Genetica medica

DISEGNARE I PRIMER:

seq 5’ atggctcagtggaaccag… 3’ primer forward (si appaia alla 3’5’): atggctcagtggaaccag

  [Tm= 56° T annealing= 54/51°]



3’ …tgacccgtatacgtcggt 5’ primer reverse (si appaia alla 5’3’): tggctgcatatgcccagt

 [Tm= 56° T annealing= 54/51°]



I primer:

- Devono avere una lunghezza compresa tra le 16 e le 25 basi

- Devono avere una Tm e più o meno uguale (quella di annealing varia di 2/5° rispetto a

Tm)

- Non si devono appaiare tra di loro: diventerebbero dimeri e substrato per la Taq

Polimerasi; questo sottrarrebbe reagente per la PCR vera e propria.

- Non devono ripiegarsi su sé stessi a forcina.

Esistono dei programmi apposta per disegnarli.

Dopo la PCR, si passa ad un’elettroforesi orizzontale o verticale (agarosio per DNA, acrilamide

per proteine). Per vedere se quello che è stato amplificato era la zona desiderata (a volte ho

sequenze aspecifiche perché i primer si legano in punti diversi), si utilizza un marcatore di

peso molecolare: riconosco se la sequenza è quella giusta perché ne conosco il peso

molecolare e lo confronto con quello del marker.

È fondamentale che la reazione sia fatta con massima attenzione, per evitare la

contaminazione dei campioni per esempio con il nostro DNA. Idealmente si utilizza quindi una

stanza isolata e con pipette diverse per DNA e primer.

SEQUENZIAMENTO DEL DNA:

il sequenziamento del DNA permette di determinare la sequenza delle basi di una determinata

sequenza, per identificare eventuali mutazioni.

Parte dalla sintesi in vitro: la polimerasi aggiunge le basi, formate da base azotata + zucchero

+ gruppo trifosfato, in direzione 5’3’.

Durante la sintesi si forma il legame fosfodiesterico (P-OH) al 5’ trifostato e viene liberato

pirofosfato.

Esistono dei nucleotidi modificati chimicamente, come il didesossiribonucleotide, che non ha il

gruppo OH(ossidrile) e che non possono quindi formare il legame fosfodiesterico: vengono

utilizzati per la fine del sequenziamento.

SEQUENZIAMENTO MANUALE: - 4 provette con DNA, 4 dNTP normali, ddNTP

(nucleotide terminatore; 1 per provetta: ddATP,

ddTTP, ddCTP, ddDTP), nucleotide radioattivo, un

primer e DNAPolimerasi

- Allungamento dopo attaccamento al primer; ogni

volta che incorpora per caso il nucleotide

terminatore, si ferma (nel caso della ddATP, prima

si ferma alla prima T) = ho sequenza sempre più

lunghe

- Elettroforesi verticale con il gel di

acrilamide, per distinguere

frammenti che differiscono anche

solo di una base.

In ogni porta campione si inserisce il prodotto della reazione di ciascuna di

queste provette: si ottengono delle bande (metodo di Sanger)

METODO SEMI-AUTOMATICO:

La radioattività per la visualizzazione (radiografia del gel) è pericolosa per la salute, quindi si

è tentato di trovare un nuovo metodo meno dannoso.

Alle basi oggi sono attaccati dei fluorocromi (rodamine/pigmenti). I BigDyes sono 4, uno per

ogni terminatore e sono discriminabili per colore:

- JOE: verde, ddA

- ROX: rosso, ddT

- FAM: blu, ddC

- TAMRA: giallo, ddG

Basta solo una provetta= meno lavoro manuale e meno dannosità e più velocità.

- Nella provetta c’è: DNA a singola elica denaturato, 4 dNTP e 4ddNTP ognuno marcato

con un fluorocromo diverso, primer e DNA Polimerasi ciascun frammento termina con



un determinato colore ad una determinata lunghezza.

- Elettroforesi con un’unica lane: riconosco per il colore

- Sequenziatore, costituito da piastra + capillare con tubi che contengono il gel (pescano

nella provetta e fanno un’elettroforesi capillare).

INIEZIONE ELETTROCINETICA: i campioni sono colpiti da un laser per far emettere la

fluorescenza ABERRAZIONI CROMOSOMICHE

Le anomalie cromosomiche sono mutazioni che si

registrano soprattutto prima della nascita (poi

calano) e che sono identificabili dall’analisi del

cariotipo, che studia il numero e la struttura dei

cromosomi.

Le anomalie possono essere GAMETICHE

(costituzionali) o POST-ZIGOTICHE (mosaicismo); si

registrano nel 7,5% dei concepimenti, nel 50% degli

aborti spontanei e nello 0,7% dei nati vivi.

Le conseguenze delle mutazioni sono aborti, ritardo

nell’accrescimento e mentale, anomalie fisiche

(facciali o viscerali) e sterilità.

- Anomalie di struttura: dovute a rotture

seguite da riparazione errata a causa si agenti

chimici, fisici o virus

- Anomalie di numero: dovute alla mancata disgiunzione meiotico e spesso correlate con

l’età della madre. ALLESTIMENTO DI UN CARIOTIPO

Prelievo di 10/20ml di sangue semina delle gocce in un terreno arricchito di mitogeno



fitoemoagglutinina incubazione per 2/3 giorni blocco in metafase utilizzanto colcemide

  

trasferimento in provetta, fissaggio e centrifuga risospensione in una soluzione a bassa



concentrazione salina per rompere globuli rossi e rigonfiare i linfociti goccia su un vetrino e



colorazione con Giemsa.

ANOMALIE DI STRUTTURA SBILANCIATE

Le anomalie sbilanciate includono:

- DUPLICAZIONI in tandem o invertite

- DELEZIONI TERMINALI: la Sindrome del cri-du-chat è la conseguenza di una delezione

terminale in una delle due copie del cromosoma 5; la mutazione porta a microcefalia,

micrognazia, grave ritardo mentale, malformazioni dell’appartato gastrointestinale e

pianto dal verso simile al miagolio del gatto. [46,XX,del(5)(p13)]

- DELEZIONE INTERSTIZIALE: un esempio di conseguenza della mutazione è la Sindrome

Prader Willi. La malattia venne descritta nel 1956 e causa ipotonia neonatale,

dismorfismi facciali, difficoltà nell’alimentazione, ritardo lieve o moderato

nell’accrescimento, ipogonadismo nel maschi, bulimia ed obesità [46,XX,del(15)

(q11q13)]

- INSERZIONI

ISOCROSOMIA: Si definisce isocromosoma il prodotto da una scissione meiotica errata

dal punto di vista del piano

ANOMALIE DI STRUTTURA BILANCIATE

Nelle anomalie bilanciate non avviene la perdita o l’acquisizione di materiale genetico. Il

fenotipo risulta quindi normale, ma si osservano problemi nella produzione dei gameti.

Sono soprattutto traslocazioni, derivare da una rottura e conseguente riparazione errata,

oppure ad uno scambio non omologo durante la meiosi:

- T. intracromosomica non reciproca: all’interno dello stesso cromosoma

- T. intercromosomica reciproca: due

cromosomi si scambiano un pezzo; 1/1000

individui

- T. intercromosomica non reciproca: un

pezzo di cromosoma va in un altro

Esempio di nomenclatura t. intecromosomica



reciproca tra 20 e 4 in una femmina, nella regione 2

della banda 5 del braccio lungo in 4 con la regione 11

sottoregione 2 del braccio lungo di 20 

46,XX,t(4;20)(q2.5,q11.2)

In una traslocazione reciproca, durante la meiosi si

forma un TETRAVALENTE: prodotti di uno stesso gamete vanno in cellule diverse, causando

così gameti sbilanciati in proporzione: 2/3

T. ROBERTSONIANA

Questo tipo di traslocazione avviene unicamente nei cromosomi acrocentrici (centromero

in posizione terminale e quindi braccio corto piccolo; 13, 14, 15, 21, 22). A seguito della

mutazione, i cromosomi si uniscono e perdono le braccia corte; rimangono le braccia lunghe

unite.

I cromosomi mutati sono detti derivativi del [n° cromosoma].

Solitamente il paziente sta bene perché il materiale

perduto è ripetuto in altre zone del genoma. Si è

osservato che:

- Nel 50% degli aborti uno dei due genitori aveva

un’anomalia bilanciata

- Il feto a seguito di traslocazione Robertsoniana

presenta malformazioni

Nella traslocazione Robertsoniana si forma un

TRIVALENTE e si possono avere diversi tipi di

segregazione.

Diverse sindromi di Down derivano dalla segregazione

sbilanciata durante la traslocazione Robertsoniana.

Circa il 5% delle sindromi di Down sono generate da una traslocazione tra il 14 ed il 21. Il

portatore fenotipicamente normale è aneuploide di 45 cromosomi perché possiede un 21 ed

un 14 normali più 14/21 traslocato. L’individuo produrrà 6 tipi di gameti: 3 con fenotipo non

vitale, uno con sindrome di Down, uno normale ed uno portatore. Questo tipo di sindrome di

Down, a differenza della trisomia citata in seguito, non dipende dall’età materna.

ANEUPLOIDIE

Si definiscono come aneuploidie le anomalie di numero (trisomia, monosomia, poliploidia)

dovute ad una non disgiunzione meiotica correlabile all’età della madre; infatti, sono frequenti

nei concepimenti in donne di età superiore ai 35 anni.

La non disgiunzione dei cromosomi nelle anafasi si può verificare:

- alla prima divisione meiotica: alla fine ho cellule senza cromosoma e cellule con doppio

cromosoma. Se quelle con doppio cromosoma vengono fecondate da uno spermatozoo,

si ha una trisomia

- alla seconda divisione: cellule normali e cellule con doppio cromosoma

Le monosomie sono rare perché gli embrioni vengono persi quando ancora la gravidanza non

è stata diagnosticata. La monosomia X porta a Sindrome di Turner: benché in tutte le

cellule ci sia inattivazione di un X, una monosomia dà problemi perché ci sono le regioni

pseudoautosomiche, i cui geni non vengono inattivati.

la triploidia è la forma più comune di poliplidia nell’uomo ed è riscontrabile del 30% degli

aborti spontanei. Nel 75% dei casi la triploidia completa presenta due assetti cromosomici

paterni; la frequenza è di 1/10 000. I neonati completamente triploidi muoiono però entro il

primo mese di vita.

- La trisomia 13, anche detta Sindrome di Patau, si riscontra con una frequenza di 1/15

000 ed il neonato muore entro il primo mese di vita a causa delle malformazioni facciali

ed a gravi problemi al snc ed al sistema cardiovascolare. L’età dei genitori è finora

l’unica causa correlata alla malattia

- I bambini affetti da trisomia 18 o sindrome di Edwards risultano piccoli e con ritardo

mentale, tengono i pugni serrati con le dita sovrapposte e presentano problemi di

malformazioni cardiache ed insufficienza respiratoria. La malattia si riscontra in un

neonato su 11 000 con sopravvivenza media di 2/4 mesi

Sindrome di Down

Sintomatologia:

- ritardo mentale e demenza precoce

- facies (epicanto, ridotta circonferenza cranica)

- plica unica palmare

- malformazioni cardiache

- elevata incidenza di leucemie

La trisomia 21 è l’unica trisomia che permette di raggiungere l’età adulta.

Nel 95% dei casi si riscontra trisomia libera 47,XX/XY,+21. Il principale fattore di rischio è



l’età della madre, perché al 90% avviene la non disgiunzione nella meiosi materna

Nel 4% dei casi la malattia è dovuta