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CORREZIONE DEL FILAMENTO

La prima correzione è eseguita dalla DNA Polimerasi e avviene appena prima dell’aggiunta di un

nuovo nucleotide. Il nucleotide corretto ha una maggiore affinità per la polimerasi in movimento del

nucleotide non corretto, poichè soltanto quello corretto può appaiarsi correttamente con lo stampo.

Un nucleotide non corretto ha una maggior possibilità di dissociarsi durante il passaggio di un

nucleotide corretto. Ciò permette alla polimerasi di controllare l’esatta geometria di appaiamento

delle basi. Questa correzione è detta attività esonucleasica. Le polimerasi trattano un filamento male

appaiato in un sito catalitico a parte, tagliando qualsiasi residuo non appaiato in direzione 3’-5’.

DNA PRIMASI E RNA PRIMER

Per un filamento guida è necessario un primer speciale all’inizio della replicazione. Sulla forcella la

DNA polimerasi ha sempre a disposizione un’estremità della catena alla quale aggiungere

nucleotidi. Sul filamento ritardato, ogni volta che la DNA Polimerasi completa un frammento deve

sintetizzare un frammento completamente nuovo in un sito più a valle. é richiesto un filamento

primer (RNA primer) sintetizzato dalla DNA Primasi. Gli RNA primer sono sintetizzati ad

intervalli di 200 nucleotidi sul filamento ritardato. Ogni primer è lungo 10 nucleotidi. Ogni primer è

eliminato da uno speciale enzima di riparazione che riconosce il filamento di RNA in un elica di

DNA e lo elimina, e la DNA ligasi unisce i frammenti di Oakazaki.

Perchè la sintesi di DNA proceda, la doppia elica di DNA deve essere aperta davanti alla forcella di

replicazione in modo che ci sia la possibilità di unire nuovi deossiribonucleotidi. Ciò viene svolto

dalla DNA elicasi che si intercala nel DNA e, tramite l’idrolisi di ATP, si muove lungo esso,

aprendo l’elica. 8

Le proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSB) si legano cooperativamente ai filamenti di

DNA senza coprire le basi, aiutando l’elicasi a stabilizzare la conformazione svolta a singolo

filamento e impendendo che il filamento formi eliche a forcina.

PINZA PROTEICA

La tendenza a dissociarsi rapidamente da una molecola di DNA permette a una DNA polimerasi che

ha appena finito di sintetizzare un frammento di essere riciclata, per poter iniziare la sintesi del

frammento successivo. La DNA polimerasi viene lasciata attaccata al DNA tramite una pinza

proteica e viene solo liberata quando la polimerasi incontra la doppia elica.

La pinza ha la forma di un grosso anello intorno all’elica di DNA. Un lato dell’anello si lega alla

parte posteriore della DNA polimerasi e l’intero anello scorre lungo il DNA mentre la DNA

polimerasi si muove.

Il suo assemblaggio richiede idrolisi di ATP da parte del caricatore della pinza. Sul filamento

ritardato, ogni volta che la polimerasi incontra l’estremità 5’ del frammento precendente, viene

rilasciata, e la polimerasi si associa ad un’altra pinza. 9

SCHEMA RIASSUNTIVO DELLA REPLICAZIONE DEL DNA 17/10/05

BOLLA DI REPLICAZIONE

Le posizioni in cui l’elica di DNA viene aperta per la prima volta sono le origini di replicazione.

Nelle loro vicinanze si forma una bolla di replicazione, dove si legano le proteine iniziatrici. Le

origini di replicazione studiate nei batteri hanno dimostrato di avere zone contenenti Adenina e

Timina, più facili da staccare perchè ci sono meno legami a idrogeno.

Per il DNA eucariotico è necessaria almeno una replicazione per ogni cromosoma. Esistono perciò

delle forcelle di replicazione per ogni cromosoma (10000-20000 origini di replicazione per ogni

cromosoma). 10

DNA TOPOISOMERASI

Oltre alle DNA polimerasi ci sono le Topoisomerasi. Esse legano il DNA è svolgono gli

aggrovigliamenti del DNA. Può essere vista come una nucleasi reversibile che si attacca all’ossatura

di fosfato di DNA, rompendo un legame fosfodiestere in un filamento.

La Topoisomerasi I produce una rottura su un singolo filamento, permettendo alle due sezioni

dell’elica di ruotare attorno al legame fosfodiestere. 11

La Topoisomerasi II forma un legame covalente con entrambi i filamenti. Questa è attivata da siti

su cromosomi quando le due doppie eliche si incrociano:

1- Rompe reversibilmente la doppia elica per creare un passaggio di DNA

2- Fa passare la seconda doppia elica vicina attraverso la rottura

3- Risalda la rottura e si dissocia dal DNA.

TELOMERASI

Poichè le DNA polimerasi polimerizzano DNA solo nella direzione 5’-3’, la sintesi del filamento

ritardato a livello di una forcella deve avvenire discontinuamente, tramite un meccanismo di

cucitura all’indietro che produce brevi filamenti di DNA. Quando la forcella raggiunge l’estremità

di un cromosoma lineare, non c’è posto per produrre l’RNA primer necessario per iniziare l’ultimo

frammento di Oakazaki sulla punta della molecola. Gli eucarioti hanno sequenze nucleotidiche

speciali alle estremità dei loro cromosomi, che sono incorporate in telomeri e attraggono un enzima

chiamato telomerasi. Le sequenze di DNA telomerico sono molte ripetizioni in tandem di una breve

sequenza GGGTTA e si estende per 10000 nucleotidi. La telomerasi sintetizza una nuova copia

della ripetizione, usando uno stampo di RNA che è componente dello stesso enzima, mentre la

DNA polimerasi sintetizza il filamento complementare.

Il meccanismo descritto assicura che l’estremità 3’ del DNA sia più lunga della 5’ con la quale è

appaiata, lasciando un’estremità sporgente, che forma un’ansa all’indietro, per infilare il suo

terminale nel doppio DNA della sequenza telomerica ripetuta. Questa assicura la protezione dagli

enzimi di degradazione RIPARAZIONE DEL DNA

Insieme di meccanismi che permettono alle cellule di mantenere il DNA nella sua corretta struttura.

Intervengono degli enzimi di riparazione. Solo 1 su 10000 nucleotidi può essere sbagliato e la

9

frequenza di mutazione è molto rara: 1 su 10 nucleotidi.

Il DNA subisce cambiamenti importanti in seguito a fluttuazioni termiche, per esempio 5000 basi

puriniche (A eG) vengono perse ogni giorno perchè vanno incontro a depurinazione spontanea, cioè

i legami N-glicosilici si idrolizzano. 100 basi di C e U vanno invece incontro a deamminazione

spontanea. Le radiazioni ultraviolette del sole possono produrre un legame covalente fra due

pirimidine adiacenti nel DNA a formare, per esempio, dimeri di timina. Se questi cambiamenti non

12

venissero corretti, ci sarebbe la delezione di una o più basi, o una loro sostituzione. Le lesioni a cui

può andare incontro il DNA sono:

- Delezione della base

- Alterazione della base = quando c’è una base scorretta

- Inserzione di un nucleotide

- Legami fra pirimidine

- Tagli ai singoli o doppi legami

- Deamminazioni = i gruppi amminici vengono sostituiti o rimossi

- Metilazioni = aggiunta di gruppi metilici

- Depurinazioni = dovuta a temperature elevate

Esistono vie multiple per la riparazione del DNA, che usano enzimi diversi che agiscono su tipi

diversi di lesioni

ESCISSIONE DELLE BASI

Le DNA glicosilasi scorrono lungo il DNA e possono riconoscere un tipo specifico di basi alterate e

catalizzarne la rimozione idrolitica.

L’AP endonucleasi riconosce lo zucchero privo della base creato e taglia l’ossatura fosfodiestere e

la DNA elicasi e polimerasi ripristinano la giusta sequenza. 13

ESCISSIONE DEI NUCLEOTIDI

Può riparare il danno causato da qualsiasi grosso cambiamento nella struttura della doppia elica del

DNA. Un complesso multienzimatico scansiona il DNA cercando una distorsione della doppia

elica. L’ossatura fosfodiestere del filamento anormale viene tagliata su entrambi i lati della

distorsione e un oligonucleotide viene eliminato da una DNA elicasi. La grossa interruzione viene

poi riparata dalla DNA polimerasi e dalla DNA ligasi . 18/10/05

STRUTTURA E SEQUENZIAMENTO DEL DNA

Il genoma è l’insieme delle informazioni genetiche contenute nel DNA. Solo il 2-5% del DNA è

costituito da geni (esoni) che codificano le proteine. Ci sono poi altre sequenze ripetute o uniche

che non hanno nessuna informazione genetica.

Il gene è l’unità fondamentale che si occupa di portare le informazioni per formare la proteine o tipi

di RNA.

Il gene contiene una sequenza regolatrice, indispensabile per il corretto funzionamento del gene,

responsabile dell’espressione di un gene al livello e al momento appropriato e nel tipi appropriato di

cellula. Questa può trovarsi davanti o dietro o in mezzo al gene. Ci sono poi zone di DNA non

codificante che interrompono i tratti di DNA codificante (esoni) e sono gli introni. 14

GENOMA UMANO 3000 Mb

1- Geni e sequenze associate 900 Mb

- Non codificante 810 Mb

- Introni

- Regioni di controllo

- Pseudogeni

- Codificante (esoni) 90 Mb

2- DNA extragenico 2100 Mb

- DNA unico e a basso numero di copie 1680 Mb

- DNA ripetitivo 420 Mb

- In tandem

- Microsatelliti

- Minisatelliti

- Satelliti

- Disperso

- SINE

- LINE

- Retroposomi

Pseudogeni: Sono sequenze che assomigliano a dei geni, ma che non hanno valore genico. Sono

originati spesso dalla duplicazione genica. Sono importanti per l’evoluzione genica. Sono i più

bersagliati dalle mutazioni e non danno alcun effetto e, più vengono mutati, più la loro identità si

allontana a quella dei geni.

Il DNA ripetitivo è costituito da sequenze che danno una certa plasticità al genoma stesso. Le

sequenze ripetute disperse si distinguono solo dalla sequenza nucleotidica:

- Satelliti: nel DNA centromerico. (da 5 a 200 nucleotidi)

- Minisatelliti: (DNA telomerico,) fino a 5 nucleotidi

- Microsatelliti: Fino a 4 nucleotidi.

Famiglia di geni = Insieme di geni duplicati che codificano proteine con sequenze amminoacidiche

simili ma non uguali.

DUPLICAZIONE GENICA E RICOMBINAZIONE GENICA

L’organizzazione del genoma eucariotico in esoni e introni, rende molto più semplice l’evoluzione

di nuove proteine, in seguito a ricombinazione genica. La complessità delle specie non dipende dal

numero di geni ma da come sono controllati. RNA

Il DNA nei genomi non dirige la sintesi di proteine da solo, ma usa invece RNA come molecola

intermedia. Quando la cellula ha bisogno di una particolare proteina, la sequenza nucleotidica

codificante quella proteina viene prima copiata in RNA (Trascrizione) e successivamente l’RNA

viene usato come stampo per la sintesi delle proteine (Traduzione).

Il primo passaggio della lettura di una parte necessaria delle istruzioni genetiche di una cellula, è

quello di copiare una porzione particolare della sequenza del suo DNA – un gene – in una sequenza

di RNA.

L’RNA è simile al DNA, a parte l’avere un ribosio al posto del deossiribosio e un Uracile al posto

della Timina.

La sintesi avviene sempre nella direzione 5’-3’. 15

Si hanno tre tipi di RNA:

1- mRNA: comprende le informazioni per specificare le proteine. Trasporta le informazioni

genetiche copiate dal DNA ( sono instabili e durano pochi secondi nei procarioti e qualche ora negli

eucarioti, poichè non ha molte strutture secondarie che lo preservano dalla distruzione).

2- rRNA: Si unisce ad una serie di proteine per formare i ribosomi.

3- tRNA: Molecola principale che serve per decifrare le informazioni del mRNA; inoltre serve oer

far avvenire la sintesi delle proteine.

Gli enzimi che eseguono la trascrizione sono le RNA polimerasi.

Catalizza la formazione di legami fosfodiestere che uniscono nucleotidi per formare una catena

lineare. L’RNA polimerasi si muove un passo alla volta lungo il DNA, svolgendo l’elica davanti al

suo sito attivo per esporre una regione di filamento stampo per l’accoppiamento complementare. I

substrati sono nucleotidi trifosfato (ATP, CTP, GTP e TTP). Il rilascio quasi immediato del RNA

dal DNA durante la sintesi significa che molte copie di RNA possono essere prodotte da un singolo

gene. TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI

Per trascrivere correttamente un gene, l’RNA polimerasi deve riconoscere dove iniziare questo

processo. Nei batteri, un fattore sigma si lega al promotore, sequenza speciale di nucleotidi che

indica il punto di partenza per la trascrizione, del DNA e attiva la RNA polimerasi, che inizia a

trascrivere il DNA in mRNA.

Per terminare la sintesi, si deve avere invece un terminatore, con basi di A e T, che ripiegano

l’RNA a forcina, che forza l’apertura della RNA polimerasi. 16

TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

Nell’uomo esistono tre tipi di RNA polimerasi.

RNA polimerasi I = trascrive i geni per gli rRNA

RNA polimerasi II = trascrive tutti gli mRNA e alcuni dei piccoli RNA nucleari che partecipano

allo splicing del mRNA.

RNA polimerasi III = trascrive gli rRNA 55 e diversi RNA relativamente corti e stabili.

Le RNA polimerasi eucariotiche richiedono dei fattori generali di trascrizione, che devono

assemblarsi al promotore con la polimerasi prima dell’inizio della trascrizione.

Per l’uomo, il promotore, è costituito da una sequenza consenso di A e T, chiamata TATA Box ed è

a 25 nucleotidi dall’inizio della trascrizione. Quando la RNA polimerasi deve riconoscere la TATA

box, vede l’associazione dei fattori di trascrizione e si chiude sul DNA:

1- TFIID si lega alla TATA box, tramite la subunità TBP (TATA binding protein) del DNA a

doppia elica.

2- Successivamente di attaccano TFIIA e TFIIB, poi TFIIE e RFIIH, formando il complesso di

inizio della trascrizione, insieme alla RNA polimerasi.

3- TFIIH fosforila la coda CTD (C Terminal Domain) della RNA polimerasi. I fattori di

trascrizione si staccano e la trascrizione ha inizio. 17

MATURAZIONE DEL RNA CON I PROCESSING

La trascrizione è solo il primo passaggio di una serie di reazioni che comprende la modificazione

covalente di entrambe le estremità dell’RNA e la rimozione delle sequenze introniche, tramite

splicing.

Le modificazioni alle estremità sono il capping al 5’ e la poliadenilazione al 3’

Inoltre negli eucarioti, la traduzione non è associata alla trascrizione, e viene svolta all’esterno del

nucleo.

Quando si è parlato della CTD, essa ha una serie di fattori che permettono ai processing (capping,

poliadenilazione) di avvenire. 18

CAPPUCCIO AL 5’

Non appena la polimerasi ha prodotto circa 25 nucleotidi, l’estremità 5’ è modifciata per l’aggiunta

di un cappuccio costituito da un nucleotide guanidilico modificato:

- fosfatasi = rimuove il fosfato dall’estremità 5’ dell’RNA.

- guanil trasferasi = aggiunge un GMP in legame inverso (5’ a 5’ invece di 5’ a 3’)

- metil trasferasi = aggiunge un metile alla guanosina.

Il cappuccio riconosce le posizioni 5’ e protegge il trascritto primario dalla degradazione enzimatica

svolta dalle nucleasi. CODA AL 3’

Mediante la poliadenilpolimerasi (poli-A polimerasi o PAP), si ha un’aggiunta di molte adenine

all’estremità terminale dell’RNA immaturo.

La coda serve ad:

- Identificare la vecchiaia dell’RNA, poichè mano a mano che il tempo passa, le nucleasi tendono a

- degradare la molecola togliendo le adenine. Gli mRNA più vecchi avranno quindi meno adenine

rispetto ai nuovi.

- Aiuta l’esportazione del mRNA dal nucleo al citosol

- Stabilizza l’mRNA

- Ruolo di sintesi proteica 19


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AUTORE

flaviael

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DETTAGLI
Corso di laurea: medicina e chirurgia
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher flaviael di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Genetica generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Turco Emilia.

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