta Rad53 è fosforilata, indice che il checkpoint è attivato.L'attivazione dipende da Mec1? Ripetiamo l'esperimento in un Mec1Δ.In caso di danno al DNA in cellule Mec1Δ: dopo il trattamento con UV le celluleprogrediscono nel ciclo cellulare come in un ceppo wt. Questo indica che il checkpoint non si èattivato, monitorando la formazione della gemma si vede che le cellule hanno quasi tutte lagemma. Rad53 non risulta fosforilata. Ora, in queste cellule manca completamente Mec1,l'attivazione del checkpoint dipende dalla sua attività chinasica? Ripetiamo l'esperimento inMec1kd1, un

mutante in cui il gene Mec1 è presente ma in cui non funziona il dominio chinasico (kd = kinase dead). In caso di danno al DNA in cellule Mec1kd1: quando viene irraggiato con UV, il ciclo cellulare progredisce senza rallentamenti come nel wt e in modo anticipato rispetto al wt irraggiato, la quasi totalità delle cellule hanno la gemma e non si ha la fosforilazione di Rad53. Possiamo concludere che l'attivazione del checkpoint in caso di danni indotti dagli UV dipende da Mec1 e che la sua attività chinasica è fondamentale. G2/M Bisogna bloccare le cellule in fase G2 del ciclo cellulare, per farlo trattiamo con nocodazolo (un agente che interferisce con la polimerizzazione dei microtubuli). Le cellule trattate mostrano la gemma formata ma che non riesce a staccarsi dalla cellula madre in quanto viene distrutto il fuso mitotico e non si ha la transizione metafase-anafase, non si ha la divisione del nucleo e la separazione dei cromatidi fratelli. In questo casol'analisi FACS è inutile, si monitora la percentuale di cellule binucleate in cui è avvenuta la transizione metafase-anafase. Wt non irraggiato: al tempo 0 non ci sono cellule binucleate indice del fatto che tutte le cellule sono bloccate in fase G2. Tolgo nocodazolo e col passare del tempo si nota il progredire del ciclo cellulare (divisione del nucleo e citochinesi). Wt irraggiato con UV: si nota un rallentamento della transizione metafase-anafase (divisione dei nuclei). Guardando la fosforilazione di Rad53 si nota che dopo irraggiamento è tutta fosforilata fino a 60 minuti. Il ceppo selvatico attiva il checkpoint. In caso di danno al DNA in cellule Mec1Δ e Mec1kd1: entrambi dividono il nucleo più velocemente rispetto al wt irraggiato. In entrambi i casi Rad53 non è fosforilata, indice del fatto che il checkpo