Genetica medica - Appunti

Genetica

Il genoma umano è un'entità dinamica che va incontro a variazioni permanenti della sequenza nucleotidica (mutazioni). Esso è costituito da una sequenza di circa 3 miliardi di nucleotidi organizzati in 23 coppie di cromosomi lineari e in una piccola molecola di DNA circolare del mitocondrio. La duplicazione del DNA è un processo semiconservativo in quanto origina dall'utilizzo di uno dei due filamenti come stampo per il nuovo complementare. La completa replicazione del DNA richiede circa 8 ore. Il dogma centrale della biologia molecolare è la complessità della sintesi degli RNA e delle proteine.

Sintesi dell'RNA

Nella sintesi dell'RNA, l'RNA polimerasi sintetizza le molecole di RNA sullo stampo delle sequenze di DNA. È aiutata da un promotore che posiziona l'RNA polimerasi nel punto giusto e separa i due filamenti di DNA per formare la bolla di trascrizione. L'enzima RNA polimerasi sintetizza una molecola di RNA in direzione 5'-3'. Il processo di trascrizione continua fino a che l'RNA polimerasi trova un sito di arresto (codone di stop). Le cellule eucariotiche possiedono 3 tipi diversi di RNA polimerasi:

• RNA polimerasi I: trascrive i geni per gli RNA ribosomiali
• RNA polimerasi II: trascrive i geni per gli RNA messaggeri
• RNA polimerasi III: trascrive i geni per tutti gli RNA transfer

Struttura dei geni

Dal punto di vista della genetica, il gene è quella sequenza di DNA potenzialmente trascrivibile in RNA funzionalmente attivo. Nel genoma umano sono presenti circa 23.000 geni codificanti delle proteine e 1.000 – 2.000 codificanti RNA. Esistono comunque dei trascritti non codificanti.

Condizioni per la trascrizione

Sono due:

• Devono essere presenti i fattori di trascrizione, fondamentali poiché interagiscono con le brevi sequenze del promotore e con le sequenze enhancer (intensificatori della trascrizione).
• La cromatina del gene o della sequenza deve avere una conformazione "aperta", cioè i nucleosomi non devono essere compattati e il DNA non deve essere associato agli istoni del promotore.

La cromatina intattiva è detta compatta; quella attiva è detta aperta. Inoltre, la cromatina attiva è generalmente caratterizzata da un alto livello di acetilazione degli istoni H3 e H4. Le modificazioni della cromatina sono chiamate epigenetiche poiché non modificano la sequenza primaria del DNA. Al contrario, gli istoni associati alla cromatina inattiva sono deacetilati. La deacetilazione e l'acetilazione degli istoni è determinata da due tipi di enzimi: acetiltransferasi e deacetilasi. La modificazione epigenetica più studiata riguarda il DNA: la metilazione delle citosine, tipica delle regioni non trascritte e dei promotori inattivi. Le citosine metilate vengono riconosciute da proteine chiamate MBD e in questo modo determinano il reclutamento di altre proteine atte a modificare la cromatina e a compattarla.

Il controllo dell'espressione genica coinvolge due fattori:

• Fattori ubiquitari (presenti nello stesso momento e luogo)
• Fattori tessuto-specifici
• Fattori ormonali: l'espressione di molti geni è regolata e controllata da un ormone, da un fattore di crescita o da una molecola di segnalazione intracellulare. Questi elementi determinano l'attivazione o l'inattivazione dei fattori di trascrizione, legandosi a recettori specifici.

Esosomi

Gli esoni sono le sequenze codificanti. Il numero degli esoni presenti nei geni umani è variabile (esistono alcuni esoni eccezionalmente lunghi e vi sono geni piccoli con un solo esone). Il numero medio di esoni per gene è circa 9-10. Il primo esone è anticipato da una regione tradotta ma non trascritta (regione 5'UTR). La sequenza trascrivibile è costituita dal trinucleotide ATG nel primo esone. Anche l'ultimo esone contiene una zona non tradotta (regione 3'UTR).

Introni

Gli introni sono le sequenze non codificanti. Quasi tutti gli introni cominciano con il dinucleotide GT e terminano con AG. Questi dinucleotidi (GT e AG) sono circondati da sequenze consenso, indispensabili per la corretta eliminazione delle sequenze introniche.

Isoforme

Con il termine isoforme si indicano quei geni in grado di codificare per due o più forme alternative di proteine, appunto due o più isoforme proteiche (forme alternative della stessa proteina). Queste isoforme derivano da tre meccanismi:

• Splicing alternativo: è il meccanismo più frequente con il quale si generano delle isoforme e consiste nell'assemblaggio differenziale di esoni durante la maturazione dell'RNA.
• Uso di promotori alternativi: uno degli esempi più noti di geni con più promotori è il gene della distrofina che contiene ben otto promotori alternativi tessuto-specifici differenti.
• Poliadenilazione alternativa: è una fase di maturazione dell'RNA messaggero e consiste nell'aggiunta della coda di poli-A all'estremità 3' del pre-mRNA. In molti casi durante la maturazione di uno specifico RNA può verificarsi una combinazione di questi meccanismi e dare origine a più isoforme a partire da un singolo gene.

Trascritti non codificanti e antisenso

La presenza di trascritti in entrambi i filamenti di DNA a intervalli regolari su intere regioni cromosomiche ha dimostrato la presenza di ncRNA (no coding RNA) ovvero di trascritti non codificanti. Circa il 27% del genoma umano viene sicuramente trascritto in RNA messaggero. Di contro, si stima che circa il 60% del genoma viene effettivamente trascritto. Si stima siano prodotti 100.000 ncRNA a fronte dei 23.000 geni codificanti proteine. Alcuni ncRNA come il trascritto XIST (responsabile del fenomeno dell'inattivazione del cromosoma X nelle donne), sono molto lunghi e vengono sottoposti al processo di splicing. Altri ncRNA sono di piccole dimensioni e svolgono ruoli in diversi processi quali lo splicing intronico, l'assemblaggio dei ribosomi e il trasporto degli RNA m dal nucleo al citoplasma.

L'RNA polimerasi II non è altamente specifica e può iniziare a trascrivere in ogni posizione o direzione su un tratto di DNA privo di nucleosomi. Questo comporta la produzione di un altissimo numero di ncRNA antisenso: gli ncRNA sono spesso sovrapposti parzialmente a trascritti codificanti. Si stima che circa il 60-70% degli RNA m abbia uno o più trascritti antisenso non codificanti, almeno parzialmente sovrapposti. Gli ncRNA antisenso hanno un ruolo fondamentale nella regolazione trascrizionale e post-trascrizionale: hanno un ruolo nella regolazione dell'espressione genica.

RNA interference

È oggi molto studiato poiché permette l'azzeramento dei livelli intracellulari di uno specifico trascritto. Tale fenomeno è anche noto come PTGS. L'RNAi è un meccanismo epigenetico mediante il quale alcuni frammenti di RNA a doppio filamento sono in grado di interferire (e spegnere) l'espressione genica. L'RNAi è uno dei fenomeni di silenziamento genetico più studiato. Il meccanismo di degradazione di questi filamenti doppi di RNA avviene nel citoplasma e ha funzione antivirale (consente di degradare il genoma dei virus a RNA).

Progetto genoma umano

È iniziato nel 1990 con l'obiettivo di ottenere il complesso sequenziamento dei 3 miliardi di nucleotidi componenti il corredo aploide dei 23 cromosomi umani. Il Progetto Genoma Umano si è basato sulla ricostruzione della sequenza del DNA di pochi individui. L'obiettivo principale del progetto è quello di comprendere la funzione dei geni. Tuttavia, sappiamo che il genoma umano è unico da individuo a individuo e che il progetto non ha studiato l'intero DNA. Alcune zone eterocromatiche infatti non sono ancora state sequenziate.

DNA a sequenza unica: circa il 46% del genoma può essere considerato a sequenza unica, cioè presente in singola copia. La maggior parte dei DNA è composta dai geni codificanti proteine. Nel genoma umano esistono moltissime copie non funzionali di geni chiamati pseudogeni. Questi pseudogeni sono originati da due meccanismi: tramite duplicazione (si forma una copia non funzionale vicino a un gene funzionale, composta di esoni e introni ma contiene delle mutazioni che impediscono la sintesi di una proteina; questi sono detti pseudogeni non processati) oppure tramite retrotrascrizione dell'RNA m (sono detti pseudogeni processati e sono i più frequenti; sono privi di introni e promotori e presentano una coda di poli-A). I geni che codificano l'RNA sono circa 2000.

DNA ripetitivo intersperso: circa il 45% del genoma è ripetitivo. Cioè esistono elementi (elementi trasponibili) che sono ancora capaci di replicarsi e inserirsi in nuove posizioni del genoma. Questi elementi sono i trasposoni e i retroelementi (derivanti dalla retrotrascrizione del RNA) e sono appunto capaci di auto-trascriversi e replicarsi. Questa capacità può essere causa di patologia genetica. I retrotrasposoni sono specifici tipi di trasposoni che possono essere retrotrasposoni LTR (se presentano delle sequenze terminali ripetute) o non-LTR. Alcuni retrotrasposoni non-LTR sono i LINE e i SINE.

DNA ripetitivo in tandem: il 9-10% del genoma è composto da regioni di DNA altamente ripetitivo, cioè composto ma tante unità ripetute in tandem di lunghezza variabile. Questo DNA è noto come satellite. Il genoma umano non consente di apprezzare a pieno la variabilità genetica che rende unico un individuo dall'altro. Dobbiamo considerare almeno tre polimorfismi genetici:

• Polimorfismo di un solo nucleotide
• Polimorfismo di lunghezza
• Microsatelliti e le varianti di numero di copie

Variazioni del genoma umano

Genotipo: è il corredo genetico di un individuo, cioè l'insieme dei geni contenuti nel DNA. La combinazione dei geni è unica da individuo a individuo.

Fenotipo: è l'insieme dei caratteri che sono manifestati dall'individuo e che sono quindi osservabili. Il fenotipo dipende dal genotipo ma anche dalle interazioni tra gene e ambiente. Mendel studiò il fenotipo delle piante di piselli e risalì al loro genotipo.

Polimorfismi: sono variazioni genetiche con una prevalenza maggiore dell'1% della popolazione; il polimorfismo genetico è mantenuto nelle popolazione a causa della selezione naturale.

Variante privata: è una variazione che ha una prevalenza inferiore all'1% in una popolazione.

Mutazione: cambiamento permanente della sequenza di DNA.

Classificazione mutazioni

Le mutazioni possono essere dominanti (se coinvolgono un allele dominante) o recessive (se coinvolgono un allele recessivo). Possono essere somatiche (non ereditarie) o germinali (ereditarie). Possono essere indotte (causate da agenti patogeni) o spontanee. Le mutazioni spontanee possono essere esogene o endogene. Una mutazione si può definire patogenetica se risponde ai seguenti criteri:

• È stata riscontrata precedentemente in altri pazienti
• È una mutazione de novo, cioè non presente nei genitori sani
• La sostituzione amminoacidica (missenso) non è conservativa
• Ha un effetto dannoso sulla funzione della proteina

Non è da ritenersi patogenetica se:

• Un amminoacido è stato sostituito da un altro con caratteristiche biochimiche simili
• Uno dei due genitori presenta la stessa variante

Esistono tre grandi classi di mutazioni:

• Mutazioni geniche (relative ai geni)
• Mutazioni cromosomiche (relative alla struttura dei cromosomi)
• Mutazioni genomiche (relative al numero dei cromosomi)

Le mutazioni geniche sono quelle che derivano dall'alterazione di un singolo gene. Le mutazioni sono distinte in tre categorie seguendo un criterio di ampiezza del difetto genico e modalità d'insorgenza:

• Mutazioni puntiformi (coinvolgono pochi nucleotidi)
• Mutazioni dinamiche (relative alla ripetizione di brevi triplette; è causata da uno slittamento della replicazione causata da un cattivo appaiamento dei filamenti complementari); sono dette dinamiche poiché sono instabili e soggette a cambiamenti
• Riarrangiamenti genici strutturali (coinvolgono regioni più o meno ampie)

Mutazioni puntiformi

Derivano da variazioni della sequenza di DNA causate da uno o pochi nucleotidi. L'errore, la variazione può nascere per un fenomeno di transizione (es. la sostituzione di una purina con un'altra purina o di una pirimidina con un'altra pirimidina) oppure per un fenomeno di transversione (es. sostituzione di una pirimidina con una purina e viceversa). In base all'effetto della variazione nucleotidica sui prodotti genici distinguiamo:

• Mutazioni silenti: la sequenza amminoacidica non è modificata; mutazioni di questo genere sono innocue. Tuttavia, a esse sono collegati problemi relativi allo splicing, che impediscono la corretta maturazione degli RNA trascritti. Queste mutazioni silenti sono di solito localizzate nelle sequenze ESE e nelle sequenze ESS.
• Mutazioni missenso: un amminoacido è sostituito da un altro. Spesso tali mutazioni vengono identificate come polimorfismi poiché non incidono sul piano clinico e funzionale. Di solito non si manifesta fenotipicamente.
• Delezioni/Inserzioni in frame: perdita o inserimento di uno o più amminoacidi nella catena polipeptidica. Le conseguenze sono un cambiamento del quadro di lettura della sequenza di RNA m e cambiamento della sequenza amminoacidica. Possono avere manifestazione fenotipica a seconda della funzione proteica che vanno ad alterare.
• Mutazioni nonsenso: inserimento di un codone di stop precoce. Può avere conseguenze diverse sull'espressione genica: rende instabile l'RNA m; può generare raramente una sintesi di un polipeptide tronco; può essere attivato il meccanismo di esclusione dell'esone mutato per consentire di stabilizzare l'RNA.
• Mutazioni frame-shift: slittamento del quadro di lettura in conseguenza a una delezione/inserzione. Hanno le stesse conseguenze delle mutazioni nonsenso.
• Mutazioni di splicing: sono molto frequenti e riguardano un'alterazione nella maturazione del pre-mRNA. Si distinguono quattro tipi di mutazioni di splicing:
• Riguardano i siti canonici GT o AG
• Mutazioni nella sequenza consenso nel sito di biforcazione
• Mutazioni in sequenza ESE (tale sequenza favorisce la rimozione degli introni)
• Sostituzione di una base in una sequenza intronica

Quindi la mutazione di splicing ha quattro effetti:

• Viene escluso l'esone dall'RNA m e si forma una proteina priva degli aa codificati dall'esone escluso
• L'introne non viene eliminato nel corso dello splicing
• Nel trascritto maturo è incluso una parte di introne
• Viene esclusa una parte di esone nell'RNA m

Di solito tali mutazioni coinvolgenti nucleotidi, delezioni, inserzioni, non hanno effetti patogenetici. Inoltre, le mutazioni puntiformi non hanno effetto fenotipico se l'alterazione si verifica in regioni non codificanti. Se però l'alterazione si verifica su una regione codificante allora si avrà un'attivazione o inattivazione di un gene. È il caso sei riarragiamenti genici strutturali.

Mutazioni nelle regioni regolatrici della trascrizione

In questo gruppo sono incluse le mutazioni:

• Delezioni/duplicazioni
• Inversioni: inverte l'orientamento del frammento di DNA compreso tra i due punti di rottura; è una delle maggiori cause di emofilia A
• Conversioni geniche: trasferimenti non reciproci di tratti di DNA tra sequenze alleliche o non alleliche. In questo caso un gene presenta caratteristiche proprie (donatore) e caratteristiche nuove dovute alla ricombinazione (accettore).
• Trasposizione di elementi ripetuti: copie di elementi ripetuti (Alu e LINE) che possono raramente inserirsi in un gene inattivandolo. Anche la trasposizione di elementi ripetuti è una delle cause dell'emofilia A.

Mutazioni dinamiche

Sono dovute a una ripetizione di una tripletta. Se il numero di ripetizioni supera una certa soglia, è ritenuta patogenetica. Sono dinamiche poiché sono instabili e le loro dimensioni variano nella trasmissione alla prole. In base al luogo in cui avviene la mutazione dinamica distinguiamo:

• Ripetizioni di triplette CAG nella regione codificante di un gene
• Ripetizioni di tre o più nucleotidi nella regione non codificante

La causa più conosciuta è lo slittamento della DNA polimerasi. Quando una mutazione si verifica dopo il concepimento, ovvero durante lo sviluppo embrionale si stabiliscono due linee cellulari diverse: una normale e una mutata.

Mosaicismo

Si verifica quando coesistono due linee cellulari nello stesso individuo. Può essere germinale o somatico. Il mosaicismo somatico di solito non ha conseguenze fenotipiche ma può essere responsabile dell'insorgenza di tumori.

Effetto delle mutazioni sul fenotipo

Si distinguono due categorie:

• Mutazioni con perdita di funzione: responsabili di fenotipi recessivi. Può però determinare un fenotipo dominante nel caso in cui il livello di proteina prodotto da un allele è insufficiente per compensare la perdita dell'altro. In questo caso si ha il fenomeno dell'aploinsufficienza. Un esempio è l'ipercolesterolemia famigliare. Può avere effetto dominante anche quando il prodotto dell'allele mutato non solo perde la propria funzione ma interferisce con l'allele normale. In questo caso si parla di effetto dominante negativo.
• Mutazioni con acquisizione di funzione: responsabili di fenotipi dominanti.

Le mutazioni infine possono coinvolgere clinicamente solo un organo o più sistemi.