Genetica medica

Genetica umana & laboratorio

Introduzione

Il fenotipo di un individuo è dovuto a caratteri:

• Multifattoriali = interazioni tra geni ed ambiente (tumori, sclerosi multipla, QI, diabete, celiachia, ipertensione, obesità)
• Monofattoriali = o ambiente o geni (gruppo sanguigno AB0, Rh, emofilia, fibrosi cistica)

Il gene

Il gene è costituito da introni, esoni (effettivamente codificante e continuamente in evoluzione: se prima ogni esone formava un gene, ora sono una delle unità trascrizionali), 5’URT (untranslated region che regola l’efficienza) prima del primo esone e 3’URT a valle del codone di stop, siti GT e AG utili per lo splicing e molto conservati (una loro mutazione può causare una malattia genetica), promotore e relativi fattori che si legano a determinate sequenze consensus, elementi enhancers per aumentare l’efficienza (interagiscono con fattori del promotore).

Il codice genetico

Il codice genetico, uguale in tutti gli organismi ad eccezione dei mitocondri e dei cloroplasti, è costituito da 4 basi (A, T, C, G) che si appaiano a triplette per creare così 20 a.a. Si dice però che il codice è degenerato, in quanto si hanno più triplette codificanti per lo stesso a.a. (infatti 4³=64 codoni). Al fenomeno è anche legato il vacillamento del tRNA: i codoni per lo stesso a.a. differiscono solo per l’ultima base e si appaiano allo stesso tRNA che non è per tutti perfettamente complementare. AUG= unico per la Metionina sito di inizio della traduzione (zona di lettura= ORF, open reading frame) UAG, UGA, UAA= stop

Nota: Polimorfismo = variante genetica il cui allele meno frequente ha frequenza >1%

Solo il 3/5% del genoma codifica per proteine, il resto è regolatore. Le mutazioni fenotipiche sono avvenute quindi proprio nelle zone codificanti.

Mutazioni puntiformi

Le mutazioni puntiformi possono essere sinonime/nonsense (non cambia a.a.) oppure non sinonime/missense (cambia a.a.). Il secondo caso è solitamente grave, ma non sempre: il colore diverso dei capelli è dovuto ad una mutazione missense; per la verifica della gravità ho banchi dati e test in vitro.

Un grave caso di mutazione nonsense è la frameshift, costituita da uno spostamento della cornice di lettura dovuto alla delezione di un numero di basi non multiplo di 3: le proteine ottenute sono del tutto diverse e solitamente si incontra un codone di stop prematuro.

Come accennato prima, una mutazione possibile è quella di splicing. Questa avviene a livello delle regioni adiacenti a quelle di splicing, quindi nelle sequenze GT/AG sopra citate. Se non vengono riconosciute, si può andare incontro ad esempio a exon skipping, che porta ad una mancanza di un dominio proteico o anche di un frameshift, nel caso in cui l’esone deleto abbia un numero di basi non multiplo di 3. Solitamente queste mutazioni risultano nocive.

Carattere/allele

Il carattere/allele, ovvero la forma alternativa del gene (2 in ogni individuo, ma anche un centinaio di tipi in una popolazione), può avere due forme: una dominante (AA omozigota, o Aa eterozigota) e una recessiva (aa).

Un caso particolare è quello del gruppo sanguigno AB0, scoperto nel 1901 da Landsteiner, che notò che i globuli rossi non agglutinano con il proprio siero e con pochi altri di altri individui; il siero contiene gli anticorpi, mentre i globuli gli antigeni. Il gruppo A avrà quindi per esempio solo antigeni A e anticorpi anti-B, il B antigeni B e anticorpi anti-A, l’AB entrambi gli antigeni (riceventi universali) e gli 0 sono senza antigeni (donatori universali, perché senza antigeni non può avvenire l’agglutinazione del siero); diversa risposta a sieri = diverso fenotipo.

Nel microbiota ho sostanze simili a quelle dei globuli rossi.

Esaminare il fenotipo

• Aspetto esterno (livello clinico)
• Prodotto codificato dal gene (prodotti primari)
• Prodotti biochimici del metabolismo (prodotti secondari; ex: gruppo sanguigno)

Emoglobinopatie

Patologie che riguardano l’emoglobina, ovvero il tetramero 2α2β nei globuli rossi con un gruppo eme per legare il Fe²⁺ in ogni catena che lega poi l’O₂. Un esempio di queste malattie è l’anemia falciforme, una malattia recessiva dovuta ad una mutazione missense (Glu con carica negativa diventa Val neutra) che porta ad avere una diversa conformazione tridimensionale della proteina. I globuli rossi risultano a falce perché l’emoglobina forma polimeri rigidi all’interno e i globuli risultano meno deformabili; tutto ciò porta all’ostruzione dei vasi e necrosi dei tessuti.

Per la diagnosi è sufficiente uno striscio di sangue osservato al microscopio ottico, oppure un’elettroforesi delle proteine del sangue (la proteina malata SS ha picchi differenti rispetto alle situazioni normali AA o AS).

Ripasso di mitosi e meiosi

Il genoma umano è costituito da:

• Genoma nucleare: 3300Mb (3x10⁹ bp, 3 miliardi bp) e 20000 geni
• Genoma mitocondriale: 16,6Kb (16600bp) e 37 geni

Il cromosoma è costituito da 2 braccia (lungo e corto), un centromero (restrizione 1°; in alcuni ho anche la 2° al di là della quale si trovano DNA satellite per ribosomi) e telomeri alle estremità. Questa particolare forma del genoma è visibile unicamente in cellule in divisione: il DNA si accorcia di circa 9000 volte per l’esigenza meccanica. I cromosomi sono meta/submeta/acrocentrici a seconda della posizione del centromero.

Mitosi

La fase di divisione cellulare fa parte del ciclo cellulare, costituito da interfase (G0 – quiescenza-, G1 – sintesi proteine istoniche-, S – replicazione del cromosoma, che diventa a 2 braccia-, G2 – sintesi di altre proteine-) e dalla mitosi.

In particolare, la mitosi porta ad ottenere 2 cellule figlie diploidi da una madre diploide. Mentre la divisione del citoplasma può essere ineguale, quella dei cromosomi deve essere esatta. La mitosi è costituita da diverse fasi:

• Profase: il DNA e le proteine istoniche si condensano ed i cromosomi risultano distinguibili; la membrana nucleare si disgrega; si formano i centrioli (centrosoma, 9 gruppi da 3 tubuli) e le fibre del fuso (proteine).
• Metafase: i cromosomi si allineano sul piano equatoriale (46 cromosomi, 92 cromatidi).
• Anafase: le fibre del fuso trascinano i cromosomi verso i centrioli ai lati opposti della cellula (i cromosomi si agganciano attraverso il cinetocore, una struttura proteica nel centromero costituito da tubuli). I cromatidi si dividono: ogni cromatide diventa cromosoma ed un assetto completo di cromosomi è posizionato ad ognuno dei due poli della cellula.
• Telofase: riformazione della membrana e dei nuclei; citochinesi, che inizia con una strozzatura detta solco di clivaggio all’equatore della cellula.

Difetti alla mitosi possono portare a patologie anche molto gravi come la sindrome di Roberts (mancato sviluppo degli arti), la progeria (invecchiamento precoce per mutazione puntiforme del gene della laminina A – proteina nucleare che se mutata non rigenera la membrana nucleare-; 130 casi al mondo e morte intorno ai 15 anni).

Le cellule di midollo osseo e pelle si dividono in continuazione, mentre i muscoli si bloccano in G0 senza più crescere. Le cellule che sfuggono al controllo della mitosi e si dividono in maniera incontrollata formano tumori.

In laboratorio le cellule hanno un limite di divisioni detto di Hayflick, raggiunto il quale smettono di dividersi e muoiono: mentre le cellule embrionali hanno un limite di 50 divisioni, quelle umane possono dividersi solo 10/30 volte.

Meiosi

Con la meiosi, necessaria per la produzione di cellule germinali, si ottengono 4 cellule aploidi da una madre diploide. La meiosi consta di due passaggi: la meiosi I (divisione riduzionale, che porta alla separazione dei 2 cromosomi omologhi – madre e padre) e la meiosi II (divisione equazionale, modifica il numero dei cromatidi, ma non dei cromosomi).

La meiosi I riduce il numero di cromosomi (si separano i cromosomi omologhi, ognuno dei quali è dicromatidico), mentre la meiosi II divide i cromatidi fratelli (23 cromosomi costituiti da 46 cromatidi i cromatidi si separano).

Il processo di divisione è uguale a quello di mitosi, ma qui ho delle caratteristiche particolari:

• Il cromosoma Y viene trasmesso intatto.
• Ho presenza di tetrade = 4 cromatidi.
• In profase I avvengono 3-4 crossing over per ogni cromosoma.

Nota: una cellula da 46 cromosomi può dare 8 milioni di gameti; gli aploidi invece 2²³+crossing over.

La meiosi maschile differisce parecchio de quella femminile.

Meiosi maschile vs femminile

Eredità autosomica

Non è legata a X e Y.

Dominante

A = dominante malato; a = recessivo sano

Solitamente i malati dominanti sono eterozigoti, perché per avere omozigosi, i genitori dovrebbero essere entrambi malati e tante volte risulta letale.

• La mutazione è visibile in tutte le generazioni (trasmissione verticale).
• Gli uomini e le donne hanno le stesse probabilità di mutazione.
• I figli di un malato hanno il 50% di probabilità di ereditare la malattia (con un genitore omozigote invece la probabilità è 100%).
• Caso di acquisizione di funzione.

Esempi:

• Capelli lanosi
• Sindrome di Marfan: colpisce il sistema scheletrico (alti e magri), gli occhi (miopia e difetti nel cristallino) ed il sistema cardiovascolare (aneurisma e rottura dell’aorta)
• Acondroplasia: nanismo disarmonico che porta ad un accorciamento degli arti e dismorfismi facciali. 1/2500 nati vivi sono Aa, per cui due malati che si sposano hanno il 75% di avere un figlio malato. È causata da una mutazione missense del gene FGFR3 sul cromosoma 4, il recettore del fattore di crescita dei fibroblasti che si trova nei condrociti delle placche della crescita delle ossa lunghe (da G a C da Gly ad Arg Gly380Arg; la proteina dimerizza e regola negativamente la proliferazione costitutiva dei condrociti).
• Aploinsufficienza: l’allele sano non è sufficiente in eterozigosi per garantire il fenotipo normale e si ha così ipercolesterolemia familiare. Il colesterolo è legato a LDL (trasportano dal fegato e se troppe formano delle placche arteriosclerotiche che portano ad un maggior rischio di ictus ed infarto) e HDL (porta al fegato per la metabolizzazione); in questa malattia in eterozigosi non sono sufficienti i recettori per gli LDL (endocitosi) sani (il 50%) per garantire un fenotipo normale. Gli eterozigoti sono il 5% delle persone con colesterolo alto (l’hanno sopra 400; 1/500); gli omozigoti sono un un milione ed il loro livello di colesterolo è 600/1000, cosa che porta all’infarto prima dei 20 anni. Nei malati sono anche visibili xantomi sulla pelle dovuti all’accumulo di LDL. La mutazione colpisce il gene in diversi punti, ogni famiglia ne ha un tipo (mut. privata): si tratta di un caso di eterogeneità allelica. I punti più frequentemente mutati sono detti Hotspot di Mutazione. Ogni mutazione genera un diverso grado di gravità della malattia (alleli null= comparsa codoni stop; alleli trasporto carente= mutano in legame p-l).

Recessiva

Molto rare, colpiscono l’allele recessivo Aa/AA=sano; aa=malato

Come per il caso delle talassemie in Sardegna, i genitori dei malati sono di solito portatori sani, che avranno figli malati per il 25% dei casi, portatori sani nel 50% e omozigoti normali nel 25%.

• La trasmissione è di tipo orizzontale, ovvero non si nota in ogni generazione.
• Tutti i figli di genitori affetti presentano il carattere.
• Il carattere si manifesta in eguale proporzione nei sessi.

Esempi:

• Albinismo
• Fenilchetonuria: accumulo eccessivo di fenilalanina nel sangue; ritardo mentale
• Anemia falciforme
• Fibrosi Cistica: malattia grave che porta alla morte tra i 10 e i 20 anni causata da una mutazione su un gene del cromosoma 7 formato da 27 esoni che codifica per un trasportatore transmembrana per gli ioni Na⁺ e Cl^- (garantiscono la giusta idratazione). In caso di eterozigosi composta, gli alleli hanno mutazioni diverse, mentre in omozigosi, le mutazioni sono identiche in entrambi gli alleli. La mutazione porta ad una Loss of Function, che provoca un muco denso che tende ad ostruire ed a causare infezioni batteriche. Negli eterozigoti, il 50% di proteina sana è sufficiente a garantire il fenotipo normale.

Nota bene: nei matrimoni consanguinei c’è più probabilità di avere un figlio malato perché la mutazione è uguale in entrambi i genitori, in quanto discendono dagli stessi antenati. Incrociando due portatori con uguale mutazione c’è più probabilità che il figlio sia malato (la diploidia protegge dalla mutazione).

Malattie X & Y linked

X linked

I geni mutati si trovano sul cromosoma X (160 milioni bp), in cui sono localizzati geni con la stessa funzione per entrambi i sessi (non determinanti il sesso, a differenza di alcuni geni su Y). Inoltre, su X e Y si notano regioni pseudoautosomiche, ovvero presentanti geni uguali su entrambi i cromosomi; le aree sono dette PAR1 (braccia corte) e PAR2 (braccia lunghe) e sono necessarie per l’appaiamento di X e Y durante la divisione cellulare.

Nota bene: corredi cromosomici possibili= 46XX, 46XY (basta un Y per determinare il sesso maschile, grazie alla regione SRY che induce il differenziamento delle gonadi primordiali in testicoli. Le femmine XY hanno una mutazione o delezione del gene SRY); anaeuploidie: XXX (sindrome da triplo X); XX...Y (47XXY = sindrome di Klinefelter), 45X (sindrome di Turner), XYY...

X-linked recessiva

La femmina può essere eterozigote per i geni su X, in quanto ne ha due, mentre il maschio è sempre emizigote. Per questo motivo, le malattie X-linked recessive colpiscono per la maggior parte i maschi.

• La femmina è malata solo se il padre è malato e la madre è portatrice, oppure se è affetta da sindrome di Turner (45,X0; al 50% sono portatrici). I maschi possono ereditare il gene da madri portatrici nel 50% dei casi.
• Tutte le figlie femmine di un maschio malato sono portatrici, mentre tutti i figli maschi di un maschio malato sono sani (trasmette Y).
• La trasmissione è verticale.

Affetti le femmine omozigoti ed i maschi emizigoti.

Esempi:

• Emofilia: difetto del fattore VIII della coagulazione (non funzionante; morte per dissanguamento a seguito di qualsiasi ferita).
• Daltonismo: mutazione di geni per la modificazione del pigmento.
• Distrofia muscolare di Duchenne: degenerazione del tessuto muscolare già dai 3/5 anni; mutazione nel gene della distrofina (Xp21, il più grande del genoma; sostegno). La forma più blanda è la DM di Becker.
• Retinus Pigmentosus
• Sindrome di Lesch-Nyhan: mancanza di una trasferasi; ritardo mentale, auto-mutilazioni e morte precoce.

X-linked dominante

• La femmina eterozigote è malata e trasmetterà il carattere al 50% dei figli indipendentemente dal sesso.
• Il maschio che manifesta la malattia genera figlie femmine tutte malate, ma non trasmette ai figli maschi.
• 50% femmine e 50% maschi sono malati, ma in genere le femmine sono il doppio dei maschi.

Nota bene: Xq13 = posizione 13, braccio lungo, cromosoma X; Xp13 = posizione 13, braccio corto, cromosoma X.

Y linked

Viene ereditata da maschio a maschio. Sul cromosoma Y si trovano geni caratteristici per il sesso, come la motilità e lo sviluppo dello spermatozoo. Tuttora sono stati identificati poco più di 30 caratteri legati ad Y.

Esempi:

• Orecchio peloso
• Infertilità
• Azospermia: pochi spermatozoi se il gene viene deleto.

Dosaggio genico

Le femmine, avendo 2 cromosomi X, ne esprimono solo il 50% (1 dei 2) rispetto ai maschi che ne esprimono il 100% (solo 1X): così facendo la quantità di caratteri espressi è uguale. Il processo può avvenire in modo diverso:

• Iperattivazione X maschile
• Ipoattivazione nella femmina
• Inattivazione/laionizzazione di uno dei cromosomi X della femmina (anche detta Ipotesi di Mary-Lion, la scopritrice)

Nella laionizzazione, l’inattivazione avviene in maniera casuale nelle cellule della blastocisti, che dividendosi daranno cellule figlie con il medesimo silenziamento. Il cromosoma inattivato è visibile al microscopio ottico.