Genetica generale - Appunti

ESCISSIONE DEI NUCLEOTIDI

Può riparare il danno causato da qualsiasi grosso cambiamento nella struttura della doppia elica del

DNA. Un complesso multienzimatico scansiona il DNA cercando una distorsione della doppia

elica. L’ossatura fosfodiestere del filamento anormale viene tagliata su entrambi i lati della

distorsione e un oligonucleotide viene eliminato da una DNA elicasi. La grossa interruzione viene

poi riparata dalla DNA polimerasi e dalla DNA ligasi . 18/10/05

STRUTTURA E SEQUENZIAMENTO DEL DNA

Il genoma è l’insieme delle informazioni genetiche contenute nel DNA. Solo il 2-5% del DNA è

costituito da geni (esoni) che codificano le proteine. Ci sono poi altre sequenze ripetute o uniche

che non hanno nessuna informazione genetica.

Il gene è l’unità fondamentale che si occupa di portare le informazioni per formare la proteine o tipi

di RNA.

Il gene contiene una sequenza regolatrice, indispensabile per il corretto funzionamento del gene,

responsabile dell’espressione di un gene al livello e al momento appropriato e nel tipi appropriato di

cellula. Questa può trovarsi davanti o dietro o in mezzo al gene. Ci sono poi zone di DNA non

codificante che interrompono i tratti di DNA codificante (esoni) e sono gli introni. 14

GENOMA UMANO 3000 Mb

1- Geni e sequenze associate 900 Mb

- Non codificante 810 Mb

- Introni

- Regioni di controllo

- Pseudogeni

- Codificante (esoni) 90 Mb

2- DNA extragenico 2100 Mb

- DNA unico e a basso numero di copie 1680 Mb

- DNA ripetitivo 420 Mb

- In tandem

- Microsatelliti

- Minisatelliti

- Satelliti

- Disperso

- SINE

- LINE

- Retroposomi

Pseudogeni: Sono sequenze che assomigliano a dei geni, ma che non hanno valore genico. Sono

originati spesso dalla duplicazione genica. Sono importanti per l’evoluzione genica. Sono i più

bersagliati dalle mutazioni e non danno alcun effetto e, più vengono mutati, più la loro identità si

allontana a quella dei geni.

Il DNA ripetitivo è costituito da sequenze che danno una certa plasticità al genoma stesso. Le

sequenze ripetute disperse si distinguono solo dalla sequenza nucleotidica:

- Satelliti: nel DNA centromerico. (da 5 a 200 nucleotidi)

- Minisatelliti: (DNA telomerico,) fino a 5 nucleotidi

- Microsatelliti: Fino a 4 nucleotidi.

Famiglia di geni = Insieme di geni duplicati che codificano proteine con sequenze amminoacidiche

simili ma non uguali.

DUPLICAZIONE GENICA E RICOMBINAZIONE GENICA

L’organizzazione del genoma eucariotico in esoni e introni, rende molto più semplice l’evoluzione

di nuove proteine, in seguito a ricombinazione genica. La complessità delle specie non dipende dal

numero di geni ma da come sono controllati. RNA

Il DNA nei genomi non dirige la sintesi di proteine da solo, ma usa invece RNA come molecola

intermedia. Quando la cellula ha bisogno di una particolare proteina, la sequenza nucleotidica

codificante quella proteina viene prima copiata in RNA (Trascrizione) e successivamente l’RNA

viene usato come stampo per la sintesi delle proteine (Traduzione).

Il primo passaggio della lettura di una parte necessaria delle istruzioni genetiche di una cellula, è

quello di copiare una porzione particolare della sequenza del suo DNA – un gene – in una sequenza

di RNA.

L’RNA è simile al DNA, a parte l’avere un ribosio al posto del deossiribosio e un Uracile al posto

della Timina.

La sintesi avviene sempre nella direzione 5’-3’. 15

Si hanno tre tipi di RNA:

1- mRNA: comprende le informazioni per specificare le proteine. Trasporta le informazioni

genetiche copiate dal DNA ( sono instabili e durano pochi secondi nei procarioti e qualche ora negli

eucarioti, poichè non ha molte strutture secondarie che lo preservano dalla distruzione).

2- rRNA: Si unisce ad una serie di proteine per formare i ribosomi.

3- tRNA: Molecola principale che serve per decifrare le informazioni del mRNA; inoltre serve oer

far avvenire la sintesi delle proteine.

Gli enzimi che eseguono la trascrizione sono le RNA polimerasi.

Catalizza la formazione di legami fosfodiestere che uniscono nucleotidi per formare una catena

lineare. L’RNA polimerasi si muove un passo alla volta lungo il DNA, svolgendo l’elica davanti al

suo sito attivo per esporre una regione di filamento stampo per l’accoppiamento complementare. I

substrati sono nucleotidi trifosfato (ATP, CTP, GTP e TTP). Il rilascio quasi immediato del RNA

dal DNA durante la sintesi significa che molte copie di RNA possono essere prodotte da un singolo

gene. TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI

Per trascrivere correttamente un gene, l’RNA polimerasi deve riconoscere dove iniziare questo

processo. Nei batteri, un fattore sigma si lega al promotore, sequenza speciale di nucleotidi che

indica il punto di partenza per la trascrizione, del DNA e attiva la RNA polimerasi, che inizia a

trascrivere il DNA in mRNA.

Per terminare la sintesi, si deve avere invece un terminatore, con basi di A e T, che ripiegano

l’RNA a forcina, che forza l’apertura della RNA polimerasi. 16

TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI

Nell’uomo esistono tre tipi di RNA polimerasi.

RNA polimerasi I = trascrive i geni per gli rRNA

RNA polimerasi II = trascrive tutti gli mRNA e alcuni dei piccoli RNA nucleari che partecipano

allo splicing del mRNA.

RNA polimerasi III = trascrive gli rRNA 55 e diversi RNA relativamente corti e stabili.

Le RNA polimerasi eucariotiche richiedono dei fattori generali di trascrizione, che devono

assemblarsi al promotore con la polimerasi prima dell’inizio della trascrizione.

Per l’uomo, il promotore, è costituito da una sequenza consenso di A e T, chiamata TATA Box ed è

a 25 nucleotidi dall’inizio della trascrizione. Quando la RNA polimerasi deve riconoscere la TATA

box, vede l’associazione dei fattori di trascrizione e si chiude sul DNA:

1- TFIID si lega alla TATA box, tramite la subunità TBP (TATA binding protein) del DNA a

doppia elica.

2- Successivamente di attaccano TFIIA e TFIIB, poi TFIIE e RFIIH, formando il complesso di

inizio della trascrizione, insieme alla RNA polimerasi.

3- TFIIH fosforila la coda CTD (C Terminal Domain) della RNA polimerasi. I fattori di

trascrizione si staccano e la trascrizione ha inizio. 17

MATURAZIONE DEL RNA CON I PROCESSING

La trascrizione è solo il primo passaggio di una serie di reazioni che comprende la modificazione

covalente di entrambe le estremità dell’RNA e la rimozione delle sequenze introniche, tramite

splicing.

Le modificazioni alle estremità sono il capping al 5’ e la poliadenilazione al 3’

Inoltre negli eucarioti, la traduzione non è associata alla trascrizione, e viene svolta all’esterno del

nucleo.

Quando si è parlato della CTD, essa ha una serie di fattori che permettono ai processing (capping,

poliadenilazione) di avvenire. 18

CAPPUCCIO AL 5’

Non appena la polimerasi ha prodotto circa 25 nucleotidi, l’estremità 5’ è modifciata per l’aggiunta

di un cappuccio costituito da un nucleotide guanidilico modificato:

- fosfatasi = rimuove il fosfato dall’estremità 5’ dell’RNA.

- guanil trasferasi = aggiunge un GMP in legame inverso (5’ a 5’ invece di 5’ a 3’)

- metil trasferasi = aggiunge un metile alla guanosina.

Il cappuccio riconosce le posizioni 5’ e protegge il trascritto primario dalla degradazione enzimatica

svolta dalle nucleasi. CODA AL 3’

Mediante la poliadenilpolimerasi (poli-A polimerasi o PAP), si ha un’aggiunta di molte adenine

all’estremità terminale dell’RNA immaturo.

La coda serve ad:

- Identificare la vecchiaia dell’RNA, poichè mano a mano che il tempo passa, le nucleasi tendono a

- degradare la molecola togliendo le adenine. Gli mRNA più vecchi avranno quindi meno adenine

rispetto ai nuovi.

- Aiuta l’esportazione del mRNA dal nucleo al citosol

- Stabilizza l’mRNA

- Ruolo di sintesi proteica 19

Due proteine note come CstF ( Cutting stimolation factor F) e CPSF (Cutting of Poliadenylation

specificity Factor) viaggiano con la coda dell’RNA polimerasi e sono traferite alla sequenza di

modificazione dell’estremità 3’. Una volta che si solo legate all’RNA, si inseriscono altri fattori, e

infine la poli-A polimerasi che aggiunge uno alla volta circa 200 nucleotidi A all’estremità 3’. La

poli-A polimerasi non richiede uno stampo e quindi la coda non è codificata direttamente nel

genoma. Alla coda si attaccano le proteine che legano poli-A e determinano la lunghezza finale

della coda. Queste rimangono attaccate alla coda mentre il mRNa attraversa il nucleo. 20

SPLICING

I geni eucariotici sono spezzati in piccoli pezzi di sequenze codificanti (sequenze espresse o esoni)

intervallati da sequenze intercalate o introni; così la porzione codificante di un gene eucariotico è

spesso soltanto una piccola frazione della lunghezza del gene.

Sia gli introni che gli esoni sono trascritti in RNA. Le sequenze introniche sono rimosse dall’RNA

appena sintetizzato dal processo di splicing dell’RNA.

Ciascun evento di splicing rimuove un introne, procedendo attraverso due reazioni sequenziali di

trasferimento di fosfato, note come transesterificazioni; queste uniscono due esoni rimuovendo un

introne come cappio.

Per tagliare le sequenze introniche, si sono sequenziati gli introni, soprattutto nelle zone di unione

tra esoni ed introni e si è visto che al 5’ degli introni (nel sito DONATORE) tutti cominciano con

una seguenza GU e nel sito ACCETTORE (3’) gli introni finiscono con una sequenza AG.

Negli introni piccoli o grandi, tutto quello che era più importante sono quelle sequenze di inizio e di

fine e inoltre era importante una sequenza a circa 30 nucleotidi dal sito accettore chiamata sequenza

BRENCH POINT A (solo l’adenina è ambigua nel brench point) e intorno vi sono dei nucleotidi

con varia ambiguità.

Mutando le sequenze GU e AG (iniziale e finale) si vedeva che lo splicing non avveniva e quindi

erano fondamentali. 21

LO SPLICEOSOMA

Lo splicing dell’RNA è eseguito in gran parte da molecole di RNA e non da proteine. Le molecole

di RNA riconoscono i confini introne-esone e partecipano alla chimica dello splicing. Queste

molecole di RNA sono relativamente brevi e nella forma principale di splicing dei pre-mRNA ne

sono coinvolte 5 (U1, U2, U4, U5 e U6). Questi, noti come snRNA (small nuclear RNA) sono

associati a sette subunità proteiche per formare snRNP (small nuclear ribonucleic protein). Queste

snRNP formano il nucleo dello spliceosoma, che esegue lo splicing.

Lo spliceosoma riconosce i segnali di splicing su una molecola di pre-mRNA, avvicina le due

estremità dell’introne e fornisce l’attività enzimatica per i due passaggi di reazione. Il sito del punto

di ramificazione viene prima riconosciuto dalla BBP (proteina che lega il punto di ramificazione).

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L’snRNP U2 sposta BBP e U2AF e forma coppie di basi consenso del sito del punto di

ramificazione e l’snRNP U1 forma coppie di basi con la giunzione di splicing 5’. La tripla snRNP

U4-U6-U5 entra nello spliceosoma. U4 eU6 sono tenuti assieme da interazioni di coppie di basi e

l’snRNP U5 è associata più debolmente. U4 e U6 successivamente si dividono e permettono a U6 di

spostare U1 alla giunzione di splicing 5’. Successivamente si crea un sito attivo e posizionano le

porzioni appropriate dell’RNA substrato per far avvenire la reazione di splicing.

DAL mRNA ALLE PROTEINE

La conversione dell’informazione da RNA in proteine rappresenta una traduzione dell’informazione

in un altro linguaggio che usa simboli completamente diversi. Inoltre, poichè ci sono solo quattro

nucleotidi diversi nel mRNA e venti tipi diversi di amminoacidi, questa traduzione non può essere

spiegata da una corrispondenza diretta uno a uno fra un nucleotide e un amminoacido. La sequenza

nucleotidica di un gene, per mezzo del mRNA, è tradotta nella sequenza degli amminoacidi di una

proteina seguendo regole che sono note come codice genetico.

CODICE GENETICO

Il codice genetico venne decifrato da Niremberg e Matthaei 10 anni dopo Watson e Crick. Sono

partiti da una sintesi di mRNAconosciuti (formati da nucleotidi che contenevano solo Uracile, in

vitro). Fecero la sintesi proteica e analizzarono il peptide ottenuto e videro che era un

polifenilanalina. Successivamente presero un mRNa formato da due nucleotidi contenenti Citosina e

Adenina, intervallati tra loro. Il peptide ottenuto risultò essere un polistindin-Treonina. Le sequenze

allora dovevano per forza essere lette a triplette, poichè se fossero state lette a coppie, sarebbe

risultata una poliistidina.

Il codice genetico è degenerato perchè più triplette codificano uno stesso amminoacido. Ci sono 61

codon che codificano i 20 amminoacidi e 3 codon di stop. (UAA, UAG, UGA). Ciò mette al riparo

dall’effetto causato dalle mutazioni puntiformi in uno o più nucleotidi. Se non fosse degenerato ci

sarebbero 20 codon consenso e 44 codon nonsenso. L’inizio di ogni traduzione avviene con la

sequenza AUG, che codifica la metionina.

Inoltre, il codice genetico è universale. Per dimostrarlo si prese un mRNA procariotico e lo si mise

in vitro, nell’apparato di sintesi di un eucariote e questo ha sintetizzato le informazioni ivi

contenute. 23

tRNA

La traduzione di mRNA in proteine dipende da molecole adattatrici che possono riconoscere e

legare sia il codone che l’amminoacido in un altro sito. Questi adattatori sono piccoli RNA chiamati

transfer-RNA (tRNA).

La forma finale è quella di un trifoglio che subisce ripiegamenti sino a diventare una L. Ad un

estremità c’è l’anticodone, che si associa per complementarietà al mRNA e, dall’altra, al 3’ della

molecola, l’amminoacido corrispondente alla sequenza dell’anticodone. Esistono perciò tRNA per

ogni amminoacidi. LEGAME TRA L’AMMINOACIDO E IL tRNA

Il riconoscimento e l’attacco dell’amminoacido corretto dipendono dall’amminoaciltRNA sintetasi,

che accoppia covalentemente ciascun amminoacido al proprio tRNA. Mediante idrolisi di ATP

l’amminoacido viene prima adenilato, dopodichè si lega al tRNA e rilascia una molecola di AMP.

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RIBOSOMI

La sintesi proteica viene eseguita sul ribosoma, una complessa macchina catalitica composta da più

di 50 proteine diverse, le proteine ribosomali, e da RNA ribosomali (rRNA). I ribosomi sono

costituiti da due subunità, una maggiore e una minore che si adattano assieme al mRNA. La

subunità minore fornisce una struttura sulla quale i tRNA possono essere adattati accuratamente ai

codoni del mRNA, mentre la subunità maggiore catalizza la formazione dei legami peptidici che

uniscono insieme gli amminoacidi in una catena polipeptidica.

I ribosomi procarioti sono formati da rRNA e proteine; il ribosoma si chiama 70S (S sta per

coefficiente di sedimentazione) che si divide in due subunità:

- 50S formato da rRNA 23S e 5S più 34 proteine

- 30S formato da un unico rRNA 16S che è compensato da 21 proteine.

I ribosomi eucarioti si chiamano 80S ed è diviso in due subunità:

- 60S dove coesistono 3 rRNA da 5,8S, 28S e 5S più 49 proteine

- 40 S formato da una molecola di rRNA 18S e 33 proteine.

Quando non svolgono la sintesi proteica, le subunità dei ribosomi sono dissociate e libere nel

citoplasma.

Un ribosoma contiene quattro siti di legame per molecole di RNA: uno è per il mRNA e tre (sito A,

sito P e sito E) sono per il tRNA. Una molecola è tenuta con forza nei siti A e P soltanto se

l’anticodone forma coppie di basi con un codone complementare.

I ribosomi, quando si attaccano al mRNA lasciano uno spazio iniziale (start) e uno finale,

terminando prima dell’estremità (stop). Tali regioni sono chiamate regioni non tradotte (UTR) una

al 3’ e una al 5’, con differenti lunghezze.

- nei procarioti vi è una sequenza chiamata Shine-Dalgarno, che è la sequenza segnale di 67

nucleotidi ricchi di G e A, e, si è visto che in quel punto si attacca il ribosoma per iniziare la

traduzione.

- negli eucarioti è sufficiente il cappuccio del mRNA per far iniziare la sintesi proteica, a cui si

associano anche i fattori di inizio eucariotici, eIF4E che si lega al cappuccio e eIF4G. 25