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Genetica medica

Appunti di genetica medica basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Giordano dell’università degli Studi del Piemonte Orientale Amedeo Avogadro - Unipmn, Interfacoltà, Corso di laurea in biotecnologie. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Genetica medica docente Prof. M. Giordano

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ESTRATTO DOCUMENTO

DUCHENNE BECKER

La più conosciuta e frequente tra le Più lieve, in quanto i sintomi si

malattie degenerative dell’infanzia presentano più tardi (una sorta di forma

benigna)

Insorgenza tra i 2 e i 5 anni Debolezza muscolare

Atrofia progressiva fino alla perdita di Esordio a 12 anni e decorso lento fino

mobilità a circa 12 anni; al 30% QI<75 alla perdita di deambulazione tra i 30 e i

40 anni

X-linked recessiva, 1/3 sporadici, alto QI normale e cuore meno

tasso di mutazione de novo frequentemente compromesso

1:3500 maschi nati vivi

Cardiomiopatia negli ultimi anni di vita nel

95% dei casi

Morte in seguito all’impossibilità di

respirare a circa 20 anni

PATOLOGIE MITOCONDRIALI

I mitocondri, organuli cellulari dove viene prodotto l’ATP, sono presenti in numero diverso nei

tipi cellulari a seconda della necessità di ATP.

La membrana interna del mitocondrio crea invaginazioni e contiene gli enzimi della catena di

trasporto degli elettroni (fosforilazione ossidativa). I complessi enzimatici generano energia

attraverso il trasporto degli e-, che vengono portati dalla matrice allo spazio intermembrana,

dove una ATP sintetasi (complesso V) produce ATP grazie a questo gradiente elettrochimico.

Le mutazioni nel genoma mitocondriale portano a MALATTIE NEUROMUSCOLARI, ovvero a

livello dei tessuti che richiedono maggiore energia, appunto muscoli (miopatie), cervello,

fegato, reni e spermatozoi (nelle cellule del muscolo cardiaco il 40% del citoplasma è

occupato da mitocondri; esistono cellule con 1000 mitocondri).

Il mtDNA è una molecola chiusa, rappresentato in

modo circolare; esistono da 2 a 10 molecole di DNA

per mitocondrio e quindi 1000/10 000 mtDNA per

cellula (100 000 nell’oocita).

I geni mitocondriali sono simili a quelli batterici:

senza introni, non avvolto a proteine istoniche e geni

uno di fila all’altro, per un totale di 16569bp disposte

a doppia elica (Heavy e Light strand).

L’elica pesante codifica per più geni, che sono in

tutto 37 (2 rRNA, 22 tRNA, 13 proteine, subunità

della NADH deidrogenasi, citocromo C ossidasi, ATP

sintetasi e Citocromo b).

I ribosomi nel mitocondrio lavorano solo sui geni

mitocondriali.

I complessi della fosforilazione ossidativa sono costituiti sia dalle 13 proteine tradotte dal

genoma mitocondriale, che da altre 74 derivate dal genoma nucleare.

I mitocondri derivano dalla colonizzazione di batteri, che non potrebbero ormai sopravvivere

da soli, in quanto non sono muniti di DNA Polimerasi.

Un indizio di queste teoria è la replicazione del DNA mitocondriale bidirezionale asincrona,

simile nei batteri (D-loop replicazione).

La trascrizione somiglia anch’essa a quella dei batteri: tutta la molecola di DNA mitocondriale

è trascritta in una volta (policistronico); i geni sono separati tra di loro dai tRNA, che si

ripiegano nella loro struttura classica e tagliati da enzimi; gli RNA vengono quindi separati e

tradotti singolarmente.

Il codice genetico dei mitocondri (e dei cloroplasti) presenta codoni diversi rispetto a quelli

nucleare. Infatti, nei mitocondri i codoni di stop nucleari codificano invece per a.a.; gli enzimi

sono quindi tradotti unicamente all’interno del mitocondrio.

GENOMA NUCLEARE GENOMA MITOCONDRIALE

DIMENSIONI 3200 Mb 16,6 Kb

N° MOLECOLE DI DNA 23 in XX e 24 in XY; lineari 1 molecola circolare

DIVERSE

N° MOLECOLE DI DNA PER 46 in diploidi Migliaia (variabile)

CELLULA

PROTEINE ASSOCIATE Istoniche e non Quasi nessuno

N° DI GENI 25 000 – 30 000 (1/100 Kb) 37 (1/0,45 kb)

INTRONI Nella maggior parte dei geni Assenti

% DI DNA CODIFICANTE 1,5 – 3% 93%

EREDITA’ Mendeliana (autosomi e X) e Esclusivamente materna

paterna (Y)

Il genoma mitocondriale è ereditato solamente per via materna, perché il citoplasma dello

spermatozoo non entra nella cellula uovo (la maggior parte dei mitocondri sono attorcigliati

attorno alla coda dello spermatozoo).

Nel caso del genoma mitocondriale non avviene ricombinazione e si osserva un tasso di

mutazione di 14 basi ogni 100 ogni milione di anni (il nucleare invece di 10^-8bp ad ogni

generazione).

Il genoma mitocondriale viene utilizzato quindi per studiare l’evoluzione dell’uomo ed il

cromosoma Y. Dato che non ricombina mai e muta raramente, il DNA mitocondriale di un

soggetto è quello uguale a quello della prima donna sulla terra. Grazie alla mutazione si

studia quando le popolazioni si sono separate e sono migrate.

Esistono dei programmi che permettono di minimizzare il numero di mutazioni che sono state

necessarie a raggiungere la variabilita’ osservata. Conoscendo il tasso di mutazione è

possibile calcolare il tempo che ha portato alla divergenza (ex: divergenza tra uomo e

scimmia 5milioni di anni fa). MALATTIE

A livello teorico, la femmina trasmette a tutti i figli, indipendentemente dal sesso, mentre i

maschi non tramettono mai a nessuno.

In realtà, le malattie mitocondriali dimostrano un’elevata espressività variabile detta

ETEROPLASMIA e definita come presenza all’interno di un mitocondrio di DNA sano e malato

allo stesso tempo; questa è la condizione più frequente, perché la mutazione avviene su un

DNA mitocondriale dei 2 o più presenti.

Se compare una mutazione durante la divisione cellulare e quindi il turnover mitocondriale a

causa delle fluttuazioni casuali (deriva), il mitocondrio avrà solo mtDNA mutati e darà origine

a mitocondri mutati. In realtà, all’interno di una cellula ci sono molti mtDNA segregano

passivamente (spartizione casuale); in questo caso le mutazioni si distribuiscono a collo di

bottiglia e i mitocondri presenteranno una % di mtDNA mutato (eteroplasmia).

Nel caso della cellula precursore dell’ovocita, questa avrà una preponderanza di mitocondri

wild type o mutati. Dopo divisioni cellulari numerose, ci saranno ovociti con diversi rapporti

tra mitocondri mutanti/wild type. Dopo la fecondazione, l’ovocita darà origine ad uno zigote

sano oppure più o meno mutato. Oltre che dalla % di mtDNA mutati nello zigote, il fenotipo

della progenie dipende anche dalle successive segregazioni nei diversi tessuti.

Il fenotipo sarà diverso da soggetto a soggetto: non tutti saranno malati ed i malati

presenteranno estrema variabilità per gravità (che dipende dalla necessità di E del tessuto) e

tessuti colpiti.

Solo poche malattie da alterazioni del DNA mitocondriale sono caratterizzate dalla presenza

della stessa mutazione in tutte le cellule (omoplasmia).

La presenza di solo mitocondri mutati non è compatibile con la vita neanche dello zigote.

EFFETTO SOGLIA: in una malattia mitocondriale, la malattia non si presenta finché la

percentuale di mitocondri mutati non supera il 50%.

Esempi di patologie:

- SNC: encefalopatia, sintomi simili all’infarto, demenza, psicosi e depressione, atassia,

emicrania

- SNP: miopatia, neuropatia senso-motoria assonale

- OCCHIO: oftalmoplegia esterna, ptosi, cataratta, retinite pigmentaria, atrofia ottica

- UDITO: sordità

- CUORE: cardiomiopatie (ipertrofca e dilatativa), arresto, sindrome di pre-eccitazione

- RENE: difetti al tubulo renale

- APP. GASTROINTESTINALE: disfagia, pseudo-ostruzione, costipazione, danno epatico

- GHIANDOLE ENDOCRINO: diabete mellito, ipoparatiroidismo, ipotiroidismo, danno alle

gonadi La colorazione tricromica di Gomori modificata permette di

visualizzare le fibre muscolari rosse frastagliate (RAGGED RED

FIBERS), tipiche di molte miopatie mitocondriali dovute ad un

accumulo di mitocondri anomali a seguito di una biopsia muscolare.

Anche mutazioni a livello nucleare possono portare a malattie

mitocondriali, perché ci sono geni sul genoma nucleare che codificano

per alcune proteine dei complessi della fosforilazione ossidativa;

queste mutazioni vengono ereditate come autosomiche/X linked.

MALATTIE PER ESPANSIONE DI TRIPLETTE

Le malattie per espansione di triplette vengono anche chiamate mutazioni dinamiche o

instabili.

Le sequenze sono polimorfiche per quanto riguarda il tipo di ripetizioni. Tutto questo rientra

comunque nella normalità e normalmente sono stabili: una patologia insorge nel momento in

cui queste triplette si espandono all’interno di geni codificanti. Le malattie da espansioni

nucleotidiche mostrano penetranza incompleta, espressività variabile, fenomeno

dell’anticipazione ed instabilità mitotica/meiotica.

DISTROFIA MIOTICA

La distrofia miotica viene ereditata come autosomica dominante con una frequenza di 1:8 000

.

Sintomatologia:

- Miotonia: incapacità di rilasciare la mano dopo aver stretto un oggetto o apertura degli

occhi

- Debolezza muscolare a carico prevalentemente delle gambe e del viso

- Calvizie e cataratta precoce

- Voce nasale

- Scoliosi

- problemi cardiaci, endocrini e respiratori

- difetti cognitivi

La malattia mostra inoltre il FENOMENO DELL’ANTICIPAZIONE: la malattia trasmessa dal padre

ad un figlio aumenta di gravità, in quanto si manifesta prima ed i sintomi si possono

accumulare (la più grave è la distrofia miotonica congenita, che porta alla morte entro ai 2

anni).

Il gene responsabile è la distrofina, dove in questa malattia c’è un’espansione di una tripletta

–CTG- al 3’UTR che dal normale numero di 5/37 espandono in numero superiore a 60 (fino a

3000 copie). Il numero di triplette aumenta da una generazione alla successiva.

In base alla quantità delle triplette, la malattia sarà più o meno grave (da solo la cataratta alla

malattia congenita).

Esiste il fenomeno dell’anticipazione perché, quando la tripletta supera la soglia normale,

l’allele in mitosi ha la tendenza ad espandersi (la Polimerasi ‘inciampa’ e tende ad ampliare).

L’instabilità è a livello di mitosi e meiosi. L’espansione è più evidente se il gene malato viene

trasmesso per via paterna. SINDROME DELL’X FRAGILE

La Sindrome dell’X fragile è una delle cause più frequenti di ritardo mentale dei bambini

legata all’X.

La malattia ha una frequenza di 1/1200 maschi e 1/2500 femmine.

Nel 20-50% dei casi l’allele mutato ha bassa penetranza nei maschi, che vengono quindi

definiti maschi trasmettitori.

I sintomi sono:

- ritardo mentale

- facies allungata

- circonferenza cranica aumentata ed impianto basso delle orecchie

La tripletta interessata è CGG nel promotore del gene FMR1 sul cromosoma X (trasporta

mRNA dal nucleo al citoplasma). Quando la tripletta è molto espansa viene metilata, in quanto

contiene molti CG (CpG Island like) ed il gene non viene trascritto: la causa della malattia è

quindi la mancanza del trascritto. La presenza di più di 200 ripetizioni contribuisce alla

fragilità del cromosoma (osservabile al microscopio).

Ho una fase normale (5/50 ripetizioni), una pre-mutata (50/200 ripetizioni) ed una full

mutation (>200). La fase di premutazioni si presenta in 1/259 femmine e 1/813 maschi ed è

legata ad una disfunzione ovarica (gemelli o POF, tremor e FXTAS).

Un fattore che condiziona l’espansione delle triplette è il sesso del genitore portatore.

Generalmente, quando i maschi trasmettono il carattere, le triplette tendono a mantenersi in

numero constante o diminuire. Il cambiamento da alle pre-mutato ad allele completamente

mutato si verifica solo se a trasmettere l’allele è la donna.

Anche in questa malattia c’è un effetto parentale materno, ovvero la tripletta si espande

maggiormente se trasmessa da una femmina (espansione full mutation materna). La

penetranza aumenta di generazione in generazione.

COREA DI HUNGTINGTON

La malattia è autosomica dominante, con penetranza dipendente dall’età. Il

50% dei casi presentano sintomatologia entro i 45 anni.

La sindrome ha frequenza 1:20 000 e si mostra con demenza (esordio 35-80

anni).

L’espansione della tripletta CAG provoca accumulo dell’huntingtonina, che si

mostra come inclusione all’interno dei neuroni.

L’identificazione degli alleli mutati è possibile con un’elettroforesi ed un

Southern Blot: gli alleli mutati hanno un maggior peso molecolare perché

hanno più ripetizioni.

La diagnosi predittiva ha però problemi etici. È importante seguire dei

principi generali: consenso e scelta informati, autonomia e confidenzialità.

METODICHE DI LABORATORIO

IBRIDAZIONE

L’ibridazione è una tecnica utilizzata per determinare la presenza e la quantità di una certa

molecola, servendosi di sonde marcate con un fluorocromo o materiale radioattivo (ora in

sostituzione). La sonda è una molecola che lega una determinata sequenza, marcandola.

Aumentando la temperatura si assiste alla dissociazione, mentre abbassando la temperatura

e grazie a condizioni di elevata stringenza, le eliche si riassociano in base a complementarietà

(completa meno specifica).

La STRINGENZA è una caratteristica fondamentale per la corretta ibridazione ed è definita

come la specificità con cui la sonda lega la sequenza bersaglio. I parametri che la controllano,

se estremi, modificano la molecola: le condizioni di alta stringenza permettono di ibridare solo

con una sequenza complementare e sono alta T, minore [Na+] e presenza di denaturanti

chimici; le condizioni di bassa stringenza al contrario permettono l’appaiamento anche con

sequenze non del tutto complementari.

I parametri che quindi permettono la denaturazione sono: alte temperatura, pH alcalino

estremo, bassa forza ionica (Na+) e sostanze denaturanti come la formammide.

FATTORI CHE INFLUENZANO L’IBRIDAZIONE

- La T di Melting, ovvero la temperatura ottimale alla quale condurre l’ibridazione, a cui

il 50% del DNA è a singola elica ed il 50% è a doppia.

Dipende dalla composizione in basi del DNA, perché la forza di legame CG è maggiore

di quella AT, ma generalmente è 85/95° (temperatura di denaturazione che dà stabilità

all’ibrido).

Se si utilizza come sonda un oligonucleotide: Tm= 4(C+G) + 2(A+T)

- Le interazioni di tipo idrofobico tra le basi di filamenti diversi

- Cariche negative dei gruppi fosfato del DNA

Nella fase di riappaiamento si formano molecole omoduplex (uguali a quelle di partenza e

complementari al 100%) ed eteroduplex, in cui posso trovare dei mismatch dato che la

sequenza non è del tutto complementare. A seconda della natura dell’ibrido è possibile

scegliere le migliori condizioni di stringenza (ex: se si vuole ottenere eteroduplex, si ricorre a

condizioni di bassa stringenza).

La tecnica è utile per cercare uno stesso gene in diverse specie, per identificare mutazioni e

nella PCR.

L’ibridazione si serve di un supporto solido, una membrana: il DNA viene posto sul filtro con

una pipetta e si incuba il filtro con la soluzione contenente una sonda marcata. Al termine si

lava il DNA marcato non ibridizzato e si procede con l’autoradiografia, per verificare la

corretta ibridazione (vedo un ‘pallino’).

LA MARCATURA DELLE SONDE

La marcatura può essere radioattiva (nucleotidi marcati con radioisotopi) o non radioattiva. In

entrambi i casi è necessario incorporare dNTP modificati nel frammento di DNA substrati della

DNA polimerasi, in modo che il filamento di nuova sintesi sia marcato.

Nella marcatura radioattiva il nucleotide è marcato con marcatura interna tramite radioisotopi

nel fosfato marcato in ; se invece voglio una marcatura terminale, marco il fosfato Si

 .

possono utilizzare: 32/33P, 35S (al posto di un O2 nel gruppo fosfato), 3H (al posto di atomi di

H) o trizio.

Il materiale radioattivo ogni 15 giorni dimezza la sua intensità ed è quindi da utilizzare

nell’immediato.

I marcatori non radioattivi sono invece:

- Fluorocromi: Fluoresceina e Rodamina; marcatura diretta di primer in 5’ o nel

sequenziamento automatizzato. i marcatori di questo tipo vengono identificati al

microscopio a fluorescenza

- Digossigenina: riconosciuta da Ab specifici marcati con enzimi

- Biotina: lega la streptavidina/avidina coniugata con fosfatasi alcalina o perossidasi. Il

complesso può essere evidenziato aggiungendo un substrato cromogenico o

chemiluminescente.

I vantaggi dell’utilizzo di marcature non radioattive stanno nella sicurezza dell’operatore, nello

smaltimento più tutelato e facile dei rifiuti e nella possibilità di creare sonde stabili. I tempi

sono più brevi e i costi minori.

la tecnica si basa sulla replicazione del DNA in vitro. In particolare, è necessario creare un

primer sintetico (complementare al primo pezzo della sonda da marcare) con la tecnica del

random priming: il primer è creato con la polimerasi di E. Coli e viene poi marcato.

SAGGI DI IBRIDAZIONE STANDARD ED INVERSI

STANDARD:

- Blotting (Dot, Southern, Northern)

- Ibridazione in situ su tessuto o cromosomi

INVERSI:

- Micro-array (marcatura del target)

SOUTHERN BLOT

Il Southern Blot è utile per cercare delle mutazioni SNP (single nucleotide polymorphism) o

microdelezioni/inserzioni.

Per mutazioni di vari alleli (VNTR) si utilizzano mini o microsatelliti (10/100nt o 1-5nt come

unità ripetuta).

Nella maggior parte dei casi, i polimorfismi sono in regioni intergeniche, ma in rari casi sono

all’interno di sequenze codificanti, cosa che può risultare neutrale o letale.

Gli enzimi di restrizione/endonucleasi sono enzimi batterici, che proteggono il microrganismo

da DNA esogeno

Gli enzimi di restrizione, consentendo di tagliare il DNA in frammenti non casuali, la cui

grandezza dipende unicamente dalla sequenza: costituiscono un formidabile strumento sia

per l’analisi che per la manipolazione del DNA.

Gli enzimi tagliano sequenze palindromiche di 4/6/8 nucleotidi (se il DNA avesse le basi

ugualmente distribuite, si avrebbe un taglio ogni 4^4= 256 basi, o 4^6=4096 per le

sequenze di 6nt). Sono stati isolati 1200 enzimi eucarioti che riconoscono più di 130 sequenze

diverse.

In biologia molecolare, gli enzimi di restrizione vengono utilizzati per tagliare in siti specifici e

inserire il frammento nel vettore (ogni enzima riconosce una sequenza specifica diversa). In

genetica invece sono utili per identificare le mutazioni, perché l’enzima di restrizione non

taglia la sequenza mutata che non è più a lui complementare.

1- Elettroforesi su gel di agarosio: Inserimento di una sonda a cavallo del sito di

restrizione e digestione: il DNA passa attraverso le particelle del gel in base alla

dimensione (le sequenze più corte, a basso peso molecolare, vanno più lontane)

Taglio plasmide con i vari enzimi bande diverse

n.b.: nella situazione di SMIR si notano moltissimi frammenti tutti di peso molecolare

diversi che creano una ‘strisciata’

2- Southern Blot: è stato il primo metodo per le indagini forensi ed utilizzato in tutti i

laboratori prima della PCR.

Dopo l’elettroforesi su gel di agarosio e l’ottenimento di uno smir, l’operatore

trasferisce del materiale dal gel ad una membrana

Ordine: supporto, carta assorbente, gel, membrana di nylon, molta carta assorbente,

piastra di vetro e peso di 0.5kg; l’H2O va alla carta, ma il DNA resta sulla membrana

3- Ibridazione con sonda a seguito di ibridazione, la membrana è esposta a lasta

autoradiografica: il segnale è visibile solo in corrispondenza della sonda.

Risultati: 3 bande= eterozigote; 1 banda= omozigote malato in un allele; 2 bande=

omozigote

Con il metodo del Southern Blot studio il FINGERPRINT. Una conseguenza della variabilità

genetica è che ogni individuo ha una distribuzione diversa dei siti di restrizione nel medesimo

locus (polimorfismi). Solo i gemelli omozigoti hanno lo stesso fingerprint.

Il Fingerprint si utilizza:

- per identificare il colpevole nelle scene del crimine

- nei test di paternità/maternità: le bande del figlio devono avere almeno alcune bande in

comune con il genitore.

Vengono utilizzati molti marcatori, per avere una probabilità di non correttezza

1:20miliardi (più della popolazione della Terra).

Uno dei primi casi di riconoscimento di maternità è stato fatto negli anni ’80, quando fu

necessaria la conferma che il figlio di un’emigrata, arrivato dopo di lei, fosse

effettivamente il figlio: Andrew condivideva delle bande con madre e fratelli. La

probabilità che la condivisione di bande succeda per caso è 1:1trilione

PCR

Il Southern Blot è stato ormai sostituito con la PCR, ovvero Polymerase Chain Reaction,

scoperta dal premio Nobel Kary Mullis.

L’amplificazione del DNA è utile per esempio nel sequenziamento, per trovare una mutazione

o vedere se l’inserto si è inserito correttamente nel plasmide.

Componenti: primers, dNTPs, Mg2+ (se troppo alto danneggia la reazione), Polimerasi, DNA

stampo.

Il Volume ideale di campione è generalmente 15/50 micro-litri.

1) DENATURAZIONE (90/95°)

2) ANNEALING (accoppiamento dei primer) 40/60°; primer complementare all’elica 5’3’

(forward) e l’altro all’altra elica (reverse).

3) ESTENSIONE 72°; la Polimerasi non si denatura perché è la Taq Polimerasi di un

batterio termostabile (Thermus acquaticus)

Nel primo ciclo di PCR la Polimerasi va avanti fino alla ridenaturazione del DNA. Nel secondo

ciclo iniziano a prodursi catene della lunghezza desiderata. Nel terzo ciclo= 2^3 x n (molecole

di partenza) copie.

Di solito si fanno 30 cicli, in modo da amplificare 1miliardo di volte.

DISEGNARE I PRIMER:

seq 5’ atggctcagtggaaccag… 3’ primer forward (si appaia alla 3’5’): atggctcagtggaaccag

  [Tm= 56° T annealing= 54/51°]

3’ …tgacccgtatacgtcggt 5’ primer reverse (si appaia alla 5’3’): tggctgcatatgcccagt

 [Tm= 56° T annealing= 54/51°]

I primer:

- Devono avere una lunghezza compresa tra le 16 e le 25 basi

- Devono avere una Tm e più o meno uguale (quella di annealing varia di 2/5° rispetto a

Tm)

- Non si devono appaiare tra di loro: diventerebbero dimeri e substrato per la Taq

Polimerasi; questo sottrarrebbe reagente per la PCR vera e propria.

- Non devono ripiegarsi su sé stessi a forcina.

Esistono dei programmi apposta per disegnarli.

Dopo la PCR, si passa ad un’elettroforesi orizzontale o verticale (agarosio per DNA, acrilamide

per proteine). Per vedere se quello che è stato amplificato era la zona desiderata (a volte ho

sequenze aspecifiche perché i primer si legano in punti diversi), si utilizza un marcatore di

peso molecolare: riconosco se la sequenza è quella giusta perché ne conosco il peso

molecolare e lo confronto con quello del marker.

È fondamentale che la reazione sia fatta con massima attenzione, per evitare la

contaminazione dei campioni per esempio con il nostro DNA. Idealmente si utilizza quindi una

stanza isolata e con pipette diverse per DNA e primer.

SEQUENZIAMENTO DEL DNA:

il sequenziamento del DNA permette di determinare la sequenza delle basi di una determinata

sequenza, per identificare eventuali mutazioni.

Parte dalla sintesi in vitro: la polimerasi aggiunge le basi, formate da base azotata + zucchero

+ gruppo trifosfato, in direzione 5’3’.

Durante la sintesi si forma il legame fosfodiesterico (P-OH) al 5’ trifostato e viene liberato

pirofosfato.

Esistono dei nucleotidi modificati chimicamente, come il didesossiribonucleotide, che non ha il

gruppo OH(ossidrile) e che non possono quindi formare il legame fosfodiesterico: vengono

utilizzati per la fine del sequenziamento.

SEQUENZIAMENTO MANUALE: - 4 provette con DNA, 4 dNTP normali, ddNTP

(nucleotide terminatore; 1 per provetta: ddATP,

ddTTP, ddCTP, ddDTP), nucleotide radioattivo, un

primer e DNAPolimerasi

- Allungamento dopo attaccamento al primer; ogni

volta che incorpora per caso il nucleotide

terminatore, si ferma (nel caso della ddATP, prima

si ferma alla prima T) = ho sequenza sempre più

lunghe

- Elettroforesi verticale con il gel di

acrilamide, per distinguere

frammenti che differiscono anche

solo di una base.

In ogni porta campione si inserisce il prodotto della reazione di ciascuna di

queste provette: si ottengono delle bande (metodo di Sanger)

METODO SEMI-AUTOMATICO:

La radioattività per la visualizzazione (radiografia del gel) è pericolosa per la salute, quindi si

è tentato di trovare un nuovo metodo meno dannoso.

Alle basi oggi sono attaccati dei fluorocromi (rodamine/pigmenti). I BigDyes sono 4, uno per

ogni terminatore e sono discriminabili per colore:

- JOE: verde, ddA

- ROX: rosso, ddT

- FAM: blu, ddC

- TAMRA: giallo, ddG

Basta solo una provetta= meno lavoro manuale e meno dannosità e più velocità.

- Nella provetta c’è: DNA a singola elica denaturato, 4 dNTP e 4ddNTP ognuno marcato

con un fluorocromo diverso, primer e DNA Polimerasi ciascun frammento termina con

un determinato colore ad una determinata lunghezza.

- Elettroforesi con un’unica lane: riconosco per il colore

- Sequenziatore, costituito da piastra + capillare con tubi che contengono il gel (pescano

nella provetta e fanno un’elettroforesi capillare).

INIEZIONE ELETTROCINETICA: i campioni sono colpiti da un laser per far emettere la

fluorescenza ABERRAZIONI CROMOSOMICHE

Le anomalie cromosomiche sono mutazioni che si

registrano soprattutto prima della nascita (poi

calano) e che sono identificabili dall’analisi del

cariotipo, che studia il numero e la struttura dei

cromosomi.

Le anomalie possono essere GAMETICHE

(costituzionali) o POST-ZIGOTICHE (mosaicismo); si

registrano nel 7,5% dei concepimenti, nel 50% degli

aborti spontanei e nello 0,7% dei nati vivi.

Le conseguenze delle mutazioni sono aborti, ritardo

nell’accrescimento e mentale, anomalie fisiche

(facciali o viscerali) e sterilità.

- Anomalie di struttura: dovute a rotture

seguite da riparazione errata a causa si agenti

chimici, fisici o virus

- Anomalie di numero: dovute alla mancata disgiunzione meiotico e spesso correlate con

l’età della madre. ALLESTIMENTO DI UN CARIOTIPO

Prelievo di 10/20ml di sangue semina delle gocce in un terreno arricchito di mitogeno

fitoemoagglutinina incubazione per 2/3 giorni blocco in metafase utilizzanto colcemide

  

trasferimento in provetta, fissaggio e centrifuga risospensione in una soluzione a bassa

concentrazione salina per rompere globuli rossi e rigonfiare i linfociti goccia su un vetrino e

colorazione con Giemsa.

ANOMALIE DI STRUTTURA SBILANCIATE

Le anomalie sbilanciate includono:

- DUPLICAZIONI in tandem o invertite

- DELEZIONI TERMINALI: la Sindrome del cri-du-chat è la conseguenza di una delezione

terminale in una delle due copie del cromosoma 5; la mutazione porta a microcefalia,

micrognazia, grave ritardo mentale, malformazioni dell’appartato gastrointestinale e

pianto dal verso simile al miagolio del gatto. [46,XX,del(5)(p13)]

- DELEZIONE INTERSTIZIALE: un esempio di conseguenza della mutazione è la Sindrome

Prader Willi. La malattia venne descritta nel 1956 e causa ipotonia neonatale,

dismorfismi facciali, difficoltà nell’alimentazione, ritardo lieve o moderato

nell’accrescimento, ipogonadismo nel maschi, bulimia ed obesità [46,XX,del(15)

(q11q13)]

- INSERZIONI

ISOCROSOMIA: Si definisce isocromosoma il prodotto da una scissione meiotica errata

dal punto di vista del piano

ANOMALIE DI STRUTTURA BILANCIATE

Nelle anomalie bilanciate non avviene la perdita o l’acquisizione di materiale genetico. Il

fenotipo risulta quindi normale, ma si osservano problemi nella produzione dei gameti.

Sono soprattutto traslocazioni, derivare da una rottura e conseguente riparazione errata,

oppure ad uno scambio non omologo durante la meiosi:

- T. intracromosomica non reciproca: all’interno dello stesso cromosoma

- T. intercromosomica reciproca: due

cromosomi si scambiano un pezzo; 1/1000

individui

- T. intercromosomica non reciproca: un

pezzo di cromosoma va in un altro

Esempio di nomenclatura t. intecromosomica

reciproca tra 20 e 4 in una femmina, nella regione 2

della banda 5 del braccio lungo in 4 con la regione 11

sottoregione 2 del braccio lungo di 20 

46,XX,t(4;20)(q2.5,q11.2)

In una traslocazione reciproca, durante la meiosi si

forma un TETRAVALENTE: prodotti di uno stesso gamete vanno in cellule diverse, causando

così gameti sbilanciati in proporzione: 2/3

T. ROBERTSONIANA

Questo tipo di traslocazione avviene unicamente nei cromosomi acrocentrici (centromero

in posizione terminale e quindi braccio corto piccolo; 13, 14, 15, 21, 22). A seguito della

mutazione, i cromosomi si uniscono e perdono le braccia corte; rimangono le braccia lunghe

unite.

I cromosomi mutati sono detti derivativi del [n° cromosoma].

Solitamente il paziente sta bene perché il materiale

perduto è ripetuto in altre zone del genoma. Si è

osservato che:

- Nel 50% degli aborti uno dei due genitori aveva

un’anomalia bilanciata

- Il feto a seguito di traslocazione Robertsoniana

presenta malformazioni

Nella traslocazione Robertsoniana si forma un

TRIVALENTE e si possono avere diversi tipi di

segregazione.

Diverse sindromi di Down derivano dalla segregazione

sbilanciata durante la traslocazione Robertsoniana.

Circa il 5% delle sindromi di Down sono generate da una traslocazione tra il 14 ed il 21. Il

portatore fenotipicamente normale è aneuploide di 45 cromosomi perché possiede un 21 ed

un 14 normali più 14/21 traslocato. L’individuo produrrà 6 tipi di gameti: 3 con fenotipo non

vitale, uno con sindrome di Down, uno normale ed uno portatore. Questo tipo di sindrome di

Down, a differenza della trisomia citata in seguito, non dipende dall’età materna.

ANEUPLOIDIE

Si definiscono come aneuploidie le anomalie di numero (trisomia, monosomia, poliploidia)

dovute ad una non disgiunzione meiotica correlabile all’età della madre; infatti, sono frequenti

nei concepimenti in donne di età superiore ai 35 anni.

La non disgiunzione dei cromosomi nelle anafasi si può verificare:

- alla prima divisione meiotica: alla fine ho cellule senza cromosoma e cellule con doppio

cromosoma. Se quelle con doppio cromosoma vengono fecondate da uno spermatozoo,

si ha una trisomia

- alla seconda divisione: cellule normali e cellule con doppio cromosoma

Le monosomie sono rare perché gli embrioni vengono persi quando ancora la gravidanza non

è stata diagnosticata. La monosomia X porta a Sindrome di Turner: benché in tutte le

cellule ci sia inattivazione di un X, una monosomia dà problemi perché ci sono le regioni

pseudoautosomiche, i cui geni non vengono inattivati.

la triploidia è la forma più comune di poliplidia nell’uomo ed è riscontrabile del 30% degli

aborti spontanei. Nel 75% dei casi la triploidia completa presenta due assetti cromosomici

paterni; la frequenza è di 1/10 000. I neonati completamente triploidi muoiono però entro il

primo mese di vita.

- La trisomia 13, anche detta Sindrome di Patau, si riscontra con una frequenza di 1/15

000 ed il neonato muore entro il primo mese di vita a causa delle malformazioni facciali

ed a gravi problemi al snc ed al sistema cardiovascolare. L’età dei genitori è finora

l’unica causa correlata alla malattia

- I bambini affetti da trisomia 18 o sindrome di Edwards risultano piccoli e con ritardo

mentale, tengono i pugni serrati con le dita sovrapposte e presentano problemi di

malformazioni cardiache ed insufficienza respiratoria. La malattia si riscontra in un

neonato su 11 000 con sopravvivenza media di 2/4 mesi

Sindrome di Down

Sintomatologia:

- ritardo mentale e demenza precoce

- facies (epicanto, ridotta circonferenza cranica)

- plica unica palmare

- malformazioni cardiache

- elevata incidenza di leucemie

La trisomia 21 è l’unica trisomia che permette di raggiungere l’età adulta.

Nel 95% dei casi si riscontra trisomia libera 47,XX/XY,+21. Il principale fattore di rischio è

l’età della madre, perché al 90% avviene la non disgiunzione nella meiosi materna

Nel 4% dei casi la malattia è dovuta a traslocazione sbilanciata; l’età è indifferente [ex:

46,XX,-14,+rob(14q21q)].

Incidenza: 1/800

Mosaicismo

L’evento di non disgiunzione avviene durante le divisioni mitotiche. È un caso meno grave

perché non tutte le cellule vengono coinvolte.

La trisomia del cromosoma 18 porta il bambino a morire entro i 2 anni, così come quella del

cromosoma 13, a causa delle troppe malformazioni.

Sindrome di Turner

La malattia è causata dalla monosomia dell’X. La sindrome è caratterizzata da bassa statura,

torace largo e mancato sviluppo sessuale.

La frequenza della malattia è 1/10 000 ed il 95-99% degli embrioni 45,X muore prima della

nascita.

L’anomalia è trattabile con cura ormonale.

Questa malattia dimostra come, benché venga utilizzato solo uno dei cromosomi X per cellula,

entrambi siano fondamentali. L’assenza completa di X è sempre letale.

Sindrome di Klinefelter

Gli uomini affetti dalla patologia hanno due cromosomi X e l’Y. Ha un’incidenza di 1/1000.

Il 60% dei casi è dovuto ad una non disgiunzione materna e l’età della madre è un fattore di

rischio importante.

La sindrome è caratterizzata da sintomi che si manifestano solo alla pubertà:

- insufficiente virilizzazione

- testicoli piccoli e duri

- azoospermia

- sterilità

- ginecomastia

- elevata statura

- aumento delle gonadotropine plasmatiche

Sindrome XYY

I maschi affetti presentano statura superiore alla norma, disturbi della personalità e deficit

intellettivo (f=1/1 000). RISCHIO DI ABERRAZIONI CROMOSOMICHE

Dato che le aberrazioni cromosomiche hanno un’incidenza totale di 1:150 nati vivi, non sono

rari gli esami pre e post natali per escludere le malattie.

L’età materna rappresenta il rischio maggiore per le trisomie autosomiche: all’età di 42 anni,

1/3 delle gravidanze è trisomico.

Esami prenatali

Questi esami vengono consigliati a madri di età superiore ai 35 anni e/o con precedente figlio

con aneuploidia, genitori portatori di anomalie cromosomiche bilanciate, a seguito di alterati

valori al tri-test o di evidenza di malformazioni fetali all’ecografia.

- Amniocentesi: un ago viene inserito nell’utero attraverso la parete addominale e

raccoglie una quantità minima di liquido amniotico; il liquido contiene cellule fetali che

possono essere analizzate dal punto di vista biochimico e genetico. Viene fatta dopo la

16° settimana. Costituisce un rischio di infezione per la madre e di un aborto spontanea

nell’1% dei casi

- Prelevo dei villi coriali (CVS): un catetere viene inserito nell’utero e viene prelevato un

campione di tessuto fetale dal corion; le cellule possono essere esaminate. Viene

condotto all’8°-10° settimana di gravidanza. Anche qui i rischi di complicanze per

madre e feto non sono troppo rari

Attualmente si sta tentando di appurare un nuovo metodo di analisi prenatale: si è infatti

scoperta la possibilità di estrazione di cellule fetali all’interno del sangue materno tra la 6° e

la 12° settimana di gravidanza.

Esami postnatali

Consigliati a persone con sospetta o documentata sindrome cromosomica, genitori e familiari

di pazienti con patologia cromosomica, persone con ritardo mentale, coppie con aborti

ripetuti, persone con ritardo di accrescimento, persone con amenorrea primaria (specie se

associata con bassa statura), maschi con oligospermia e azospermia e neonati morti con

malformazioni. GENETICA DI POPOLAZIONE

La genetica di popolazione è la branca della genetica che valuta la frequenza di un allele

nella popolazione. L’insieme delle informazioni genetiche di una popolazione è definito con

POOL/SERBATOIO GENICO.

Per analizzare la struttura genetica delle popolazioni, i genetisti studiano la frequenza allelica

di ogni carattere. Per molte malattie la si conosce già: nella fibrosi cistica ad esempio, 1/20-30

sono portatori del gene.

Le FREQUENZE si distinguono i:

- GENOTIPICHE: proporzione di individui in una popolazione con un certo genotipo per gli

alleli ad un locus

n° di individuicon il genotipo interessato

totale della popolazione

- ALLELICHE: proporzione dei singoli alleli di un locus in una popolazione.

Si indica con p la frequenza dell’allele più frequente e con q quello meno frequente. [P

+ Q = 1] EQUILIBRIO DI HARDY-WEINBERG

Se una popolazione mantiene determinati requisiti, le frequenze alleliche possono essere

calcolate da quelle genotipiche e viceversa.

ESEMPIO (frequenza genica)

A=p e a=q

La probabilità che nasca l’omozigote AA è p^2; la probabilità che

nasca Aa è pq; la probabilità che nasca aa è q^2; le frequenze dei

genotipi sono date da:

2 2 2

( ) =( ) ( )

+q + =1

p p 2 pq+ q

su 1000 individui, p=0.7 e q=0.3 AA=0,49, Aa=0,42, aa= 0,09

 

490AA, 420Aa, 90aa

Condizioni necessarie per cui la legge vale:

- matrimoni casuali (no accoppiamento preferenziale)

- popolazione infinita o molto grande

- assenza di selezione (tutti i genotipi hanno la stessa Cambiamento frequenze

capacità di riprodursi) geniche

- assenza di mutazione o migrazione

Se p e q si mantengono costanti, anche i genotipi non cambiano. Tutti questi eventi ci sono

sempre ed hanno determinato l’evoluzione.

Se le condizioni per l’equilibrio sono mantenute allora le frequenze geniche dei tre genotipi

rimangono invariate da una generazione successiva.

ESEMPIO (conta allelica)

77 AA, 71 Aa e 12 aa.

160persone= 320alleli p= 225/320= 0,703; q=0,296 p^2= 0,49; 2pq=0,348; q^2=

 

0,087

individui: p= 0,49x160=78; 2pq=67; q^2=14. Queste sono le frequenze attese in base alla

legge di H-W, simili agli individui osservati.

TEST DEL CHI QUADRO

Il TEST DEL CHI-QUADRO valuta se quello che si osserva è uguale a quello che ci si attende. Il

test del chi-quadrato indica quindi la probabilità che la differenza tra valori osservati e attesi

sia dovuta al caso.  2

O E

( )

O = n° di individui osservati (dati)

2

E = n° di individui attesi (calcolati)

E

ESEMPIO (non Hardy-Weinberg)

80A e 80a = 0,5 e 0,5 non segue la legge A=p^2, a=q^2 e Aa=2pq

APPLICAZIONI DELLA LEGGE DI HARDY-WEINBERG

La legge è utile alla determinazione delle frequenze alleliche e della frequenza dei portatori

conoscendo la frequenza della malattia.

MALATTIE RECESSIVE

ESEMPI

La fenilchetonuria è una malattia autosomica recessiva la cui frequenza alla nascita è circa

1/10.000

AA=normale; p^2

Aa=normale portatore; 2pq

Aa=affetto; q^2

Frequenza degli individui affetti alla nascita q^2= 1/10000

Frequenza genica del gene deleterio q= 1/100 = 0,01

Frequenza genica del gene normale p= 99/100= 0,99

Frequenza degli individui portatori p 1 2pq 2q = 0,02 (1/50)

 @  @

N.B:

- In popolazioni diverse le frequenze di molte malattie sono diverse

- Il numero degli eterozigoti diminuisce linearmente con il diminuire delle frequenze

geniche, mentre gli omozigoti diminuiscono come il quadrato delle frequenze stesse

MALATTIE X LINKED

Maschi e femmine non sono uguali. Nelle femmine vale quello detto per i caratteri autosomici,

perché hanno 2 cromosomi X. Nei maschi invece c’è solo un cromosoma X, quindi l’allele si

manifesta: nei maschi la frequenza è uguale a quella allelica.

X-Linked Recessiva:

- Frequenza dei maschi affetti ex. (q)= 1/10 000

frequenza femmina portatrici= il doppio dei maschi affetti= 2pq= 1/5000

- Ex: Daltonismo: l’8% dei maschi è daltonico q= 0,08. Nelle femmine la frequenza è

q^2= 0,0064 (0,64%). EVOLUZIONE

L’evoluzione è dovuta al cambiamento delle frequenze geniche in popolazioni sottoposte a

modificazioni geniche diverse. I meccanismi evolutivi sono:

Mutazione, Selezione (+/- frequenza delle variazioni), Migrazione, Deriva genetica

(fluttuazioni casuali).

La mutazione genera nuovi alleli, ma la selezione, la migrazione e la deriva genetica

determinano la frequenza di tali alleli nella popolazione.

SELEZIONE

La selezione è dovuta a fattori ambientali, improvvisi cambiamenti fanno sì che sopravvivano

solo gli organismi con geni con maggior valore adattativo (aumentano la frequenza nel

tempo).

Può avvenire a livello dello zigote (diversa capacità di fecondità e fitness), a livello sessuale

(gli organismi differiscono nel successo di accoppiamento) e gametico (diversi gameti hanno

diverse probabilità di raggiungere la fecondazione).

Fitness

Con fitness si intende la capacità di un genotipo di sopravvivere e riprodursi (fecondità

differenziale) rispetto a quello di controllo. La fitness è contesto-specifica: ogni genotipo è

favorito in un determinato ambiente.

(coefficiente )– (fitness)

S di selezione)=1(totale f

se f=0 s=1 o 100% =gli individui non si riproducono

se f=1 s=0 = non c’è selezione

ESEMPIO 1

Caso dell’emofilia: 200pazienti con 100figli 0,5 figli a testa.

Nel controllo (popolazione normale), su 1000 maschi ho 1500 figli 1,5 figli a testa

F= 0,5 (figli di emofilici) / 1,5 (controllo)= 0,33 gli emofilici hanno il 33% di possibilità di

riproduzione s= 0,66

Gli alleli deleteri permangono nella popolazione anche con una fitness bassa

ESEMPIO 2

In una malattia recessiva all’inizio gli alleli sono

equifrequenti (A=0,5; a=0,5)

Le loro frequenze saranno quindi: fAa=0,5; fAA=0,25;

faa=0,25.

Gli aa alla generazione 0 non si riproducono (fitness

0); alla generazione successiva contribuiscono al pool

genico solo AA ed Aa A=0,66 ed a=0,33.

Alla generazione 2 aa non contribuisce (ha fitness 0) e

quindi la quota diminuisce ancora A=0,75 es

a=0,33.

Via via che si va avanti nelle generazioni, si modifica sempre di meno la frequenza allelica in

quanto è molto piccola e tende quindi a stabilizzarsi.

Q, nelle malattie autosomiche recessive rimane invariato= le malattie ci sono sempre perché

sono rare.

ESEMPIO 3

Un fenotipo dominante ha una fitness pari a 0 e quindi una s=1; AA ed Aa in teoria

dovrebbero sparire.

In realtà, le malattie dominanti esistono perché gli alleli deleteri, che tendono a sparire perché

la fitness è bassa, vengono mantenuti da nuove mutazioni. Le patologie dominanti hanno

maggiore variabilità fenotipica e sono meno gravi, per questo tendono a trasmettersi.

Nel caso dell’acondroplasia, malattia autosomica dominante a penetranza completa e con

frequenza di 10/100000= 0,000106.

I malati, per questioni fisiche e sociali, hanno una fitness=0,2 (hanno 1/5 dei bambini di

individui normali) s=0,8 l’80% dei nani ha genitori normali

 

Le nuove mutazioni bilanciano gli alleli deleteri; si raggiunge l’equilibrio quando il tasso di

selezione che elimina gli alleli deleteri eguaglia il tasso di nuove mutazioni. La frequenza della

malattia diventa stabile nelle popolazioni.

ESEMPIO 4

La Distrofia muscolare di Duchenne (X linked recessiva) ha fitness=0. Tuttavia,

l’incidenza della malattia (1/3650) si mantiene cosante di generazione in generazione.

Qual è la percentuale di pazienti in cui la malattia è dovuta ad una nuova mutazione?

1/3 degli alleli mutati è presente nei maschi e 2/3 nelle femmine (maschi sono q e femmine

2q) fm=0; ff=circa1 dato che i maschi non si riproducono, si perderebbero ad ogni

 

generazione molti alleli e quindi la frequenza di malattia dovrebbe avere un drastico calo;

questo non succede perché la perdita è rimpiazzata da nuove mutazioni.

Dato che la velocità di mutazione deve essere uguale al coefficiente di selezione s ed è uguale

a q/3.

Le mutazioni come la DMD (che danno X linked recessiva o autosomica dominante) hanno

frequenza constante nelle generazioni perché hanno raggiunto l’equilibrio.

I MECCANISMI EVOLUTIVI che spiegano la permanenza delle malattie genetiche (selezione

negativa) sono quindi:

- Equilibrio tra nuova mutazione e selezione negativa

- Deriva genetica

- Polimorfismo bilanciato DERIVA GENETICA

La deriva genetica si nota in malattie in cui l’allele mutante raggiunge frequenze

piuttosto elevate.

Le frequenze risultano diverse in popolazioni diverse; questo perché le fluttuazioni casuali

della frequenza genica in una piccola popolazioni possono portare all’eliminazione di un allele

e quindi alla fissazione dell’allele alternativo.

Esempi:

- Portatori di Tay-Sachs (gamgliosidosi, accumulo lisosomiale e deficit di -esosaminidasi)

tra gli Ebrei Ashkenazi: 1/30; tra i Caucasici:1/170

- Portatori di fenilchetonuria (deficit della fenilialanina idrossilasi) tra gli scozzesi: 1/30;

tra i Finlandesi:1/250

Effetto del fondatore

Un tipo particolare di deriva genetica si ha quando un piccolo gruppo di individui si stacca da

una popolazione.

In un individuo di una grande popolazione è presente una nuova mutazione non

visibile/recessiva (ogni oggetto ha 3 o 4 mutazioni rispetto ai geni dei genitori codificanti per

proteine). Quando il soggetto colonizza un altro continente con altre 3 persone, il suo allele

mutato ha ora frequenza 1/8. Il carattere si espande nella nuova popolazione e si ottengono

etero ed omozigoti per quella malattia.

Un esempio è quello della Porfiria Variegata, una malattia caratterizzata dalla mancanza di

pro-porfirinogeno ossidasi, elevata fotosensibilità, ritardo mentale e nella crescita. In Sud

Africa, la popolazione fu fondata da 20 coppie di colonizzatori olandesi. Probabilmente uno dei

coloni aveva il gene VP e di conseguenza in Sud Africa la frequenza della malattia è di 1/333,

mentre in Olanda è 1/100 000.

Effetto collo di bottiglia

Questo effetto sii ha quando la popolazione è sterminata a seguito di

guerra/epidemia/calamità naturali/carestia… La popolazione che sopravvive ha frequenze

alleliche diverse rispetto all’originale. MIGRAZIONE

Spostamento fisico di geni. Il flusso genico introduce nuovi alleli e cambia le frequenze

geniche nella popolazione.

Le frequenze cambiano quando le popolazioni iniziano a mescolarsi e quindi quando i

matrimoni iniziano ad essere casuali.

POLIMORFISMO BILANCIATO O VANTAGGIO DELL’ETEROZIGOTE

Nell’anemia falciforme, gli omozigoti S/S presentano una forte mortalità infantile; gli

eterozigoti A/S si trovano fino al 40% nelle popolazioni dell’Africa orientale, della Grecia,

dell’India e nel bacino del Mediterraneo. Tale frequenza si può spiegare solo ammettendo un

vantaggio degli eterozigoti.

Infatti, gli eterozigoti hanno una fitness elevata, ma il rischio di avere un bambino recessivo

malato è alto (muoiono perché recessivi; frequenza malattia alta).

L’area di distribuzione coincide con le regioni in cui la malaria è allo stato endemico

che trasmette la malaria è ben adattato a sopravvivere all’interno di globuli rossi

L’agente

normali. Gli eterozigoti hanno globuli rossi inospitali per il parassita e sono dunque resistenti

alla malaria.

Le forze selettive operano sia nel mantenere un allele deleterio, sia nel rimuoverlo.

Cambiando le condizioni ambientali cambiano le frequenze.

Le mutazioni sono il risultato di cambiamenti che avvengono a livello della replicazione del

DNA oppure a seguito di contatto con comporti chimici o fisici.

È possibile la misura della frequenza di mutazione: se una malattia autosomica si presenta in

2/100 000 persone allora avrà frequenza di 2x10^-5; se una malattia X-linked si presenza in

4/100 000 maschi vivi, avrà frequenza 4x10^-5.

I geni hanno frequenza di mutazione differente per la loro grandezza (i geni più grandi sono

colpiti più frequentemente), la loro sequenza nucleotidica e i cambiamenti chimici spontanei.

CARATTERI MULTIFATTORIALI

CARATTERI:

- Continui/quantitativi: altezza, peso, gruppo sanguigno, caratteristiche

comportamentali, IQ, …

- Discontinui/complesse: distribuzione continua del numero di fattori di suscettibilità

(effetto soglia)

Entrambi i tipi di carattere sono dovuti all’interazione fra fattori genetici e fattori ambientali.

I caratteri controllati da due o più geni sono detti poligenici, mentre quelli anche fortemente

influenzati dall’ambiente sono definiti multifattoriali. Per la maggior parte dei caratteri

umani, quelli poligenici sono anche multifattoriali (carattere complesso).

CARATTERI QUANTITATIVI

Per definizione, i caratteri continui sono quantificabili.

Nell’eredità poligenica quantitativa additiva, ogni gene aggiunge qualcosa al fenotipo; l’effetto

di ciascun allele può essere minimo.

ESEMPIO

Se l’altezza fosse determinata solo dal gene, si avrebbe A=0.5 e a=0,5

I geni aggiungono/tolgono 5cm alla statura media AA= 0,5 x 0,5 = 0,25; Aa= 0,5 (2pq);

aa=0,25

se l’altezza fosse codificata da 2 geni con 2 loci, A e B, si avrebbero 5 classi fenotipiche.

Aggiungendo ancora geni, le classi aumentano (3=7 classi) fino ad arrivare ad un totale di

geni per cui la curva di altezza è una curva gaussiana.

Ci sono +200 geni che influiscono sulla statura. Tutti questi geni, in concomitanza con

l’AMBIENTE (cibo, attività sportiva, crescita intrauterina…) danno moltissime classi

fenotipiche. All’aumentare di loci che controllano il carattere aumenta il numero di classi

fenotipiche e diminuisce la differenza tra di esse.

I fattori ambientali danno origine ad una distribuzione continua perché ‘annullano’/smussa le

differenze tra le classi.

Anche il colore della pelle, i valori pressori ed il colore degli occhi sono frutto dell’interazione

tra geni ed ambiente.

Per il fenomeno noto come regressione verso la media, la maggior parte dei figli di

individui con fenotipo estremo ne presenta uno meno estremo rispetto ai genitori.

CARATTERI DISCONTINUI

I caratteri discontinui sono quelli che, oltre ad un certo valore, portano allo sviluppo di una

malattia complessa.

In questo caso non si può misurare un valore, ma i FATTORI DI RISCHIO.

EFFETTO SOGLIA

Le malattie complesse sono controllate da diversi fattori genetici ed ambientali, predisponenti

e predittivi; ognuno di questi contribuisce alla variabilità fenotipica. Quando il numero di

fattori predisponenti raggiunge la soglia, si manifesta la malattia.

Infatti, i fattori genetici sono polimorfismi, che possono o meno alterare di poco la proteina/la

funzione del gene (ex: variante nel promotore).

Avendo essi penetranza bassa (variazioni con scarso effetto fenotipico), per avere la patologia

devo accumulare più mutazioni in geni diversi. Le varianti sono presenti anche nella

popolazione normale, ma non a sufficienza per sviluppare la malattia.

Esempi di malattie multifattoriali:

DIABETE: i fattori genetici sono 300, ma ne bastano una 50ina per avere la malattia; nei

malati c’è una predisposizione

SCLEROSI MULTIPLA

TUMORI Le malattie multifattoriali non segregano nelle

famiglie, ma i famigliari di un paziente malato hanno

rischio più elevato di aver la patologia rispetto ad un

individuo non imparentato.

Se la malattia è manifestata in parenti di

secondo/terzo grado c’è meno rischio di malattia nel

soggetto rispetto alla manifestazione in un parente di

primo grado (genitori, fratelli, figli).

Labioschisi e palatoschisi

Labioschisi e Palatoschisi derivano da un’alterazione dello sviluppo cranio-facciale presente in

1/1000 bambini; possono coesistere o intervenire separatamente. La malattia è dovuta alla

mancata fusione dei processi palatini e labiali entro la 35° settimana di gravidanza.

Ho diversi livelli di malattia, dalla forma meno grave alla più grave: nelle forme meno gravi ho

meno geni/fattori di rischio. La patologia presenza quindi estrema variabilità.

CARATTERISTICHE

- La malattia può ricorrere nelle famiglie, ma non segue un pattern mendeliano

- Il rischio si abbassa all’abbassarsi del grado di parentela

- Il rischio è più elevato in una coppia di consanguinei

- Il rischio aumenta all’aumentare degli affetti in famiglia

- Molte malattie multifattoriali hanno un’incidenza maggiore in uno dei due sessi (nella

sclerosi multipla le femmine 2 e maschi 1; nella celiachia le femmine sono 4 volte in

più; nel lupus i maschi sono 7 volte in più delle femmine)

n.b:

genotipi diversi in individui diversi= varianza genetica

fenotipi diversi in individui con lo stesso genotipo= varianza ambientale

Il rischio è correlato al grado di parentela. Mediamente condividiamo il 50% dei geni con i

fratelli, 50% con i genitori ed i figli. Con zii e nipoti condividiamo ¼ dei geni e con i cugini 1/8.

Nel caso della Labioschisi 0,1 negli estranei (1/1000); in fratelli e figli 4 (x40); in zii e nipoti

0,7 (x7) e in cugini 0,3 (x3). In generale, diminuisce il

rischio man mano che diminuiscono i geni in comune.

Il rischio nei consanguinei aumenta quanto più è grave

la malattia nel probando (quello che per primo viene

all’attenzione del medico).

Ad una famiglia che vuole sapere a priori il rischio di avere un altro figlio affetto bisogna

chiedere delle caratteristiche del primo figlio: n° parenti affetti, gravità, sesso.

STUDIO DELLA MALATTIA

Le malattie derivate da caratteri multifattoriali non si possono determinare con un test

genetico certo; è necessario il riconoscimento dei geni coinvolti + la stima della componente

genetica

STIMA DELLA COMPONENTE GENETICA

L’ereditabilità, valore statistico misurabile, rileva il contributo del genotipo alla variabilità

fenotipica. Più l’ereditabilità sarà alta, più il contributo genetico sarà importante.

Il fattore di ereditabilità viene calcolato in base alle osservazioni fatte su diverse famiglie.

AGGREGAZIONE FAMILIARE:

frequenza della malattia nei fratelli deimalati

s= frequenza della malattia nella popolazione

ex: diabete (multifattoriale) 0,06 / 0,004 = 15 (i fratelli hanno un rischio di 15x rispetto alla

popolazione)

ex: fibrosi cistica (monogenica)  s=500

L’aumento di probabilità così alto nei fratelli è dovuto al fatto che condividono geni e

microambiente.

STUDIO PARENTI ADOTTIVI

Da uno studio è stato evidenziato che i fratelli adottivi di pazienti affetti da Sclerosi Multipla

mantengono il rischio di ammalarsi della popolazione generale (0.1%) e non acquisiscono

quello dei fratelli biologici dei pazienti (2%) l’aggregazione familiare è dovuta alla

condivisione dei geni e non all’ambiente intrafamiliare.

CONCORDANZA TRA GEMELLI MZ E DZ

Per discriminare se un carattere è totalmente genetico oppure è dovuto all’interazione con

l’ambiente, si sfrutta il confronto tra le concordanze tra gemelli mono e dizigoti. Maggiore è la

differenza, maggiore è l’ereditabilità.

- Gemelli concordanti al 100% nei monozigoti e al 50% nei dizigoti carattere

totalmente genetico (ex: fibrosi cistica) ex: 1; 0,5

- Gemelli concordanti al 100% (o quasi) in mono e dizigoti solo ambiente (malattia

infettiva/dovuta ad agente ambientale) ex: 1; 1 oppure 0,8; 0,7

- Gemelli concordanti al 50/60/80% nei monozigoti ed è minore nei dizigoti geni ed

ambiente (ex: QI, malattie carrdiovascolari) ex: 0,8; 0,4

CONFRONTO FREQUENZA IN POPOLAZIONI DIVERSE

Anche le malattie multifattoriali hanno incidenza diversa a seconda dell’area geografica.

Per esempio, il diabete di tipo I ha maggiore incidenza in Sardegna rispetto che al resto

dell’Europa occidentale. I soggetti emigrati in Lazio e Lombardia mantengono comunque la

frequenza: l’ambiente non modifica il rischio conferito dal genoma.

IDENTIFICAZIONE DEI GENI COINVOLTI

Diverse malattie hanno una componente genetica; i problemi nell’identificazione dei geni

sono: mutazioni in molti geni

• mutazioni con scarso effetto fenotipico

• interazione tra i diversi geni (additiva o moltiplicativa)

• eterogeneità dei geni coinvolti in differenti individui

Nell’identificazione è anche importante studiare l’associazione caso-controllo, ovvero il

confronto della frequenza degli alleli dei pazienti e dei controlli.

Ex: fumo – tumore polmone

Ex: ApoE – morbo di Alzheimer

CELIACHIA

Con celiachia si indica un’Intolleranza permanente al glutine, sostanza contenuta in

frumento, orzo e segale, avena e farro.

La malattia ha una prevalenza dallo 0,5 all’1%, ma il valore è in aumento

perché è aumentata la sensibilità delle diagnosi.

La celiachia provoca lesione e degenerazione della mucosa dell’intestino

tenue con aumento dei linfociti intraepiteliali ed atrofia dei villi, che porta a

malassorbimento ed arresto nella crescita. Inoltre, si nota la presenza di Ab

anti-gliadina e anti-endomisio (anti-transglutaminasi).

Togliendo il glutine c’è la completa remissione dei sintomi.

I gradi nella celiachia possono essere assimilati ad un ICEBERG: alla base ci sono gli individui

con predisposizione genetica, ma senza lesioni; più in alto invece quelli con lesioni ma senza

malattia ed infine la punta è composta dai sintomatici.

Il glutine, principale fattore proteico del frumento (8-14%), è dunque il fattore scatenante. È

composto da tante glicoproteine, tra cui la GLIADINA. Quest’ultima, grande circa 5 a.a., è

responsabile al 50% della tossicità nelle persone geneticamente predisposte.

Nella celiachia, il rischio empirico o (0,12/0,01)

s=12

Per quanto riguarda la concordanza nei gemelli, il n° coppie concordanti per la malattia/tot

coppie = 84% in MZ e 12% in DZ. La malattia è causata da geni e ambiente, ma la

componente genetica è forte.

Una buona parte della componente genetica della celiachia ed altre malattie è dovuta ai geni

HLA.

Gli HLA sono 224 geni sul braccio corto del cromosoma 6, divisi in 3 classi, sono lunghi 3

milioni bp. Il 40% degli HLA esprimono proteine coinvolte nella risposta

immunitaria.

Gli HLA di classe I e II codificano per Ag di superficie:

- di classe I: HLA A, B e C. Sono ubiquitari, presentano Ag/peptidi

endogeni (virus e proteine tumorali). Presentano l’Ag ai T citotossici

- di classe II: HLA DR, DP e DQ; presenti sulle cellule B, sui macrofagi e

sulle cellule dendritiche (APC) e presentano peptidi esogeni (batteri).

Sono formati da 2 catene ( e che formano una tasca dove viene

)

esposto l’Ag. Presentano l’Ag ai T Helper

I geni HLA vengono tipizzati nei trapianti per evitare il rigetto; i geni sono altamente

polimorfici e codificano quindi per isoforme simili; ciascuno dei loci ha centinaia di alleli.

La maggiore variabilità si ha nel dominio della tasca dove si lega l’Ag con interazione non

covalente tra residui amminoacidici, in quanto ognuno ha affinità diversa per una stessa

molecola.

Le MHC non distinguono tra una molecola presentata self e non-self, ma fanno scatenare

direttamente la risposta.

Se vengono riconosciute molecole self o non pericolose, si sviluppa la malattia.

La gravità dei sintomi dipende dal numero e dal tipo di molecole HLA. Nella celiachia l’allele 

importante è il dq02, mentre nell’ il dq05: i due si combinano a formare l’eterodimero dq2.

Il dimero è presente nel 90% dei celiaci; e possono essere sullo stesso cromosoma

 

(codificati in cis) o su due cromosomi diversi (codificati in trans).

Il restante 10% dei malati è dq2-, ma possiedono la molecola dq8.

Il 30% degli individui non celiaci presentano dq2, quindi il test di tipizzazione delle HLA è utile

solo come conferma/esclusione in ambito familiare.

Meccanismo:

La celiachia è di fatto una risposta immunitaria aberrante verso il glutine.

Dalla mucosa dei pazienti vengono isolate cellule T che riconoscono una porzione di gliadina

ricca in proline e glutammine presentate dalle molecole HLA-dq2/dq8.


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie (Facoltà di Farmacia, di Medicina e Chirurgia, di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali) (NOVARA)
SSD:

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher ceciliairene96 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica medica e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Piemonte Orientale Amedeo Avogadro - Unipmn o del prof Giordano Mara.

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