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SCHEMA RIASSUNTIVO DELLA REPLICAZIONE DEL DNA
17/10/05
BOLLA DI REPLICAZIONE
Le posizioni in cui l'elica di DNA viene aperta per la prima volta sono le origini di replicazione. Nelle loro vicinanze si forma una bolla di replicazione, dove si legano le proteine iniziatrici. Le origini di replicazione studiate nei batteri hanno dimostrato di avere zone contenenti Adenina e Timina, più facili da staccare perché ci sono meno legami a idrogeno.
Per il DNA eucariotico è necessaria almeno una replicazione per ogni cromosoma. Esistono quindi delle forcelle di replicazione per ogni cromosoma (10000-20000 origini di replicazione per ogni cromosoma).
10DNA TOPOISOMERASI
Oltre alle DNA polimerasi ci sono le Topoisomerasi. Esse legano il DNA è svolgono gli aggrovigliamenti del DNA. Può essere vista come una nucleasi reversibile che si attacca all'ossatura di fosfato di DNA, rompendo un legame fosfodiestere in un filamento.
La Topoisomerasi I produce una
rottura su un singolo filamento, permettendo alle due sezioni dell'elica di ruotare attorno al legame fosfodiestere. La Topoisomerasi II forma un legame covalente con entrambi i filamenti. Questa è attivata da siti sui cromosomi quando le due doppie eliche si incrociano:
- Rompe reversibilmente la doppia elica per creare un passaggio di DNA
- Fa passare la seconda doppia elica vicina attraverso la rottura
- Risalda la rottura e si dissocia dal DNA.
TELOMERASI
Poiché le DNA polimerasi polimerizzano DNA solo nella direzione 5'-3', la sintesi del filamento ritardato a livello di una forcella deve avvenire discontinuamente, tramite un meccanismo di cucitura all'indietro che produce brevi filamenti di DNA. Quando la forcella raggiunge l'estremità di un cromosoma lineare, non c'è posto per produrre l'RNA primer necessario per iniziare l'ultimo frammento di Okazaki sulla punta della molecola. Gli eucarioti hanno sequenze
nucleotidichespeciali alle estremità dei loro cromosomi, che sono incorporate in telomeri e attraggono un enzimachiamato telomerasi. Le sequenze di DNA telomerico sono molte ripetizioni in tandem di una brevesequenza GGGTTA e si estende per 10000 nucleotidi. La telomerasi sintetizza una nuova copiadella ripetizione, usando uno stampo di RNA che è componente dello stesso enzima, mentre laDNA polimerasi sintetizza il filamento complementare.
Il meccanismo descritto assicura che l'estremità 3' del DNA sia più lunga della 5' con la quale èappaiata, lasciando un'estremità sporgente, che forma un'ansa all'indietro, per infilare il suoterminale nel doppio DNA della sequenza telomerica ripetuta. Questa assicura la protezione daglienzimi di degradazione.
RIPARAZIONE DEL DNA
Insieme di meccanismi che permettono alle cellule di mantenere il DNA nella sua corretta struttura.Intervengono degli enzimi di riparazione. Solo 1
Su 10000 nucleotidi può essere sbagliato e la frequenza di mutazione è molto rara: 1 su 10 nucleotidi. Il DNA subisce cambiamenti importanti in seguito a fluttuazioni termiche, per esempio 5000 basi puriniche (A e G) vengono perse ogni giorno perché vanno incontro a depurinazione spontanea, cioè i legami N-glicosilici si idrolizzano. 100 basi di C e U vanno invece incontro a deamminazione spontanea. Le radiazioni ultraviolette del sole possono produrre un legame covalente fra due pirimidine adiacenti nel DNA a formare, per esempio, dimeri di timina. Se questi cambiamenti non venissero corretti, ci sarebbe la delezione di una o più basi, o una loro sostituzione. Le lesioni a cui può andare incontro il DNA sono:
- Delezione della base
- Alterazione della base = quando c'è una base scorretta
- Inserzione di un nucleotide
- Legami fra pirimidine
- Tagli ai singoli o doppi legami
- Deamminazioni = i gruppi amminici vengono sostituiti o rimossi
ligasi . 18/10/05
STRUTTURA E SEQUENZIAMENTO DEL DNA
Il genoma è l'insieme delle informazioni genetiche contenute nel DNA. Solo il 2-5% del DNA è costituito da geni (esoni) che codificano le proteine. Ci sono poi altre sequenze ripetute o uniche che non hanno nessuna informazione genetica.
Il gene è l'unità fondamentale che si occupa di portare le informazioni per formare la proteine o tipi di RNA.
Il gene contiene una sequenza regolatrice, indispensabile per il corretto funzionamento del gene, responsabile dell'espressione di un gene al livello e al momento appropriato e nel tipi appropriato di cellula. Questa può trovarsi davanti o dietro o in mezzo al gene. Ci sono poi zone di DNA non codificante che interrompono i tratti di DNA codificante (esoni) e sono gli introni.
GENOMA UMANO 3000 Mb
- Geni e sequenze associate 900 Mb
- Non codificante 810 Mb
- Introni
- Regioni di controllo
- Pseudogeni
- Codificante (esoni) 90 Mb
- DNA extragenico 2100
Mb- DNA unico e a basso numero di copie 1680 Mb- DNA ripetitivo 420 Mb- In tandem- Microsatelliti- Minisatelliti- Satelliti- Disperso- SINE- LINE- Retroposomi
Pseudogeni: Sono sequenze che assomigliano a dei geni, ma che non hanno valore genico. Sono originati spesso dalla duplicazione genica. Sono importanti per l'evoluzione genica. Sono i più bersagliati dalle mutazioni e non danno alcun effetto e, più vengono mutati, più la loro identità si allontana a quella dei geni.
Il DNA ripetitivo è costituito da sequenze che danno una certa plasticità al genoma stesso. Le sequenze ripetute disperse si distinguono solo dalla sequenza nucleotidica:
- Satelliti: nel DNA centromerico. (da 5 a 200 nucleotidi)
- Minisatelliti: (DNA telomerico,) fino a 5 nucleotidi
- Microsatelliti: Fino a 4 nucleotidi.
Famiglia di geni = Insieme di geni duplicati che codificano proteine con sequenze amminoacidiche simili ma non uguali.
DUPLICAZIONE GENICA E RICOMBINAZIONE
GENICAL’organizzazione del genoma eucariotico in esoni e introni, rende molto più semplice l’evoluzionedi nuove proteine, in seguito a ricombinazione genica. La complessità delle specie non dipende dalnumero di geni ma da come sono controllati. RNAIl DNA nei genomi non dirige la sintesi di proteine da solo, ma usa invece RNA come molecolaintermedia. Quando la cellula ha bisogno di una particolare proteina, la sequenza nucleotidicacodificante quella proteina viene prima copiata in RNA (Trascrizione) e successivamente l’RNAviene usato come stampo per la sintesi delle proteine (Traduzione).Il primo passaggio della lettura di una parte necessaria delle istruzioni genetiche di una cellula, èquello di copiare una porzione particolare della sequenza del suo DNA – un gene – in una sequenzadi RNA.L’RNA è simile al DNA, a parte l’avere un ribosio al posto del deossiribosio e un Uracile al postodella Timina.La sintesi avvienesempre nella direzione 5’-3’. 15Si hanno tre tipi di RNA:
- mRNA: comprende le informazioni per specificare le proteine. Trasporta le informazionigenetiche copiate dal DNA (sono instabili e durano pochi secondi nei procarioti e qualche ora neglieucarioti, poiché non ha molte strutture secondarie che lo preservano dalla distruzione).
- rRNA: Si unisce ad una serie di proteine per formare i ribosomi.
- tRNA: Molecola principale che serve per decifrare le informazioni del mRNA; inoltre serve oerfar avvenire la sintesi delle proteine.
Gli enzimi che eseguono la trascrizione sono le RNA polimerasi. Catalizza la formazione di legami fosfodiestere che uniscono nucleotidi per formare una catenalineare. L’RNA polimerasi si muove un passo alla volta lungo il DNA, svolgendo l’elica davanti alsuo sito attivo per esporre una regione di filamento stampo per l’accoppiamento complementare. Isubstrati sono nucleotidi trifosfato (ATP, CTP, GTP e TTP). Il rilascio
quasi immediato del RNA dal DNA durante la sintesi significa che molte copie di RNA possono essere prodotte da un singolo gene. TRASCRIZIONE NEI PROCARIOTI Per trascrivere correttamente un gene, l'RNA polimerasi deve riconoscere dove iniziare questo processo. Nei batteri, un fattore sigma si lega al promotore, sequenza speciale di nucleotidi che indica il punto di partenza per la trascrizione, del DNA e attiva la RNA polimerasi, che inizia a trascrivere il DNA in mRNA. Per terminare la sintesi, si deve avere invece un terminatore, con basi di A e T, che ripiega l'RNA a forcina, che forza l'apertura della RNA polimerasi. TRASCRIZIONE NEGLI EUCARIOTI Nell'uomo esistono tre tipi di RNA polimerasi. - RNA polimerasi I = trascrive i geni per gli rRNA - RNA polimerasi II = trascrive tutti gli mRNA e alcuni dei piccoli RNA nucleari che partecipano allo splicing del mRNA. - RNA polimerasi III = trascrive gli rRNA 5S e diversi RNA relativamente corti e stabili. Le RNA polimerasiLe cellule eucariotiche richiedono dei fattori generali di trascrizione, che devono assemblarsi al promotore con la polimerasi prima dell'inizio della trascrizione. Per l'uomo, il promotore è costituito da una sequenza consenso di A e T, chiamata TATA Box ed è a 25 nucleotidi dall'inizio della trascrizione. Quando la RNA polimerasi deve riconoscere la TATA box, vede l'associazione dei fattori di trascrizione e si chiude sul DNA:
- TFIID si lega alla TATA box, tramite la subunità TBP (TATA binding protein) del DNA adoppia elica.
- Successivamente si attaccano TFIIA e TFIIB, poi TFIIE e RFIIH, formando il complesso di inizio della trascrizione, insieme alla RNA polimerasi.
- TFIIH fosforila la coda CTD (C Terminal Domain) della RNA polimerasi. I fattori di trascrizione si staccano e la trascrizione ha inizio.
MATURAZIONE DEL RNA CON I PROCESSING
La trascrizio